Кристал білка, зшитого багатофункціональним зшивальним агентом (варіанти), пристрій, що містить кристал білка та спосіб отримання аспартаму

1. Кристалл белка, сшитого многофункциональным сшивающим агентом, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что он обладает устойчивостью к экзогенному протеолизу, такой, что указанный белковый кристалл сохраняет по меньшей мере 9 1 % его исходной активности после инкубирования в течение по меньшей мере трех часов в присутствии проназы (Pronase™) в концентрации, вызывающей у растворимой формы белка, кристаллизующейся с образованием этого белкового кристалла, который сшивается, потерю по меньшей мере 94% его исходной активности в тех же условиях. 2. Кристалл по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве белка использован фермент. 3. Кристалл по п. 2, о т л и ч а ю • щ и й с я тем, что в качестве фермента использована гидролаза. 4. Кристалл по п. 3, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что е качестве гидролазы использован термолизин. 5. Кристалл по п. 3, о т л и ч а ю • щ и й с я тем, что в качестве гидролазы использована уреаза. 6. Кристалл по п. 3, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве гидролазы использована аспарагиназа. 7. Кристалл по п. 3, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве гидролазы использован лизоцим, 8. Кристалл по п. 3, о т л и ч а ю ' щ и й с я тем, что в качестве гидролазы использована эстераза. 9. Кристалл по п. 3, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве гидролазы использована эластаза. 10. Кристалл по п. 3, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве гидролазы использована липаза. 11. Кристалл по п. 1 или ^ о т л и ч а ю щ и й с я тем, что молярное соотношение белок : Pronase™ составляет 1:40. \2. Кристалл по пп. 1 или 2, о т л ич а ю щ и й с я тем, что он имеет 1 поперечное сечение размером около 10* мм или менее. 13. Кристалл по п. 4, о т л и ч а ющ и й с я тем, что является кристаллическим сшитым термолизином, обладающим такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что кристаллический сшитый термолизин сохраняет 98% его исходной активности после инкубирования в течение по меньшей мере одного часа в присутствии такой концентрации Pronase™, которая вызывает у растворимой несшитой формы термолизина, из которой образован кристаллический сшитый термолизин, потерю по меньшей мере 97% ее исходной активности в тех же условиях. 14. Кристалл по п. 6, о т л и ч а ющ и й с я тем, что является кристаллической сшитой аспарагиназой, обладающей такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что кристаллическая сшитая (21) (22) (24) (31) (Г2) (33) (86) (46) (56) О Ы О 27035 аспарагиназа сохраняет по меньшей мере 9 1 % ее исходной активности после инкубирования в течение по меньшей мере трех часов в присутствии такой концентрации Pronase™, которая вызывает у растворимой несшитой формы аспарагиназы, из которой образована кристаллическая сшитая аспарагиназа, потерю по меньшей мере 94% ее исходной активности в тех же условиях. 15. Кристалл по п. 7, о т л ? и ч а ющ и й с я тем, что является кристаллическим сшитым лизоцимом, обладающим такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что кристаллический сшитый лизоцим сохраняет по меньшей мере 9 1 % его исходной активности после инкубирования в течение по меньшей мере трех часов в присутствии такой концентрации Pronase™, которая вызывает у растворимой несшитой формы лизоцима, из которой образован кристаллический сшитый лизоцим, потерю по меньшей мере 94% ее исходной активности в тех же условиях. 16. Кристалл по п. 8, о т л и ч а гащ и й с я тем, что является кристаллической сшитой эстеразой, обладающей такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что кристаллическая сшитая эстераза сохраняет по меньшей мере 9 1 % ее исходной активности после инкубирования в течение по меньшей мере трех часов в присутствии такой концентрации Pronase™, которая вызывает у растворимой несшитой формы эстеразы, из которой образована кристаллическая сшитая эстераза, потерю по меньшей мере 94% ее исходной активности в тех же условиях. 17. Кристалл по п. 9, о т л и ч а гащ и й с я тем, что является кристаллической сшитой эластазой, обладающей такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что кристаллическая сшитая эластаза сохраняет 100% ее исходной активности после инкубирования в течение по меньшей мере трех часов в присутствии такой концентрации Pronase™, которая вызывает у растворимой несшитой формы эластазы, из которой образована кристаллическая сшитая эластаза, потерю по меньшей мере 98% ее исходной активности в тех же условиях. 18 Кристалл по п. 1Q, о т л и ч а ющ и й с я тем, что является кристаллической сшитой липазой, обладающей такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что христаллическая сшитая липаза сохраняет ло меньшей мере 9 1 % ее исходной активности после инкубирования в течение по меньшей мере трех часов в присутствии такой концентрации Pronase™, которая вызывает у растворимой несшитой формы липазы, из которой образована кристаллическая сшитая липаза, потерю по меньшей мере 94% ее исходной активности в тех же условиях. 19 Кристалл по п. 2, о т л и ч а гащ и й с я тем, что является кристаллическим сшитым ферментом, обладающим по меньшей мере 50% каталитической активности растворимой несшитой формы этого фермента, которую сшивают и кристаллизуют для получения указанного кристаллического сшитого фермента. 20. Кристалл по п 19, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве указанного фермента использован фермент термолизин, аспарагиназа, лизоцим, уреаза, эстераза или липаза. 21. Кристалл белка, сшитого многофункциональным сшивающим агентом, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что указанный кристалл сшитого белка обладает большим полупериодом активности, чем растворимая несшитая форма белка, из которой образован указанный кристалл, после инкубирования в 50% смеси органического растворителя с водой в течение по меньшей мере одного часа. 22. Кристалл по п. 21, о т л и ч а гащ и й с я тем, что в качестве белка использован фермент. 23. Кристалл по п. 22, о т л и ч а гащ и и с я тем, что в качестве фермента использована гидролаза, выбранная из группы, состоящей из термолизина, аспарагиназы, лизоцима, уреазы, эластазы, эстеразы и липазы. 24 Кристалл белка, сшитого многофункциональным сшивающим агентом, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что указанный кристалл сшитого белка обладает такой стабильностью в 50% смеси органического растворителя с водой, что сохраняет по меньшей мере 40% его исходной активности после инкубирования в указанном растворителе в течение по меньшей мере одного часа. 25 Кристалл по п. 24, о т л и ч а гащ и й с я тем, что в качестве белка использован фермент. 26. Кристалл по п. 25, о т л и ч а гащ и й с я тем, что в качестве фермента использована гидролаза, выбранная из группы, состоящей из термолизина, аспарагиназы, лизоцима, уреазы, эластазы, эстеразы и липазы. 27. Кристалл белка, сшитого многофункциональным сшивающим агентом, 27035 о т л и ч а ю щ и й с я тем, что указанный кристалл сшитого белка обладает улучшенным рН-профилем активности по сравнению с растворимой несшитой формой белка, из которой образован указанный кристалл. 28. Кристалл по п. 27, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что он обладает большей стабильностью при щелочном рН, чем растворимая несшитая форма белка, из которой образован указанный кристалл. 29. Кристалл по п. 27 или 28, о т л и ч а ю щ и й с я том, что в качестве белка использован фермент, выбранный из группы, состоящей из термолизина, аспарагиназы, лизоцима, уреазы, эластазы, эстеразы и липазы. 30. Кристалл белка, сшитого многофункциональным сшивающим агентом, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что указанный кристалл сшитого белка обладает большей стабильностью при высокой температуре по сравнению с растворимой несшитой формой белка, из которой образован указанный кристалл. 31. Кристалл по п, 30, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве белка использован фермент. 32. Кристалл по п. 31, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве фермента использована гидролаза, выбранная из группы, состоящей из термолизина, аспарагиназы, лизоцима, уреазы, эластазы, эстеразы и липазы. 33. Кристалл по п. 30, о т л и ч а ющ и й с я тем, что указанная высокая температура составляет по меньшей мере 55°С. 34. Кристалл по п. 30, о т л и ч а ющ и й с я тем, что указанная высокая температура составляет по меньшей мере 65°С. 35. Устройство, содержащее кристалл белка, сшитого многофункциональным сшивающим агентом, о т л и ч а ю щ е е с я тем, что содержит кристалл сшитого фермента по пп.2 или 3 и средство для удержания указанного кристалла сшитого фермента, причем удерживающее средство состоит из материала, который допускает контакт между указанным кристал лом сшитого фермента с жидкостью, содержащей субстрат, на который действует фермент. 36. Устройство по п. 35, о т л и ч аю щ е е с я тем, что в случае его использования в качестве биосенсора для детектирования интересующего аналита в жидкости, указанный фермент обладает действием на интересующий аналит или реагент в реакции, в которой принимает участие интересующий аналит, а указанный субстрат является интересующим аналитом или реагентом в реакции, в которой принимает участие интересующий аналит. 37. Устройство по п. 35, о т л и ч аю щ е е с я тем, что оно дополнительно содержит средство для определения активности действия указанного фермента на данный аналит или реагент. 38. Устройство по п. 35, о т л и ч аю щ е е с я тем, что оно содержит кристалл сшитой люциферазы. 39. Устройство по п. 35, о т л и ч а ю щ е е с я тем, что в случае его использования в качестве экстракорпорального устройства для изменения компонента жидкости, указанный субстрат является этим компонентом или реагентом в реакции, в которой участвует данный компонент. 40. Способ получения аспартама, предусматривающий стадии объединения двух соединений, из которых первое имеет формулу Z-(L-Asp), где Z - бензилоксикарбонильная группа, а второе соединение имеет формулу (L-Phe)-OMe с термолизином в иммобилизованной форме, поддержания полученной комбинации в условиях, подходящих для конденсации этих двух соединений под действием указанного термолизина, с образованием частично защищенного соединения формулы Z-(LAsp)-(L-Phe)-OMe, и удаления бензилоксикарбонильной группы у образовавшегося частично защищенного соединения с получением при этом аспартама, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве термолизина в иммобилизованной форме используют кристалл сшитого термолизина по п.4. 27035 Изобретение касается иммобилизации ферментов, а также использования иммобилизованных ферментов. В частности, изобретение касается белковых кристаллов, сшитых многофункциональным сши- 5 вающим агентом, а также устройства, содержащего этот кристалл, и способа получения аспартама, использующего сшитый белковый кристалл. Наиболее близким по технической 10 сущности и достигаемому результату к объекту "кристалл белка" является техническое решение, описанное в Европейском патенте ЕР № А 0341503, опублик. 1989, и относящееся к кристаллу белка, 15 сшитого многофункциональным сшивающим агентом. Недостатком известного решения является недостаточно вьюокая устойчивость известного продукта. 20 В основу настоящего изобретения поставлена задача создания кристалла белка, который обладал бы повышенной устойчивостью. Поставленная задача достигается тем, 25 что кристалл белка, сшитого многофункциональным сшивающим агентом, согласно изобретению, обладает устойчивостью к экзогенному протеолизу, такой, что указанный белковый кристалл сохраняет по .30 меньшей мере 9 1 % его исходной активности после инкубирования в течение по меньшей мере трех часов в присутствии проназы (Pronase™) в концентрации, вызывающей у растворимой формы белка, 35 кристаллизующейся с образованием этого белкового кристалла, который сшивается, потерю по меньшей мере 94% его исходной активности в тех же условиях. 40 Кроме того, в качестве белка использован фермент. Кроме того, в качестве фермента использована гидролаза. Кроме того, в качестве гидролазы ис- 45 пользован те,рмолизин. Кроме того, в качестве гидролазы использована уреаза. Кроме того, в качестве гидролазы использована аспарагиназа. 50 Кроме того, в качестве гидролазы использован лизоцим. Кроме того, в качестве гидролазы использована эстераза. Кроме того, в качестве гидролазы ис- 55 пользована эластаза. Кроме того, в качестве гидролазы использована липаза. Кроме того, молярное соотношение блок: Pronase™ составляет 1:40. 8 Кроме того, кристалл имеет поперечное сечение размером около 10 й мм или менее. Кроме того, кристалл является кристаллическим сшитым термолизином, обладающим такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что кристаллический сшитый термолизин сохраняет 98% его исходной активности после инкубирования в течение по меньшей мере одного часа в присутствии такой концентрации Pronase™, которая вызывает у растворимой несшитой формы термолизина, из которой образован кристаллический сшитый термолизин, потерю по меньшей мере 97% ее исходной активности в тех же условиях. Кроме того, кристалл является кристаллической сшитой аспарагиназой, обладающей такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что кристаллическая сшитая аспарагиназа сохраняет по меньшей мере 9 1 % ее исходной активности после инкубирования в течение по меньшей мере трех часов в присутствии такой концентрации Pronase™, которая вызывает у растворимой несшитой формы аспарагиназы, из которой образована кристаллическая сшитая аспарагиназа, потерю по меньшей мере 94% ее исходной активности в тех же условиях. Кроме того, кристалл является кристаллическим сшитым лизоцимом, обладающим такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что кристаллический сшитый лизоцим сохраняет по меньшей мере 9 1 % его исходной активности после инкубирования в течение по меньшей мере трех часов в присутствии такой концентрации Pronase™, которая вызывает у растворимой несшитой формы лизоцима, из которой образован кристаллический сшитый лизоцим, потерю по меньшей мере 94% ее исходной активности в тех же условиях. Кроме того, кристалл является кристаллической сшитой эстеразой, обладающей такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что кристаллическая сшитая эстераза сохраняет по меньшей мере 9 1 % ее исходной активности после инкубирования в течение по меньшей мере трех часов в присутствии такой концентрации Pronase™, которая вызывает у растворимой несшитой формы эстеразы, из которой образована кристаллическая сшитая эстераза, потерю по меньшей мере 94% ее исходной активности в тех же условиях. Кроме того, кристалл является кристаллической сшитой эластазой, обладаю 27035 щей такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что кристаллическая сшитая эластаза сохраняет 100% ее исходной активности после инкубирования в течение по меньшей мере трех часов в присутст- 5 вии такой концентрации Pronase™, которая вызывает у растворимой несшитой формы эластазы, из которой образована кристаллическая сшитая эластаза, потерю по меньшей мере 98% ее исходной 10 активности в тех же условиях. Кроме того, кристалл является кристаллической сшитой липазой, обладающей такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что кристаллическая сшитая 15 липаза сохраняет по меньшей мере, 9 1 % ее исходной активности после инкубирования в течение по меньшей мере трех часов в присутствии такой концентрации Pronase™, которая вызывает у раствори- 20 мой несшитой формы липазы, из которой образована кристаллическая сшитая липаза, потерю по меньшей мере 94% ее исходной активности в тех же условиях. Кроме того, кристалл является крис- 25 таллическим сшитым ферментом, обладающим по меньшей мере 50% каталитической активности растворимой несшитой формы этого фермента, которую сшивают и кристаллизуют для получения указанно- 30 го кристаллического сшитого фермента. Кроме того, в качестве указанного фермента использован фермент термолизин, аспарагиназа, лизоцим, уреаза, эстераза или липаза. 35 Кроме того, вариантом кристалла белка, сшитого многофункциональным сшивающим агентом, является кристалл сшитого белка, который обладает большим полупериодом активности, чем раствори- 40 мая несшитая форма белка, из которой образован указанный кристалл, после инкубирования в 50% смеси органического растворителя с водой в течение по меньшей мере одного часа. 45 Кроме того, в качестве белка использован фермент. Кроме того, в качестве фермента использована гидролаза, выбранная из группы, состоящей из термолизина, аспа- 50 рагиназы, лизоцима, уреазы, эластазы, эстеразы и липазы. Кроме того, вариантом кристалла белка, сшитого функциональным сшивающим агентом, является кристалл сшитого бел- 55 ка, который обладает такой стабильностью в 50% смеси органического растворителя с водой, что сохраняет по меньшей мере 40% его исходной активности после инкубирования в указанном растворителе 10 в течение по меньшей мере одного часа. Кроме того, в качестве белка использован фермент. Кроме того, в качестве фермента использована гидролаза, выбранная из группы, состоящей из термолизина, аспарагиназы, лизоцима, уреазы, эластазы, эстеразы и липазы. Кроме того, вариантом кристалла белка, сшитого функциональным сшивающим агентом, является кристалл сшитого белка, который обладает улучшенным рН-профилем активности по сравнению с растворимой несшитой формой белка, из которой образован указанный кристалл. Кроме того, кристалл обладает большей стабильностью при щелочном рН, чем растворимая несшитая форма белка, из которой образован указанный кристалл. Кроме того, в качестве белка использован фермент, выбранный из группы, состоящей из термолизина, аспарагиназы, лизоцима, уреазы, эластазы, эстеразы и липазы. Кроме того, вариантом кристалла белка, сшитого функциональным сшивающим агентом, является кристалл сшитого белка, который обладает большей стабильностью при высокой температуре по сравнению с растворимой несшитой формой белка, из которой образован указанный кристалл. Кроме того, в качестве белка использован фермент. Кроме того, в качестве фермента использована гидролаза, выбранная из группы, состоящей из термолизина, аспарагиназы, лизоцима, уреазы, эластазы, эстеразы и липазы. Кроме того, указанная высокая температура составляет по меньшей мере 65°С. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к объекту "устройство" является техническое решение, описанное в Патенте США № А 5010006, опублик. 1990 и содержащее кристалл белка, сшитого многофункциональным сшивающим агентом. Недостатком известного устройства является недостаточно высокая стабильность используемого в нем фермента и его функциональная целостность грубой среде растворителя при высоких температурах, характерных для промышленных и лабораторных химических процессов. В основу изобретения поставлена задача создания устройства, которое позволяло использовать его в грубых средах растворителя и при высоких температурах 11 27035 без ухудшения стабильности и функциональной целостности, находящегося в нем фермента. Поставленная задача достигается тем, что устройство, содержащее кристалл белка, сшитого мнофункциональным сшивающим агентом, согласно изобретению, содержит кристалл сшитого фермента и средство для удерживания указанного кристалла сшитого фермента, причем удерживающее средство состоит из материала, который допускает контакт между указанным кристаллом сшитого фермента с жидкостью, содержащей субстрат, на который действует фермент. Кроме того, в случае использования устройства в качестве биосенсора для детектирования интересующего аналита в жидкости, указанный фермент обладает действием на интересующий аналит или реагент в реакции, в которой принимает участие интересующий аналит, а указанный субстрат является интересующим аналитом или реагентом, в реакции, в которой принимает участие интересующий аналит. Кроме того, устройство дополнительно содержит средство для определения активности действия указанного фермента на данный аналит или реагент. Кроме того, устройство содержит кристалл сшитой люциферазы. Кроме того, в случае использования устройства в качестве экстракорпорального устройства для изменения компонента жидкости, указанный субстрат является этим компонентом или реагентом в реакции, в которой участвует данный компонент. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к объекту "способ" является способ получения аспартама, описанный в журнале "Biotechnology", 1985, 3, 459-464 и предусматривающий стадии объединения двух соединений, из которых первое имеет формулу Z-(L-Asp), где Z - бензилоксикарбонильная группа, а второе соединение имеет формулу (L-Phe)-OMe с термолизином в иммобилизованной форме, поддержания полученной комбинации в условиях, подходящих для конденсации этих двух соединений под действием указанного термолизина, с образованием частично защищенного соединения формулы Z-(L-Asp)-(L-Phe)-OMe, и удаления бензилоксикарбонильной группы у образовавшегося частично защищенного соединения с получением при этом конечного продукту - аспартама. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 12 Недостатком известного способа является то, что он не обеспечивает достаточно высокую эффективность. В основу изобретения поставлена задача разработки эффективного способа получения аспартама. Поставленная задача достигается тем, что в способе получения аспартама, предусматривающем стадии объединения двух соединений, из которых первое имеет формулу Z-(L-Asp), где Z - бензилоксикарбонильная группа, а второе соединение имеет формулу (L-Phe)-OMe с термолизином в иммобилизованной форме, поддержания полученной комбинации в условиях, подходящих для конденсации этих двух соединений под действием указанного термолизина, с образованием частично защищенного соединения формулы Z-(L-Asp)-(L-Phe)-OMe, и удаления бензилоксикарбонильной группы у образовавшегося частично защищенного соединения с получением при этом аспартама, согласно изобретению, в качестве термолизина в иммобилизованной форме используют кристалл сшитого термолизина. Настоящее изобретение касается способа иммобилизации фермента путем образования кристаллов этого фермента, и, в общем случае, также путем структурирования получаемых кристаллов с помощью бифункционального реагента; структурированных кристаллов иммобилизованного фермента (которые в описании упоминаются как CLEC или CLIEC), полученных этим способом; лиофилизации CLEC в качестве средства улучшения хранения, обращения и эксплуатации иммобилизованных ферментов, а также способа получения желаемого продукта путем реакции, катализированной с помощью CLEC или набора CLEC. В способе по настоящему изобретению, небольшие (10° мм) кристаллы белка выращивают из водных растворов, или водных растворов, содержащих органические растворители в которых ферментный катализатор является структурно и функционально стабильным. В предпочтительном выполнении, кристаллы затем структурируют посредством бифункционального реагента, такого как глютаральдегид. Это структурирование приводит к стабилизации контактов в кристаллической решетке между отдельными молекулами ферментного катализатора, составляющими этот кристалл. В результате этой дополнительной стабилизации, структурированные кристаллы иммобилизованного фермента могут работать при повышен 13 27035 ной температуре, крайних рН и в грубой водной, органической и почти безводной среде, включая их смеси. Иными словами, CLEC по настоящему изобретению может функционировать в средах, несовместимых с функциональной целостностью соответствующих некристаллизованных, неструктурированных, нативных ферментов или иммобилизованных традиционными методами ферментных катализаторов. Кроме того, CLEC, изготовленные по настоящему способу, могут быть подвергнуты лиофилизации с получением лиофилизованных CLEC, которые могут храниться в этом лиофилизованном виде при непониженных (комнатных) температурах в течение длительных периодов времени, и которые могут быть легко восстановлены в водных органических или смешанных водноорганических растворителях по выбору, без образования аморфных суспензий и с минимальным риском денатурации. Настоящее изобретение также относится к CLEC, полученным по настоящему способу, а также к их использованию в лабораторном и широкомасштабном промышленном производстве желаемых веществ, таких как хиральные органические молекулы, пептиды, углеводы, жиры или другие химические вещества. В настоящее время, эти вещества обычно получают традиционными химическими методами, которые могут требовать грубых условий (например, водных, органических или почти безводных растворителей, смешанных водноорганических растворителей или повышенных температур), которые несовместимы с функциональной целостностью некристаллизованных, неструктурированных, нативных ферментных катализаторов. В предлагаемую CLEC-технологию также могут быть введены другие макромолекулы с каталитической активностью. Эти молекулы могут рключать каталитические антитела [Lerner R. A., Benkovic S. I., Schultz P. G. Science 252: 659-667 (1991)] и каталитические полинуклеотиды [Cech T.R. Cell 64: 667-669 (1991); Celander D.W., Cech T.R. Science, 251: 401-407 (1991)]. Настоящее изобретение также относится к способу изготовления выбранного продукта посредством реакции, катализованной по настоящему изобретению. В практическом примере выполнения способа по настоящему изобретению, фермент термолизин, -цинк-металлопротеазу-5 использовали для синтезирования хирального предшественника дипептидного ис 5 10 15 20 25 30 35 40 х 45 50 55 14 кусственного подсластителя, -аспартама. Фермент термолизин кристаллизовали из исходного водного раствора, состоящего из 45% диметилсульфоксида и 55% 1,4 М ацетата кальция, 0,05 М какодилата натрия с рН 6,5. Полученные кристаллы структурировали глютаральдегидом с образованием CLEC термолизата, CLEC термолизин затем переносили из водного кристаллизационного раствора, в котором они изготавливались, в раствор этилацетата, содержащий субстраты, N-/ бензилоксикарбонил/-аспар говую кислоту /z-l-Asp/ и 1-фенилаланин метиловый эфир /1-Phe-OMe/. Термолизин затем использовали для катзлизирования реакции конденсации двух субстратов для синтезирования Ы-/бензилоксикарбонил/^-аспартил^-фенилаланин метилового эфира /N-L-Asp-L-Phe-OMe/, который является депептидным предшественником искусственного подсластителя - аспартама. С использованием одной из многих известных технологий (см. например, Lindeberg G.L, Chem. Ed. 64: 1062-1064 (1987)), 1аспартовая кислота в синтезированном дипептидном предшественнике может быть лишено защиты путем удаления бензилоксикарбонильной /Z-/rpynnbi для получения аспартама /L-Asp-L-Phe-OMe/. Во втором примере практического выполнения настоящего изобретения, фермент термолизин использовали для получения CLEC термолизина. Активность и стабильность CLEC термолизина сравнивали с этими характеристиками растворимого термолизина при оптимальных условиях, а также при условиях экстремальных рН и температуры, с последующей инкубацией в присутствии органических растворителей и последующей инкубацией в присутствии экзогенной протеазы. Фермент термолизин кристаллизовали из раствора 1,2 М ацетата кальция и 30% диметилсульфоксида, с рН 8,0. Полученные кристаллы структурировали глютаральдегидом при концентрации 12,5% с образованием CLEC термолизина, CLEC термолизин затем лиофилизировали стан-дартной процедурой [Cooper T.G. The Tools of Biochemistry. - Изд-во: Джон Уилей и Сыновья, Нью-Йорк, 1977. - С. 379-380] с образованием лиофилизованного фермента CLEC термолизина. Этот лиофилизированный CLEC трансформировали непосредственно в различных водных, органических и смешанных водноорганических растворителях по выбору, без промежуточной процедуры, замены растворитепя без образования аморфных суспен» 15 27035 зии, и с минимальным риском денатурации. Эти растворители включают ацетоиитрил, диоксан, ацетон тетрагидрофуран, но не исключая и другие. После инкубирования, активность исследовали спект- 5 рофотометрически посредством расщепления дипептидного субстрата FAGLA (фури л акри л ои л -глицил - лейцинами д). В третьем примере практического выполнения изобретения, фермент эластазу 10 (из свиной поджелудочной железы) кристаллизовали из водного раствора 5,5 мг/ мл белка в 0,1 М натрий ацетата с рН 5,0 при комнатной температуре [Сойер Л. и др. Ж, Мол Биол. - 118: С. 137-208]. 15 Полученные кристаллы структурировали глютаральдегидом с концентрацией 5% для образования CLEC эластазы. CLEC эластазу лиофилизировали как описано в примере 2. 20 В четвертом примере практического выполнения настоящего изобретения, как раскрыто здесь, фермент эстеразу (свиная печень) кристаллизовали из водного раствора 15 мг/мл белка в 0,25 М ацета- 25 та кальция с рН 5,6 при комнатной температуре. Полученные кристаллы структурировали глютаральдегидом с концентрацией 12,5% для образования CLEC эстеразы, CLEC эстеразу лиофилизировали как 30 описано в примере 2. В пятом примере раскрытого здесь практического выполнения настоящего изобретения, фермент липазу /Geotrichum candidum/ кристаллизовали из водного 35 раствора 20 мг/мл белка в 50 мМ Трис с рН 7 при комнатной температуре. Полученные кристаллы структурировали глютаральдегидом с концентрацией 12,5% с образованием CLEC липазы. CLEC липазу лио- 40 филизировали как описано в примере 2. В шестом примере практического выполнения настоящего изобретения фермент лизоцим (белок куриного яйца) кристаллизовали из водного раствора 40 мг/ 45 мл белка и 40 мМ натрийацетатного буфера, содержащего 5% натрий хлорида с рН 4,7 при комнатной температуре [Blake C.C.F и пр., Nature 196; 1173 (1962)]. Полученные кристаллы структурировали глю- 50 таральдегидом с концентрацией 20% для образования CLEC лизоцима. CLEC лизоцим лиофилизировали как описано в примере 2. В седьмом примере практического вы- 55 полнения настоящего изобретения, фермент аспарагиназу Escherichia CoH) кристаллизовали из водного раствора 25 мг/ /мл белка в 50 мМ натрийацетата и 33% этанола с рН 5,0 при 4°С, Эта кристал 16 лизация является модификацией процедуры, описанной Грабнером и др. в патенте США № 3664926 (1972). Как раскрыто здесь, полученные кристаллы структурировали глютаральдегидом концентрации 7,5% с получением CLEC аспарагиназы. CLEC аспарагиназу лиофилизировали как описано в примере 2. Другие ферменты, которые могут иммобилизироваться подобным образом и использоваться в качестве катализаторов в соответствующей реакции, включают люциферазу и уреазу. Другие ферменты, такие как перечисленные в таблицах 1-5, также могут быть кристаллизованы и структурированы с использованием настоящего способа с получением желательных CLEC, которые могут быть, в свою очередь, использованы для катализа реакции, которая приводит к получению требуемого продукта, или для катализа реакции, являющейся промежуточной стадией (то есть одной реакцией в ряде реакций) в производстве выбранного продукта. Признано, что хотя структурирование способствует стабилизированию большинства кристаллов, оно не во всех случая является необходимым или желательным. Некоторые кристаллические ферменты сохраняют свою функциональную и структурную целостность в грубых условиях окружающей среды даже при отсутствии структурирования. Хотя в предпочтительном выполнении кристалл является структурированным, структурирование не всегда необходимо для получения ферментного кристалла, используемого по настоящему способу. CLEC - ферменты имеют несколько ключевых характеристик, которые сообщают им существенные преимущества над традиционными методами иммобилизации ферментов, используемыми в настоящее время. CLEC не нуждаются в отдельной инертной подложке. Отсутствие инертной подложки улучшит диффузию субстрата и продукта внутри CLEC и обеспечит внутри кристалла концентрацию фермента, близкую к теоретическому пределу загрузки для молекул такого размера. Высокие концентрации фермента могут привести к значительной рабочей экономии благодаря повышенной эффективной активности данного объема катализатора, снижения времени контакта субстрата с ферментом и общего уменьшения размера завода и капиталовложений [Daniels M.J. Methods in Entymol. 136: 371-379 (1987)]. Равномерное распределение по объему кристалла и повышенная стабильность составляюще 17 го его фермента в CLEC создает новые возможности применения ферментных катализаторов в сложных условиях, таких как повышенная температура, водные, органические и почти безводные растворители, а также их смеси. Кроме того, ограниченный доступ растворителя и постоянное белковое окружение в кристаллической решетке должно привести к улучшенному удержанию ионов металлов и ко-факторов CLEC по сравнению с традиционными системами иммобилизованных ферментов. Фиг. 1 графически представляет результаты оценки ферментной активности растворимого термолизина и CLEC термолизина; фиг. 2 - результаты сравнения зависимостей рН CLEC термолизина и растворимого термолизина; фиг. 3 - измерения активности растворимого и кристаллического термолизина после инкубирования при 65°С; фиг. 4 - результаты оценки сопротивления растворимого и CLEC термолизина внешней протеолитической деградации; фиг. 5 - результаты оценки ферментной активности для растворимой эластазы и соответствующей CLEC эластазы; фиг, 6 - сопротивление растворимой эластазы и соответствующей CLEC эластазы внешней (экзогенной) протеолитической деградации; фиг. 7 - результаты оценки ферментной активности для растворимой эстеразы и соответствующей CLEC-эстеразы; фиг. 8 - сопротивляемость растворимой эстеразы и соответствующей CLEC-эстеразы экзогенной протеолитичесой деградации; фиг. 9 - результаты оценки ферментной ативности растворимой липазы и соответствующей CLEC-липазы; фиг. 10 - результаты оценки ферментной активности растворимого лизоцима и соответствующей CLEC-лизоцима; фиг. 11 результаты оценки ферментной активности растворимой аспарагиназы и соответст: вующей CLEC-аспарагиназы. Очень полезной была бы простая, общая процедура, обеспечивающая стабильность и функционирование конкретного фермента или их набора при условиях, представляющих интерес для химика, занимающегося синтезом, и которые чересчур грубы для использования с ферментами по известным до сих пор методам. Структурированные кристаллы иммобилизованных ферментов (упоминаемые как CLEC или CLIEC), как описано здесь, могут использоваться для этой цели. Стабилизация кристаллической решетки составляющих ее ферментных катализаторов в кристалле путем структурирующей реакции позволяет использовать CLEC в таких 27035 18 средах, как водные, органические или почти безводные растворители, смеси этих растворителей, при крайних значениях рН и повышенных температурах, которые не5 совместимы с функционированием ферментов, полученных традиционными методами. Кроме того, стабилизорование кристаллической решетки в CLEC позволяет осуществлять лиофилизацию CLEC стан10 дартными методами. Лиофилизированные CLEC могут храниться в течение коммерчески привлекательных периодов времени (от месяцев до лет) в отсутствии охлаж 15 20 25 30 35 40 45 50 55 дения, и способствуют быстрому и простому использованию CLEC в процессах лабораторного и промышленного масштаба посредством простого добавления желаемых растворителей, без необходимости промежуточных процедур замены растворителей. CLEC также обладают высокой резистентностью к их перевариванию экзогенными протеазами. Способ по настоящему изобретению облегчает применение универсальных ферментных катализаторов в основных промышленных химических процессах, а также в лабораторном синтезе новых соединений для исследований. Хотя структурирование повышает стабильность кристаллического фермента, оно не является необходимым и желательным во всех случаях. Некоторые кристаллические ферменты сохраняют свою функциональную и структурную целостность в тяжелых условиях даже при отсутствии структурирования. Предпочтительное выполнение настоящего изобретения предусматривает структурирование кристаллического фермента и подробно описано в нижеследующих разделах. Однако, следует понимать, что кристаллические ферменты, не структурированные в дальнейшем, также могут использоваться в некоторых выполнениях настоящего изобретения. Регулярные взаимодействия между составляющими ферментными молекулами в кристаллической решетке CLEC приводят к хорошо определенным порам ограниченного размера, ведущим к фер- . ментным молекулам внутри CLEC. В результате, субстраты большего размера, чем размер пор, не смогут проникнуть в тело CLEC-частицы. Как следствие ограниченного размера пор, многие ферментативные реакции, представляющие коммерческий и научный интерес, включающие субстраты больше размера пор CLEC, будут находиться вне объема настоящего изобретения. Они бу 19 27035 дут включать большинство реакций с использованием крупных полимеров, таких как белки, полинуклеотиды, полисахариды и другие органические полимеры, а также другие органические полимеры, у которых количество полимерных субъединиц будет таким, что полимер станет больше размеров пор CLEC. В таких примерах, однако, катализ все-таки будет иметь место на поверхности CLEC. Настоящим изобретением является способ иммобилизации выбранного белка, в частности, фермента, путем кристаллизации и структурирования этого белка, приводящим к производству структурировании о кристалла иммобилизованного фермента (CLEC), который может использоваться для каталитического производства желаемого продукта, такого как пептид, углевод, липид или хиральная органическая молекула. Настоящее изобретение далее касается таких CLEC, а также способа изготовления выбранного продукта посредством CLEC - катализированной реакции или CLEC-катализированной реакции в серии реакции. В одном из выполнений настоящего изобретения, дипептидный предшественник аспартама был получен в реакции конденсации, катализированной посредством структурированного иммобилизованного термолизина, полученного по настоящему способу. В другом выполнении изобретения, индикаторный субстрат, FAGLA, расщепили с получением колориметрического продукта, присутствие которого указывает на ферментативную активность у CLEC-термолизина. FAGLA-гидролиз использовали в качестве модельной реакции для установления устойчивости CLEC-термолизина в некоторых средах, которые обычно несовместимы с активностью этого фермента. 5 10 15 20 25 30 35 40 В других выполнениях данного изобретения, ферменты эластаза, эстераза, липаза, аспарагиназа и лизоцим исполь- 45 зовали для расщепления различных указанных веществ, таких как р-нитрофенил ацетат (эстеразой и липазой), сукцинил/ала/-3-р-нитроанилил (эластазой), 4-метилумбеллиферил N-ацетил-хитриозида 50 (лизоцимом) и NADH (аспарагиназой). Используя способ по настоящему изобретению, средний специалист в данной области может приспособить протокол способа для изготовления желаемого 55 продукта с помощью реакции, катализируемой иммобилизованным ферментом. Интересующий фермент, будучи кристаллизован из подходящего раствора, может быть структурирован глютаральдегидом 20 или другим пригодным бифункциональным реагентом в кристаллизационном растворе для получения CLEC этого фермента. В дальнейшем CLEC фермент может быть лиофилизирован, как описано в примере 2 Использование CLEC предлагает несколько преимуществ по сравнению с доступными в настоящее время методами ферментативного катализа. Например, структурированная кристаллическая матрица CLEC обеспечивает ему свою собственную опору. Чтобы связать ферментный катализатор, дорогие носители - шарики, стекла, гели и пленка, - как в известных методах иммобилизации, теперь не нужны. В результате, концентрация фермента в CLEC близка к теоретическому пределу загрузки, который может быть достигнут для молекул данного размера, значительно превышающий плотности, доступные даже в концентрированных растворах. Весь CLEC состоит из активного фермента (а не нейтрального носителя), и, таким образом, связанное с ухудшением диффузии снижение скорости ферментативной реакции, обычно наблюдаемое с ферментами, иммобилизованными традиционными методами по сравнению с ферментами в растворе, будет сведено до минимума, поскольку средний размер свободного пути для субстрата и продукта между активным ферментом и свободным растворителем будет в значительной степени сокращен для CLEC (по сравнению с ферментом, иммобилизованным традиционными методами на частицах носителя). Эти высокие плотности белка будут особенно полезны в биодатчиках, при аналитических и других применениях, требующих больших количеств белка в малом объеме. В промышленных процессах, превосходящая производительность и компактность CLEC приводит к значительным производственным экономия^, посредством повышения эффективной активности данного объема катализатора, позволяя при этом уменьшить размер завода, а также капиталовложения. (Daniels M.J. Methods in Enzymol. 136: 371-379 (1987)). CLEC-ферменты являются относительно монодисперсными, макроскопического размера и с формой, отражающей естественные характеристики роста кристалла отдельного ферментного катализатора. Замена имеющейся среды иммобилизованного на носителе фермента на CLEC-ферменты не вызовет затруднений, поскольку обе системы сравнимы по размеру и форме, и обе могут быть аналогичным обра 21 27035 зом восстановлены из сырья путем любого количества простых методов, включая основные применяемые экономичные процедуры, такие как фильтрование, центрифугирование, декантация растворителя и 5 ДР. Кроме того, использование лиофилизированных CLEC-ферментов позволяет простое обращение и хранение этих материалов перед их использованием (сухое хранение при комнатной температуре без охлаждения в течение продолжительных периодов времени). Лиофилизированные CLEC-ферменты также обеспечивают простое составление рецептур путем непосредственного добавления растворителей и субстратов, представляющих интерес, без длительных процедур замены растворителей или образования аморфных суспензий. Лиофилизированная форма CLEC расширяет область общего применения ферментов в качестве катализаторов до более широкого спектра ферментов и условий их функционирования. Вторым преимуществом CLEC является то, что структурирование кристаллизованного фермента стабилизирует и укрепляет кристаллическую решетку и составляющие ферментные молекулы, как механически, так и химически В результате, CLEC может быть единственным средством достижения значительных концентраций активного ферментного катализатора в тяжелых условиях водных, органических, почти безводных растворителей или в смесях водно-органических растворителей. Использование ферментов в .качестве катализаторов в реакциях органического синтеза было затруднительно вследствие- их тенденции к денатурации в присутствии неводных растворителей и, особенно, в смесях водных и неводных растворителей (Klibanov A.M. Trends in Biochemical Sciences, 14: 141-144 (1989)). У CLECферментов, ограничение конформационной мобильности, приводящей к стабильности, обеспечивается посредством межмолекулярных контактов и поперечных связей между составляющих CLEC ферментных молекул, создавая ферментную кристаллическую решетку, а не вследствие почти полного отсутствия воды в среде. В результате, промежуточные концентрации воды могут переноситься (выдерживаться) ферментами, составленными в виде CLEC, что ранее было невозможно (см. табл. 12). В коммерческих применениях, водноорганические смеси растворителей позволяют манипулировать образованием продукта посредством использования преи 10 t 15 20 25 30 35 40 45 50 55 22 муществ относительной растворимости продуктов и субстратов. Даже в водных средах, ферментные катализаторы, иммобилизованные или растворимые, подвергаются в химическом реакторе механическим условиям, которые могут приводить к денатурации и сокращению их полупериода разложения. Химические поперечные связи внутри CLEC-ферментов обеспечивают необходимую механическую прочность (Quiocho и Richards, Proc. Natt. Acad Sci (США) 52: 833-839 (1964)), что приводит к повышению срока работы в реакторе ферментного катализатора. Третье преимущество CLEC происходит из его кристаплической природы, и состоит в том, что CLEC может достичь однородности по всему объему структурированного кристалла. Описанные здесь кристаллические ферменты выращивают и структурируют в водной среде, и поэтому расположение (порядок) молекул внутри кристаллической решетки остается правильным и равномерным. Эта равномерность поддерживается межмолекулярными контактами и химическими поперечными связями между молекулами фермента, составляющими кристаллическую решетку, даже когда осуществляют перенос в другую водную, органическую или почти безводную среду, или смешанные водно-органические растворители. Во всех этих растворителях, молекулы фермента поддерживают равномерную дистанцию друг от друга, образуя хорошо определенные стабильные поры в кристаллах CLEC, которые облегчают доступ субстрата к ферментному катализатору, а также удаление продукта. Постоянство ферментативной активности является крайне важным (критическим) условием для промышленных, медицинских и аналитических применений, когда первостепенное значение имеет воспроизводимость и постоянство результата. Четвертым преимуществом использования CLEC является то, что фермент проявляет повышенный срок работы и хранения. Решеточные взаимодействия, даже в отсутствие поперечных связей, как известно, стабилизируют белки, отчасти благодаря ограничению конформационных степеней свободы, необходимых для денатурации белка. В CLEC-ферментах взаимодействия в решетке, будучи фиксированными химическими поперечными связями, особенно важны для предотвращения денатурации, особенно в смесях водных и безводных растворителей (Kiibanov A.M., Trends in Biochemical Sciences 14: 1 4 1 23 27035 144 (1989)). Ферменты, находившиеся в кристаллическом состоянии месяцы и годы, обычно сохраняют высокий процент их каталитической активности. Структурированные кристаллы иммобилизованного фермента, сохраняемые в безводных растворителях, будут еще более защищены от микробиального загрязнения и повреждения, что является серьезной проблемой при хранении больших количеств белка в водной среде, богатой питательными веществами. В случае лиофилизированного CLEC-фермента, он хранится в отсутствие растворителя. Это, а также стабилизация, достигнутая структурированием, позволяет осуществлять хранение без охлаждения в течение длительных периодов времени. Пятым преимуществом использования CLEC является то, что он проявляет повышенную температурную стабильность вследствие поперечных связей, стабилизирующих кристаллическую решетку. Проведение реакций при более высоких температурах, чем используемые при традиционных методах, повысит скорости химических реакций, представляющих интерес, как термодинамически, так и ввиду повышения скорости диффузии вещества в и из кристаллической решетки CLEC. В сочетании, эти эффекты представляют значительное улучшение эффективности реакции, потому, что они могут увеличить до максимума производительность данного количества ферментного катализатора, который, как правило, является наиболее дорогостоящим компонентом реакционного процесса (Daniels M.J. Methods in Enzymol 156: 371-379 (19E7)). Температурная стабильность CLEC-ферментов значительна вследствие того, что большинство ферментных систем требуют мягких условий реакции. CLEC-ферменты будут также стабилизированы против денатурации при временном повышении температуры при хранении. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Последним преимуществом использования CLEC является то, что в нижележащей кристаллической решетке между отдельными ферментными молекулами образованы поры правильного размера и 50 формы. Это ограничение доступа растворителя существенно повышает характеристики удерживаемости CLEC-ферментами ионов металла и кофактора, по сравнению с традиционными иммобилизован- 55 ными ферментами и ферментами в растворе. Это свойство CLEC позволит использовать более выгодные экономические процессы непрерывного потока (см. например, Оуата и др. Methods in Enzymo! 24 136Ж 503-516 (1987)), в ситуациях, когда ферменты иначе были бы инактивированы посредством утечки иона металла или кофактора. Например, в осуществляемом с помощью термолизина синтезе дипептидного предшественника аспартама - Z-LAsp-L-Phe-OMe, известно, что традиционно иммобилизованный фермент теряет каталитическую активность в процессах постоянного потока, проходящих в колоннах, отчасти вследствие утечки ионов кальция, необходимых для активности фермента термолизина. На практике, утечка ионов кальция приводит к тому, что приходится использовать менее эффективные периодические процессы. (Наканиши и др. Биотехнология, 3: 459-464 (1985)). Утечка происходит, когда комплексы ионов кальция образованы субстратом Z-L-Asp, в конкуренции с природными сайтами связывания кальция на поверхности фермента, приводящей к потере каталитической активности. Высокая плотность фермента в кристаллах CLEC, и соответственно ограничейное пространство, доступное для растворителя в промежуточных пустотах кристаллов, мешает образованию конкурирующих L-Asp-Ca** комплексов, ответственных за утечку ионов металла. Согласно способу по настоящему изобретению, структурированный кристалл иммобилизованного фермента (CLEC) приготавливают следующим образом. Кристаллы фермента выращивают путем контролируемого осаждения белка из водного раствора или из водного раствора, содержащего органические растворители. Условия, подлежащие контролю, включают, например, скорость выпаривания растворителя, присутствие соответствующих растворенных веществ и буферов, а также рН и температуру. Подробный обзор различных факторов, затрагивающих кристаллизацию белков, был опубликован в Methods in Enzymol. 114: 112 (1985). Кроме того, и Макферсон, и Гиллидани (см. J.Crystal Growth 90: 51-59 (1988)) составили обширные списки всех белков и нуклеиновых кислот, о которых сообщалось как о кристаллизуемых, а также условий, ведущих к их кристаллизации. Коллекция кристаллов и рецептов кристаллизации, а также хранилище данных о растворимых белках и нуклеиновых кристаллических структурах содержится в Белковом Банке Данных (Protein Data Bank, см. Bernstein и др.5 G. Мої. ВіоІ. 112: 535-542 (1977) в Брукхавенской национальной лаборатории. Эти ссылки могут быть использованы для установления условий, необходимых для ж 25 27035 кристаллизации данного белка или ранее кристаллизованного фермента, в качестве предпосылки для образования соответствующего CLEC, и могут дать указания по составлению кристаллизационной стратегии для белков, которые ранее не кристаллизовались. Альтернативно, во многих случаях, продуманная стратегия поиска путем проб и ошибок (см., например, Картер и Картер, G. Вюі. ,Chem. 254: 1221912223 (1979)), может дать подходящие условия кристаллизации большинства белков, включая, но не только бепки, обсуждающиеся выше, при том условии, что для них может быть достигнута приемлемая степень чистоты. Требуемая степень чистоты может значительно различаться у разных белков. В случае лизоцима, например, фермент кристаллизовали непосредственно из его неочищенного источника - белка куриного яйца (Гиллиданд, G. Crystal Growth 90: 51-59 (1988)). Для использования в качестве CLEC в способе по настоящему изобретению не требуются крупные отдельные кристаллы, которые необходимы для инфракции рентгеновских лучей, а фактически могут быть нежелательны вследствие диффузионных проблем, связанных с размером кристалла. Мелкокристаллические материалы ( с кристаллами порядка 10" мм размера в поперечном сечении) пригодны для CLEC и часто наблюдались, хотя о них редко сообщалось в литературе по рентгеновской кристаллографии. Микрокристаллы очень полезны в способе по настоящему изобретению для сведения к минимуму проблем, связанных с диффузией (см., например, Quiocho F.A. и Bichards F.M.S Biochemistry 5: 4062-4076 (1967)). В общем, кристаллы получают путем соединения белка, подлежащего кристаллизации, с соответствующим водным растворителем или водным растворителем, содержащим осадители (преципитирующие агенты), такие как соли или органические вещества. Растворитель соединяют с белком при температуре, которую определяют экспериментально, чтобы она подходила для вызывания кристаллизации и была приемлемой для поддержания стабильности и активности белка. Растворитель, по желанию, может включать дополнительные растворенные вещества, такие, как двухвалентные катионы, кофакторы и хаотропы, а также виды буферов для контролирования уровня рН. Необходимость дополнительно (совместно) растворенных веществ и их концентрации определяют 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 26 экспериментально для того, чтобы облегчить кристаллизацию В процессе промышленного масштаба контролируемое осаждение (преципитация), ведущее к кристаллизации, лучше всего проводить путем простого соединения белка, осадителя, растворенных веществ и, возможно, буферов в периодическом процессе. Также могут быть приспособлены альтернативные лабораторные методы кристаллизации, такие, как диализ или паровая диффузия, Макферсон [Methods Enzymol / 114: 112 (1985)] и Голлиланд [G. Crystal Growth 90: 51-59 (1988)] включают в свои обзоры в литературе по кристаллизации подробные списки пригодных параметров. В некоторых случаях, несовместимость между сшивающим агентом и средой для кристаллизации может потребовать переноса кристаллов в более подходящую систему растворителя. Многие из белков, для которых ранее уже были описаны условия кристаллизации, обладают значительным потенциалом в качестве практических ферментных катализаторов в промышленных и лабораторных химических процессах, и непосредственно относятся к веществам типа CLEC в объеме настоящего изобретения. Табл. 1 представляет образцы ферментов, которые уже кристаллизовали ранее Следует заметить, что условия, сообщаемые в большинстве из этих ссылок, были оптимизированы для выращивания крупных кристаллов дифракционного качества5 часто с большим трудом. В некоторых случаях для изготовления меньших кристаллов для получения CLEC необходима некоторая подготовка параметров. Если кристаллы выращивали в подходящей среде, то они могут быть структурированы. Структурирование приводит к стабилизации кристаллической решетки посредством введения в нее ковалентных связей между составляющими кристалл молекулами фермента. Это позволяет осуществлять перенос фермента в другую реакционную среду, которая иначе была бы несовместимой с существованием кристаллической решетки, или даже с существованием интактного нативного белка. Структурирование может быть достигнуто с помощью большого разнообразия бифункциональных реагентов, хотя на практике был выбран недорогой реагент - глютаральдегид, (С целью ознакомления со списком представителей доступных структурирующих агентов, см., например, каталог 1990 г. компании Pierce Chemical). 27 27035 Структурирование с помощью глютаральдегида образует прочные ковалентные связи, в первую очередь, между аминокислотными остатками лизина и между молекулами фермента в кристаллической решетке, составляющей кристалл. Структурные взаимодействия предотвращают обратный выход в раствор составляющих кристалл молекул фермента, эффективно иммобилизируя (или делая нерастворимыми) молекулы фермента в микрокристаллических частицах (в идеале размером 10 1 мм). Эти макроскопические иммобилизованные, нерастворимые кристаллы могут затем легко отделяться от сырья и непрореагировавшего субстрата посредством простых приемов, таких как фильтрование, декантация и др. Эти кристаллы даже могут использоваться в колонках, заполняемых CLEC в непрерывных поточных процессах, з которых они демонстрируют улучшенные свойства удерживать металлические ионы и кофакторы. Согласно способу по настоящему изобретению, CLEC-ферменты получают с целью их использования в качестве ферментных катализаторов в известных и новых средах. Повышенная стабильность CLEC-ферментов, происходящая от реакции структурирования, позволяет переносить CLEC в растворитель (например, водный, органический или почти безводный, или в из смесь), который иначе был бы несовместим с этим ферментом, и проводить химические процессы в реакторе при высоких температурах и экстремальных рН. Макроскопические частицы CLEC-катализатора позволяют легко с ними обращаться, восстанавливать их из сырья простыми методами, такими, как фильтрование, центрифугирование или декантация растворителя. Кроме того, они могут использоваться для заполнения колонн непрерывных химических процессов. Суспензию одного объема структурированных кристаллов термолизина в десяти объемах деминерализованной воды при рН 7,0 лиофилизировали до утра с использованием лиофилизатора ВирТис /VirTis/, модель # 24. Лиофилизированные кристаллы хранили при комнатной температуре или при 4°С перед их реконструкцией (восстановлением содержания жидкости), которую осуществляли посредством добавления десяти объемов выбранного растворителя непосредственно на кристаллы, взятые после хранения. Регидратированные кристаллы восстанавливали в 10 мМ кальциево-ацетатном буфере с рН 7,0 для экспериментов по FAGLA 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 28 расщеплению. Восстановленные лиофилизированные кристаллы обычно хранили при комнатной температуре. Напротив, растворимый фермент требует хранения при -70°С для поддержания его специфичной активности в течение периода, превышающего неделю. Этот порядок (протокол) использовали для всех ферментов, описанных в ниже приводимых примерах, включенных в описание. Способ по настоящему изобретению, согласно которому получают структурированные кристаллические ферменты, описывается далее на примерах производства структурированных кристаллов иммобилизованного термолизина для использования в процессе получения дипептидного предшественника аспартама в среде этилацетата, который является почти безводным растворителем. Термолизин-белок, который был кристаллизован ранее, и структура которого была разрешена при 1,6 А разрешении (см. Холмс и Мэтьюз, J. Мої. ВіоІ 160: 623-639 (1982)), является одним из примеров фермента, который может использоваться в качестве CLEC по настоящему способу. Термолизин используется в производстве искусственного подсластителя аспартама [Исова и др. патент США № 4436925 (1984); Линдберг, J. Chem. Ed. 64: 1062-1064 (1987); Наканиши и др., Biotechnology 3: 459-464 (1985); Ояма и др., Methods in Enzymol. 136: 503-516 (1987)]. В настоящее время большая часть аспартама, очевидно, производится с использованием традиционного подхода химического синтеза, хотя использование иммобилизованного известными методами термолизина в почти безводной среде дало обнадеживающие результаты. [Ояма и др., J.Org. Chem. 46: 5242-5244 (1981); Наканиши и др. Biotechnology 3; 459-464 (1985)]. Усовершенствование ферментативного подхода к производству аспартама, которое возможно посредством использования настоящего способа, позволит ему конкурировать с используемым в настоящее время способом, как в отношении удобства так и стоимости [Ояма и др. Methods in Enzymol, 136: 503-516 (1987)]. Способ по настоящему изобретению использовали для получения CLEC-термолизина, который оценивали в отношении его рН-зависимости и стабильности, стабильности при повышенных температурах, резистентности к экзогенному протеолизу и стабильности в присутствии органического растворителя. CLEC-термолизин сравнивали с растворимым термолизином, как 29 27035 подробно описано в примере 2 и на фиг. 1-4. Результаты оценки показали следующее: 1. Что касается рН-зависимости и стабильности, обе формы продемонстрировали максимальную активность при рН 7 и продемонстрировали аналогичную активность в кислом диапазоне. В щелочном диапазоне CLEC сохраняет свою максимальную активность по рН 10; растворимый термолизин обладает 75%-ной активностью при рН 8,5, только 25%-ной активностью при рН 9, и неактивен совершенно при рН 9,5. 2. Дополнительная стабилизация, достигнутая у CLEC-фермента, приводит к ферментативной активности при более высоких температурах, чем ото возможно с растворимым термолизином. Повышенная стабильность CLEC-термолизина при более низких температурах позволяет упростить его хранение по сравнению с хранением растворимого фермента. Температурная стабильность и резистентность к автолизу были также продемонстрированы для CLEC-термолизина, кристаллы которого сохраняли максимальную активность через пять часов после их инкубирования при 65°С. Напротив, растворимый термолизин утратил 50% своей активности через 2 часа инкубирования и продемонстрировал незначительную активность через 24 часа инкубирования при 65°С. 3. Ферментативная активность CLECтермолизина осталась без изменений после четырехдневного инкубирования в присутствии мощной стрептококковой протеазы-проназы. Напротив, растворимый термолизин быстро деградировал и утратил свою активность через 90 минут такой инкубации. 4. CLEC-термолизин и растворимый термолизин продемонстрировали заметно различную стабильность в присутствии органических растворителей, как показано в табл.12, CLEC-термолизин сохранил более чем 95% своей максимальной активности после инкубирования со всеми органическими растворителями, с которыми проводилась оценка. Эти характеристики CLEC-термолизина и других ферментов делают их осо* бенно полезными, поскольку их легче хранить, они более стабильны и труднее теряют активность или деградируют, чем соответствующие растворимые ферменты. Способ по настоящему изобретению также использовали для получения CLECэластазы, которую оценивали в отношении ее активности и резистентности к экзо 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ЗО генному протеолизу. CLEC-ферменты эластазы сравнивали с растворимой эластазой, как описано подробно в примере 3 и на фиг. 5 и 6. Результаты оценки продемонстрировали следующее: 1. CLEC-эластаза сохраняет приблизительно 50% активности по сравнению с растворимым ферментом. 2. Растворимая эластаза быстро разрушалась протеазой. Активность растворимой эластазы была снижена до 50% исходной активности после 10 минут инкубирования в присутствии протеазы. Через час инкубирования растворимый фермент утратил более 90% своей первоначальной активности. Напротив, ферментативная активность эластазных структурированных кристаллов осталась незатронутой инкубированием с протеазой. Способ по настоящему изобретению также использовали для получения CLECэстеразы, которую оценивали в отношении ее активности и резистентности к экзогенному протеолизу. CLEC-эстеразу сравнивали с растворимой эстеразой, как детально описано в примере 4 и табл. 7 и 8. Результаты оценки продемонстрировали следующие: 1. CLEC-эстераза сохраняет примерно 50% активности по сравнению с растворимым ферментом. 2. Растворимая эстераза была высокочувствительной к протеолитической деградации. Активность растворимой эстеразы снизилась до 50% исходной активности через десять минут инкубирования в присутствии протеазы. После часа инкубирования растворимого фермента, он утратил более 90% исходной активности. Напротив, ферментативная активность CLEC-эстеразы не пострадала от инкубирования в присутствии протеазы. Способ по настоящему изобретению также использовали для получения CLECлипазы, которую оценивали в отношении ее активности. CLEC-липазу сравнивали с растворимой липазой, как детально описано в примере 5 и на фиг. 9. Результаты этой оценки продемонстрировали, что CLEC-липаза сохраняет приблизительно 90% активности по сравнению с растворимой липазой. Способ по настоящему изобретению также использовали для получения CLECлизоцима, который оценивали в отношении его активности и резистентности к экзогенному протеолизу. CLEC-лизоцим сравнивали с растворимым лизоцимом, как детально описано в примере 6 и на фиг 10. Результаты этой оценки продемонст 31 27035 рировали, что CLEC-лизоцим сохраняет приблизительно 50% активности по сравнению с растворимым ферментом. Способ по настоящему изобретению также использовали для получения CLECаспарагиназы, которую оценивали в отношении ее активности. CLEC-аспарагизану сравнивали с растворимой аспарагиназой, как детально описано в примере 7 и на фиг. 11. Результаты этой оценки продемонстрировали, что CLEC-аспарагизана сохраняет приблизительно 77% активности по сравнению с растворимым ферментом. Как раскрыто в настоящем описании, CLEC-ферменты представляют собой новую технологию с широким применением во многих областях, включая, но не только, синтезы промышленного масштаба, лабораторные методики, биодатчики и медицинские применения. В табл. 2-5 нижеприведены примеры различных систем, использующих при их осуществлении традиционные методы иммобилизации ферментов. Специалист в данной области сможет приспособить эти, и подобные им, системы к CLEC-технологии, раскрытой в настоящей заявке. Для иллюстрации этого, ниже обсуждаются конкретные примеры, более подробно, для каждой из этих категорий применения. Табл. 2 ниже приводит список примеров, использующих ферменты, иммобилизованные традиционными методами, в промышленных процессах, которые (примеры) могут быть легко адаптированы к раскрытой здесь CLEC-технологии. Ниже приводится описание использования способа по настоящему изобретению: а именно, приспосабливание производства акриламида из иммобилизованных клеток, которые перепроизводят фермент нитрил-гидратазу (Нагасава Т. и Ямада X. Trends in Biotechnology 7: 153-158) (1989)), к CLEC-технологии, описанной выше. Производство акриламида в промышленном масштабе, этого важного в химии вещества, описано Ямадой и его сотрудниками (Нагасава и Ямада, Trends in Biotechnology 7: 153-158 (1989)). Тысячи тонн акриламида в год производятся в химических реакторах, загруженных иммобилизованными клетками, выбранными в качестве перепроизводителей фермента нитрилгидратазы. Нитрилгидратаза, как сообщалось ранее, очищалась и кристаллизовалась из двух источников Brevibacterium R 312 (Нагасава и др. Biochem. Biophis. Res. Commun. 139: 1305 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 32 1312 (1986) и P. Chlororaphis В 23 (Нагасава и др. Em. J. Biochem. 162: 691-698 (1987)). Как здесь раскрыто, эти кристаллические ферменты, каждый, могут быть иммобилизованы посредством их структурирования глютаральдегидом или другим подходящим сшивающим агентом для получения CLEC-фермента. CLEC-нитрилгидратазы могут быть затем использованы в традиционном реакторе, вместо иммобилизованных клеток, используемых в настоящее время. Приспособление этого процесса к CLEC-технологии ведет к немедленным преимуществам. Эти преимущества включают: уменьшение размера завода и повышенный выход вследствие увеличения актизности на единицу объема вследствие более высокой концентрации фермента в CLEC-ферментах, и улучшенной диффузии субстрата и продукта, снижение нежелательного загрязнения микроорганизмами и побочными реакциями, вследствие более высокой чистоты CLEC-фермента, а также благодаря более низкой чувствительности к микробиальному загрязнению из-за отсутствия клеток. Кроме того, имеются и другие преимущества, присущие только способу, основанному на технологии CLEC. Эти преимущества включают: более высокую рабочую температуру для повышения скорости реакции; способность работы в водных, органических и почти безводных растворителях, позволяющих оптимизировать реакцию получения акриламида; а также продление срока хранения и работы, вследствие более высокой химической стабильности и механической прочности CLEC, что особенно заметно в нетрадиционных растворителях. Способ согласно настоящему изобретению и соответственно выбранный CLECфермент или набор CLEC-ферментов также могут использоваться для медицинского применения. Такой фермент или набор ферментов могут использоваться, например, для удаления компонента жидкости, такой как кровь, обычно путем изменения компонента и, таким образом, превращая его в вещество, не оказывающее вредного воздействия на пациента, которое может выводиться из организма нормальными процессами (например, посредством детоксикации, или разложения в печени, почечной экскрецией). В таком применении соответствующим образом выбранный CLEC-фермент или их набор приводится в контакт с тканевой жидкостью, содержащей компонент, подлежащий изменению, или содержащей реагент (про 33 27035 дукт или субстрат) реакции, в которой участвует такой компонент, на который (компонент или реагент) действует данный фермент. В результате, фермент способен воздействовать на компонент, подлежащий изменению, или реагировать с другим веществом, которое является продуктом реакции, в которой участвует компонент, подлежащий изменению. Активность фермента приводит либо к непосредственному изменению компонента, подлежащего удалению, либо к изменению продукта реакции, в которой такой компонент участвует, делая таким образом невозможным продолжение этой реакции. Это может быть осуществлено посредством использования экстракорпорально (то есть "вне тела") устройства, которое включает соответствующим образом выбранный CLEC-фермент или их набор и удерживающее средство из некоего материала, такого как пористый материал, на котором удерживается CLEC, или трубка, в которой может находиться CLEC, позволяющее (средство) осуществить контакт между компонентом или веществом в жидкости, являющимся продуктом реакции, в которой данный компонент, подлежащий изменению, принимает участие. Это также может быть достигнуто посредством введения соответствующего CLEC в пригодную полость тела, такую, как брюшина или лимфатический узел, где CLEC мог бы иметь доступ к жидкостям организма. Такое введение может быть выполнено хирургическим путем, либо посредством инъекции суспензии CLEC. Введение CLEC непосредственно в кровь было бы неподходящим, учитывая высокий, риск эмболии (закупорки сосудов). Использование соответствующих CLEC в этой области могли бы послужить альтернативой генетическим методам, при. меняемым в терапии заменой фермента для исправления врожденного дефекта, такого, например, как фенилкетонурия. Табл. 3 иллюстрирует некоторые из медицинских применений, в которых может быть использован CLEC. Для большинства этих случаев, экстракорпоральное лечение находится еще в стадии исследований, но преимущества, предлагаемые CLEC, могли бы предложить новые методы лечения в тех областях, в которых ранее не было альтернативного лечения. Конкретным примером применения настоящего способа является система гепарин-лиазы для удаления гепарина из крови (Берштейн и др Methods in 5 10 15 20 25 ЗО 35 40 45 50 55 34 Enzymology 137: 515-529 (1987)), обсуждаемая ниже. Все экстракорпоральные устройства, через которые перекачивается кровь, такие как устройство для почечного диализа, фильтры артериовенозной крови непрерывного действия или экстракорпоральные мембранные оксигенаторы, требуют введения гепарина пациенту для предотвращения свертывания крови. Однако, гепаринизация пациента приводит к геморрагическим осложнениям и остается угрозой для здоровья человека. Эти проблемы возрастают по мере увеличения времени перекачивания крови, например, в случае мембранного оксигенатора, и могут привести к серьезной потере крови. После экстракорпоральной терапии, гепарин может быть удален из крови с помощью гепариназного устройства (т. е. содержащего гепариназу) на выходе это-го экстракорпорального устройства, которое устраняет весь гепарин из крови, возвращаемой пациенту и избегает таким образом имеющиеся в настоящее время проблемы, связанные с гепаринизацией. Опубликованные исследования (Лангер и др., Science 217: 261-263 (1982)); Берштейн и др., Methods in Enzymology 137: 515-529 (1987) подробно излагают проблемы, возникающие при использовании в экстракорпоральных устройствах ферментов, иммобилизованных традиционными методами. Главная проблема состоит в том, что традиционная иммобилизация приводит к плохому удержанию ферментативной активности на единицу объема, что требует больших объемов иммобилизованного фермента для осуществления необходимой гепаринизации. Этот объем слишком велик, чтобы иметь практическое значение для лечения человека. Напротив, высокая удерживаемость активности на единицу объема у CLEC-фермента благодаря отсутствию инертных подложек позволяет обойти эту проблему и предлагает практическое решение проблемы удаления гепарина у человека. Повышенная стабильность CLEC понизит скорость вымывания (диссоциации) фермента из структурированного кристалла. Это превосходит менее стабильные ферменты, иммобилизованные традиционными методами, также вследствие того, что иммунные реакции, происходящие из-за утечки фермента, будут меньше (ослаблены). Температурная стабильность CLEC-фермента предотвращает денатурацию фермента при временном повышении температуры во время хра 35 27035 нения; представляется возможным хранить CLEC при комнатной температуре с сохранением высокой активности фермента. Кроме того, CLEC будет дешевле и удобнее использовать» чем аналогичные ферменты, иммобилизованные традиционными методами, вследствие их более длительного периода работы и хранения. CLEC или набор CLEC-ферментов могут использоваться в качестве компонента сенсора (датчика), называемого здесь "биодатчиком", который может использоваться для обнаружения и/или количественного анализа интересующего вещества ( а ' г п - ч і м лкооти т акой как тканевая жидкость {например, кровь, моча), промышленная и лабораторная среда для химической реакции, органические среды, вода, культуральная среда и напитки. В некоторых случаях интересующей текучей средой может быть газ, как, например, в анализаторе, для обнаружения алкоголя в выдуваемом воздухе (Барзана, Клибанов и Карелл, NASA Tech, Brief. 13: 104 (1989)). В этом применении соответствующим образом выбранный CLEC или их набор приводят в контакт с текучей средой (т. е. с жидкостью или газам), подлежащей исследованию в качестве аналита. Интересующий аналит может быть измерен непосредственно (например, уровень содержания глюкозы в крови) или непрямым образом (например, посредством обнаружения или количественного определения вещества, являющегося реактантом (продуктом или субстратом) в реакции, в которой участвует интересующий аналит). В любом из них CLEC способен оказывать свое действие на аналит или вещество, являющееся реактантом в реакции, в которой также участвует аналит* Активность фермента приводит к обнаруживаемым изменениям (например, изменению рН, производству света, тепла, изменению электрического потенциала), которое обнаруживается или количественно измеряется соответствующими средствами детекции (например, электродами рН-метра, световыми или тепловыми датчиками, средствами для измерения изменений электричества) [Яната и др. Anal. Chem. 62: 33R-44R (1990)]. Могут использоваться любые средства, которые могут обнаруживать изменения, происходящие в процессе ферментного катализа. Биодатчики по настоящему изобретению включают CLEC или их набор и средства для удерживания CLEC, которые позволяют осуществлять контакт между CLEC и интересующим аналитом или веществом в теку 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 36 чей среде, которое является реактантом в реакции, в которой участвует интересующий аналит. Табл. 4 иллюстрирует некоторые из применений биодатчиков, в которых могут использоваться CLEC-ферменты. В настоящее время в некоторых применениях используются иммобилизованные ферменты, но при этом возникают проблемы связанные с низкой стабильностью, низкой плотностью фермента, коротким периодом его жизни и отсутствие воспроизводимости результатов. Эти примеры могут быть легко адаптированы к раскрытой здесь CLEC-технологии. В способе по настоящему изобретению, используемом для проведения анализов образцов в биодатчике, особенно желательно получить обнаруживаемый сигнал максимально возможной силы от наименьшего возможного количества субстрата и катализатора. В этом отношении здесь CLEC-технология является особенно притягательной, поскольку она позволяет достичь наивысшей возможной концентрации ферментного катализатора в данном объеме. Часто предпринимаются значительные усилия для того, чтобы совместить интересующую конечную ферментативную реакцию, осуществляемую непосредственно или через подходящие промежуточные соединения, с производством света ферментами типа люциферазы [Куркиярви и др., Methods in Enzymology 137; 171-181 (1988)]. Это делается чтобы использовать чувствительность и эффективность оборудования, обнаруживающего фотоны, что при соответствующих условиях позволяет обнаружить фемто-молярные концентрации продуктов ферментативной реакции. Следуя этому принципу, ранее были созданы биосенсорные системы с использованием ферментов, иммобилизованных традиционными методами для обнаружения различных субстратов, представляющих медицинский и др. интерес. Реакции, производящие свет, могут быть совмещены с реакциями в экспериментах по обнаружению таких субстратов, как D-глюкоза, L-лактат, L-глютамат и этанол, среди прочих, при крайне низких концентрациях субстрата. Что касается вышеупомянутого применения, фермент люциферазу из Vibrio harveyn уже кристаллизовали, как сообщалось Свансоном и др., J.Bid. Chem. 260; 1287-1289 (1985). Кристаллы этой люциферазы могут быть структурированы глютаральдегидом или другим пригодным 37 27035 реагентом с образованием CLEC-люциферазы. Для аналитического и биосенсорного применений, CLEC-люцифераза предлагает много преимуществ по сравнению с ферментами, иммобилизованными традиционными методами. У CLEC весь объем будет состоять из излучающего свет фермента люциферазы. У иммобилизованного традиционными методами фермента, однако, аж 95% общего объема занято "инертным" носителем, который действует скорее как поглотитель света, излучаемого ферментом. Кроме того, повышенная стабильность CLEC-фермента облегчит его хранение при комнатной температуре, и также сделает возможными новые сенсорные применения в жестких условиях и при повышенных температурах. CLEC-ферменты могут использоваться в качестве лабораторных реагентов в маленьких колонках или в периодических процессах, которые могут использоваться для проведения лабораторных реакций. Некоторые из широких категорий реакций показаны в табл. 5. Шнейдер и др. Agnew. Chem. Int. Ed. Engl. 23 (№ 1): 64-68 (1984) иллюстрирует, как можно использовать ферменты в процессах органического синтеза. Эстеразу печени свиньи применяли в процессе трансформирования мезоэфира в хиральный моноэфир в водном фосфатном буфере. Преимущество использования в лаборатории реакций, катализируемых посредством CLEC, является тройным. Вопервых, CLEC сохраняет высокую активность в жестких условиях (например, в водных, органических, почти безводных растворителях и их смесях, и при высоких температурах), типичных для лабораторных опытов по химическому синтезу. Вовторых, CLJEC проявляет высокую стабильность при работе и хранении, что подходит для периодически прерывающихся лабораторных опытов. В-третьих, высокая активность CLEC на единицу объема позволит сократить время реакции и уменьшить необходимые объемы фермента (на единицу активности). Таким образом, преимуществорыми обладают CLEC-ферменты по сравнению со свободными или иммобилизованными ферментами, дают химикам-органикам альтернативу, представляющую собой высоко избирательный, искусственный инструмент. Во всех вышеописанных примерах, но не только, способ по настоящему изобретению может быть приспособлен специалистом в данной области для преобразо 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 38 вания способа, использующего катализатор в виде иммобилизованного традиционным методом фермента, для использования CLEC соответствующего фермента. CLEC-ферменты не только могут заменить ферменты, иммобилизованные традиционными методами, но также могут использоваться в преобразованиях, вызываемых клетками. Далее настоящее изобретение будет иллюстрировано следующими примерами, которые никоим образом не предназначены для ограничения объема изобретения. П р и м е р 1. Кристаллизация и структурирование термолизина для синтеза предшественника аспартама, z-Asp-PheOme Кристаллизация .250 мг термолизина от Bacillus thermopreteclyticus, закупленного у компании Берингер-Мангейм ГмбХ, растворили в 4 мл 45%-ного диметилсульфоксида (ДМСО) и 55%-ного 1,40 М ацетата кальция, 0,50 М какодилата натрия при рН 6,5. Эти исходные условия аналогичны описанным Меттюзом и др. для производства крупных кристаллов термолизина (дифракционного качества), см. например, Холм и Меттюз J. Мої. ВіоІ. 160: 623-639 (1982). Раствор белка затем концентрировали по 1 мл в микроконцентраторе "Центрикон"10. Хороший выход микрокристаллов был получен способом мгновенной кристаллизации, теперь раскрытом в этом описании, по которому 1 мл воды, или 1,40 М ацетата кальция, 0,50 М какодилата натрия с рН 6,5 быстро вводили в тот или иной ДМСО-термолизиновый раствор, описанный выше. Этим способом получают множество гексагональных микрокристаллов примерно одинаковых размеров (длиной примерно 10 й мм). Структурирование микрокристаллов термолизина Процедуры, использованные в этом конкретном примере выполнения способа по изобретению, являются приспособлением протокола, описанного Наканиши и др. Biotechnology 3: 459-464 (1985), согласно которому термолизин сначала адсорбировали на гранулированный носитель, составленный из ионообменной смолы Амберлит ХАД-7, а затем иммобилизировали посредством его структурирования глютаральдегидом (Квиочо и Ричарде, Proc. Natl. Acad. Sci. (США) 52: 833-839 (1964). В этом примере, микрокристаллы полученного термолизина центрифугировали и пеллетировали (осаждали), а надосадочную жидкость выбрасывали. За 39 27035 тем к микрокристаллам добавляли 5 мл 17,5%-ного технического глютаралюдегида в 2,5% ДМСО, 0,05 М ацетата кальция и 0,025 М какодилата натрия с рН 6,5. Смесь инкубировали при легком перемешивании в течение 4 часов при 37°С. Реакцию структурирования прекращали повторной промывкой кристаллов 10 мл аликвотами воды для удаления раствора глютаральдегида. Промытые структурированные кристаллы термолизина и составляют тот CLEC-термолизин, который использовали ниже в качестве катализатора. Синтез Z-Asp-Phe-Ome в водном растворе ь мл суспензии ы_£0-термолизина добавляют в реактор с постоянным перемешиванием, инкубируемый при 37°С. После центрифугирования и декантации надосадочной жидкости, к CLEC добавляли водную реакционную среду. Этот раствор приготавливали путем смешивания 80 мг Z-L-Asp и 80 г L-Phe-Ome'-HCf в 1 мл воды, с добавлением уксусной кислоты для получения рН 7,0. Образцы анализировали посредством HPLC. Ниже табл. 6 показывает высоту пиков в HPLC-исследовании субстрата. Z-L-Asp, нормализованных к 1 при времени - 0. Поскольку ZL-Asp ограничивает скорость этой реакции, то измерение уменьшения количества этого вещества эквивалентно измерению появления продукта Z-L-Asp-L-PheOme (Наканиши и др. Biotechnology 3: 4 5 9 464 (1985)). Кроме нормализованной высоты пиков HPLC по субстрату Z-L-Asp, табл. б также включает оценку степени завершенности реакции. Ясно, что реакция выходит на уровень приблизительно 2 0 % завершенности в течение первых 30 секунд и затем стабилизируется на этом уровне. Эти результаты согласуются с наблюдениями Наканиши и др., Biotechnology 3: 459-464 (1985), полученными с использованием термолизина, иммобилизованного традиционным методом в водной реакционной среде, аналогичной вышеуказанной, и могут быть объяснены плохой растворимостью продукта - Z-L-A$p-L-Phe-Ome в воде. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Синтез Z-Asp-Phe-OMe в почти безводном растворе 5 мл суспензии CLEC-термолизина добавляют в реактор с постоянным перемешиванием, который инкубируют при 37°С. 55 После центрифугирования и декантации надосадочной жидкости к CLEC добавляли почти безводную органическую среду. Этот раствор приготовляли путем смешивания 80 мг Z-L-Asp и 240 мл L-Phe-OMe 40 в 1 мл 9 9 % этилацетата с 1 % воды. Образцы анализировали посредством HPLC. Табл. 7, приведенная ниже, представляет высоту пиков в HPLC субстрата Z-L-Asp с указанием времени реакции, которая нормализована к 1 при времени = 0. Поскольку Z-L-Asp огранинивает скорость этой реакции, измерение уменьшения этого вещества эквивалентно изменению возникновенця продукта Z-L-Asp-L-Phe-OMe (Наканиши и др., Biotechnology 3: 459-464 (1985). Табл. 7 включает нормализованное остающееся количество ограничивающего Z-L-Asp субстрата и оценку степени завершенности реакции. В данном случае реакция прошла до 70%-ной завершенности в течение первых 30 секунд и стабилизировать на этом уровне. Эти результаты также согласовываются с наблюдениями Наканиши и др. Biotechnology 3: 459-464 (1985), полученными с использованием термолизина, иммобилизованного традиционным методом, в почти безводной реакционной смеси, и могут быть объяснены ингибированием фермента получаемым продуктом. П р и м е р 2. Кристаллизация, структурирование и лиофилизация термолизина и оценка характеристик полуменного продукта Кристаллизация термолизина Термолизин (компании Диава Казеи К.К., Япония) растворяют в 10 мМ ацетате кальция (Сигма), с рН 10,0, до концентрации 10% (вес/объем) рН раствора поддерживают на уровне 10,0 посредством его титрования 2М раствором NaOH. После полной солюбилизации (растворения), раствор белка титруют по рН 8,0' 2 М раствором HCI. Добавляют сухой ацетат кальция по 1,2 М. Затем добавляют по 3 0 % диметилсульфоксид (Сигма). Белок концентрируют по 100 мг/мл посредством ультрафильтрации в приборе Амикон (мембрана 10000 MWCO). Концентрированный фермент затем делили на аликвоты и хранили при -70°С. Термолизин кристаллизуют путем добавления 9 объемов деминерализованной воды к 1 мл концентрированного (100 мг/мл) белкового раствора. Раствор кратковременно встряхивают и оставляют до утра при комнатной температуре. Кристаллы промывают 10 объемами 10 мМ ацетата кальция с рН 7,0 и выделяют посредством центрифугирования малой скорости (10 мин при 1500 х д, центрифуга Бекман GPR). Быстрое добавление воды к концентрированному (10 мг/мл) раствору термолизина вызывает образование кристаллов, 41 27035 которые становятся видимыми при небольшом увеличении в течение 10 минут. Размер кристаллов воспроизводимым образом зависит от конечной концентрации белка. Три объема воды на один объем концентрата термолизина (100 мг/мл) дают 0,5 милиметровые по длине гексагональные палочки-кристаллы качества для рентгенографии, которые соответствуют кристаллам, описанным ранее Колманом с сотр. (Колман, Янсониус и Меттюз, J. Mof. Biol. 70: 701-724 (1972))," что подтверждено нами с помощью дифракционного анализа. Добавление 10 объемов воды к одному объему белкового концентрата уменьшает длину получаемых белковых кристаллов до 0,05 мм. Эти микрокристаллы являются предпочтительными в применениях CLEC, поскольку у них уменьшаются диффузионные проблемы, связанные с размерами кристаллов (см. Квиочо и Ричарде, Biochemistry 5: 4 0 6 2 - 4 0 7 6 (1967). В одной конкретной партии белка размер кристаллов выдерживается постоянным. (В этом исследовании использовались кристаллы размером 0,05-0,10 мм длины для того, чтобы облегчить точное отмеривание пипеткой суспензий кристаллов). Денситометрическое сканирование в SOS-PAGE показало шестикратную очистку фермента при кристаллизации, что существенно повышает специфичную активность CLEC. Кристаллизация привела к 20%-ному снижению общей активности CLEC-белка по сравнению с растворимым термолизином, когда его исследовали посредством спектрофотометрического расщепления дипептидного субстрата фурилакрилоил-глицин-Ь-лейцин-амид (FAGLA), как описано ниже. Структурирование кристаллов термолизина Кристаллы термолизина структурировали в течение 3 часов при комнатной .температуре в растворе 12,5%-ного глютаральдегида (Сигма), 5% ДМСО и 50 мМ Трис с рН 6,5. Структурированные кристаллы промывали трижды деминерализованной водой и выделяли центрифугированием малой скорости, как описано в отношении кристаллизации термолизина. Химическое структурирование кристаллов фермента стабилизирует кристаллическую решетку и составляющие ее молекулы фермента в кристалле достаточным образом для того, чтобы позволить практическое использование CLEC в средах, которые иначе не совместимы с функционированием фермента. При спектрофотометрическом исследовании, посредством 5 •10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 42 мониторинга расщепления дипептидного субстрата FAGLA, описанного ниже, не было обнаружено заметного различия в ферментативной активности между структурированными и неструктурированными кристаллами. Кроме того, структурирование стабилизирует CLEC до такой степени, что они могут быть лиофилизированы, с сохранением полной ферментной активности при их восстановлении в водных, органических и смешанных водноорганических растворителях, как показано в табл. 1 и табл. 8. Хотя кристаллизация приводила к 30%-ному снижению специфичной активности у CLEC-фермента по сравнению с растворимым термолизином, структурирование и лиофилизация CLEC в дальнейшем не уменьшали его специфическую активность. Ферментативная активность растворимого и CLEC-термолизина Каталитическую активность растворимого и CLEC-термолизина оценивали (Федер, Щук, Biochemistry 9: 2784-2791 (1970)) посредством гидролиза блокированного дипептидного субстрата фурилакрилоилглицин-1_-лейцинамида (FAGLA) (Швейцерхолл). Расщепление амидных связей измеряли спектрофотометрически по уменьшению поглощения при длине волны 345 им. Исходная концентрация фермента составила 1 0 7 М согласно определению содержания белка по Брэдфорду и денситометрическому сканированию (Фармация LKB UltroScar» XL) окрашенных Кумасси гелей SDS-PAGE. CLEC-фермент был определен как восстановленные лиофилизмрованные структурированные кристаллы термолизина. Растворимый фермент был определен как термолизин, концентрированный до 100 мг/мл. Фермент добавляли к 5 мл реакционного объема, содержащего субстрат. В указанные моменты брали аликвоты реакционной смеси и измеряли их поглощение при 345 нм. CLECтермолизин отделяли от реакционной смеси путем кратковременного центрифугирования (Бэкман, микроцентрифуга серии Е) перед считыванием поглощения. Поглощение использовали в уравнении скорости псевдопервого порядка и рассчитывали путем деления этого подогнанного значения на концентрацию фермента (программа "Мультифит 2,0 Подгонка Кривой" для компьютера Эппл Макинтош, Day Computing P.O. Box 327, Милтон, Кембридж, СВ4 6 WL, Великобритания (1990). рН -зависимость и стабильность. Оптимальный уровень рН и стабильность растворимого фермента сравнива последовательных дней (см. фиг. 3 и табл. ли с этими характеристиками CLEC-термолизина посредством расщепления ди10). CLEC-термолизин сохраняет максипептидного субстрата FAGLA. Результаты мальную активность после пятидневного показаны на фиг. 2 и в табл. 9. Как инкубирования при повышенной темперарастворимый, так и кристаллический фер- 5 туре. Напротив, растворимый термолизин мент продемонстрировали максимальную теряет 5 0 % своей исходной активности активность при рН 7,0. CLEC и растворипосле всего лишь двух часов инкубировамый термолизин также продемонстрирония, и демонстрирует незначительную аквали сходную активность в кислом диапативность после 24-часового инкубировазоне, и колоколообразный рН-профиль, по- 10 ния при 65°С. лученный у растворимого фермента, хоАктивность растворимого и CLEC-террошо согласовался с опубликованными молизина измеряли после его инкубироданными (Федер и Щук, Biochemistry 9: вания при 60°С. Растворимый термолизин 2784-2791 (1970). Однако, в щелочном инкубировали в 10 мМ ацетате кальция, диапазоне кристаллический фермент сох- 15 50 мМ Трис с рН 7,0 в водяной фане 65°С. раняет максимальную активность до рН Реакционный объем составлял 500 мкл. 10,0, тогда как растворимый фермент Конечная концентрация белка составляла имеет 75%-ную активность при рН 8,5, и 10 мг/мл. Аликвоты брали через 0, 1 , 2 , только 25%-ную активность при рН 9. При 4, 6, 10 и 18 часов. Образцы исследовали рН 9,5 растворимый фермент совершенно 20 SDS-PAGE или расщеплением FAGLA при не активен. комнатной температуре, как описано выСтабильность при повышенных темпеше. Для CLEC-термолизина, 250 мкл сусратурах пензии кристаллов в 10 мМ ацетата кальция и 50 мМ Трис также инкубировали в При осуществлении определенных химических процессов при более высоких 25 65°С водяной бане. Активность исследотемпературах могут быть достигнуты бовали через 0, 1 , 6 , 24, 48, 72, 96 и 120 лее высокие скорости реакции и более часов посредством FAGLA-расщепления. короткое время диффузии для субстратов Резистентность к экзогенному протеои продуктов. Однако, при ферментном кализу тализе на температуру проводимого про- 30 Также проводили оценку резистентцесса на практике накладывается ограниности CLEC-термолизина к действию экзочение, связанное с утратой ферментом генной протеазы. SDS-PAGE анализ его активности. Дополнительная стабили(электрофорез на полиакриламидном гезация, достигнутая у CLEC, позволяет им ле с додецилсульфатом натрия) предпопроявлять ферментативную активность при 35 лагает, что коммерческие ферменты мозначительно более высоких температурах, гут содержать значительный процент загчем это возможно для растворимых феррязненных веществ, некоторые из котоментов. рых могут обладать протеолитической акПовышенная стабильность при более тивностью против основных видов раствонизких температурах упрощает обычное 40 римых ферментов. Имея упаковку моледолговременное хранение CLEC-катализакул фермента в кристаллическую решетторов. Например, растворы растворимого ку, можно предположить, что внутренние термолизина, концентрированные до бомолекулы фермента у CLEC будут защилее чем 50 мг/мл, необходимо хранить щены от протеолиза. Чтобы проверить эту при -80°С, чтобы сохранить максималь- 45 возможность, CLEC-термолизин и препаную ферментативную активность. При комрат растворимого фермента инкубированатной температуре активность обычно утли в присутствии стрептококковой протеарачивается в течение дня. Напротив, резы, -проназы, -неспецифичной протеазы, гидратированный CLEC-термолизин может способной переваривать большинство белхраниться обычным образом при комнат- 50 ков до свободных аминокислот (Каталог ной температуре в течение месяцев без 1990, CaJbiochem; La Jolla, Канада). заметной потери активности. ПредставРастворимый и CLEC-термолизин инляется, что невосстановленный лиофиликубировали в 50 мМ Трис с рН 7,5 при зированный CLEC-термолизин может сох40°С в присутствии проназы (Калбиохем). ранять жизнеспособность в течение неог- 55 Соотношение проназы и термолизина сосраниченных периодов времени. тавляло 1:40. Для ингибирования автолиза Температурная стабильность и резистермолизина и предотвращения протеотентность к автолизу были продемонстрилитического разрушения проназы терморованы у CLEC-термолизина после инкулизином, к реакционной среде растворибирования его при 65°С в течение пяти мого фермента добавляли EDTA до ее 45 27035 конечной концентрации 100 мМ (EDTA ингибирует активность термолизина, ио не проназы). В указанное время из реакционной смеси брали аликвоты и исследовали спектрофотометрически активность 5 фермента путем расщепления дипептидного субстрата Fagla. Чтобы устранить ингибирование термолизина присутствием EDTA, спектрофотометрическое исследование активности растворимого фермента 10 осуществляли в 0,5 М кальциево-ацетатном буфере с рН 7,0, и концентрацию фермента повышали вдвое. Структурированный кристаллический фермент исследовали, как было описано выше. 15 Как можно видеть из фиг. 4 и табл. 11, растворимый термолизин быстро разрушался и терял всю свою активность через 90 минут инкубирования. Напротив, активность CLEC-термолизина осталась той 20 же после четырехдневного инкубирования в присутствии протеазы. Эта почти неуязвимость к протеолизу представляет особый интерес в диагностических применениях биосенсорного типа, когда может пот- 25 ребоваться работа подходящего CLEC в присутствии неизвестного коктейля встречающихся в природе протеолитических ферментов. Стабильность в присутствии органи- 30 ческого растворителя Для того чтобы ферменты приобрели идеальную приемлемость в качестве жизнеспособных промышленных катализаторов, они должны быть способны функцио- 35 нировать без избыточного воздействия на фактическую окружающую среду производственных процессов. В частности, эта среда должна включать использование водных, полярных и неполярных органи- 40 ческих растворителей, а также их смесей. В коммерческих применениях, водно-органические смеси растворителей позволяют управлять образованием продукта пу-.тем использования относительной раство- 45 римости продуктов и субстратов. Растворимый термолизин и термолизиновый С1_ЕС проявляют существенно отличающуюся стабильность в присутствии органических растворителей (табл. 12). 50 Концентрации растворимого фермента, которые могли инкубироваться в органическом растворителе, были ограничены до максимум 10 мг/мл. Концентрации выше этого значения приводили к немедленно»55 му осаждению (преципитации) термолизина при добавлении органического растворителя. Напротив, концентрации CLECтермолизина были ограничены только объемом, занимаемым кристаллами. Раст 46 воримый термолизин сохраняет свою наибольшую активность (75%) после инкубирования в ацетоне, и наименьшую (36%) - в тетрагидрофуране. Через один час инкубирования в присутствии ацетонитрила или диоксана, растворимый фермент утрачивает приблизительно 50% своей исходной активности. CLEC-термолизин сохраняет более 95% своей максимальной активности после инкубирования со всеми испытанными органическими растворителями. Стабильность в органических растворителях CLEC-термолизин и препараты растворимого термолизина инкубировали в 50% (об/об) растворах указанных органических растворителей. 100 мкл суспензии CLE^C-термолизина (10 мкг/мл) в 10 мМ Трис рН 7 помещали в стеклянный сосуд емкостью около 2 мл (1/2 dram). Затем к белковому раствору добавляли 100 мл органического растворителя и кратковременно встряхивали. CLEC и растворимый фермент инкубировали в присутствии органического растворителя в течение одного часа при 40°С. После инкубирования активность фермента исследовали посредством расщепления субстрата FAGLA, как уже описано выше. Предпочтительно, низкое содержание воды мешает развертыванию белковой молекулы на промежуточных этапах пути к ее денатурации. У CLEC - это ограничение конформационной мобильности обеспечивается межмолекулярными связями и контактами составляющих фермент молекул, создающих кристаллическую решетку, скорее, чем почти полным отсутствием воды в среде. В результате, промежуточные концентрации водно-органического растворителя легко переносятся ферментами в виде CLEC, что ранее у ферментов не наблюдалось (см. табл. 12). Это открытие открывает целые новые области химии синтеза для их разработки с использованием ферментного катализа. Даже в почти безводных органических растворителях, однако, обычное использование ферментов было затруднено вследствие их тенденции образовывать неопределенные суспензии с проблемами образования комков и других проявлений агрегации. Это свойство делает такие препадаты в сущности непривлекательными для широкомасштабных промышленных процессов. Напротив, CLEC и составляющие ферменты в кристаллической решетке сохраняют монодисперсию во всех этих растворителях. 47 27035 Сравнение с другими методами иммобилизации В литературе было опубликовано несколько полезных обзоров на тему методов иммобилизации [Maugh Т.Н., Science, 223: 474-476 (1984); Tramper J. Trends in Biotechnology 3: 4 5 - 5 0 (1985)1. В этих источниках фермент всегда представляет собой небольшую часть от общего объема иммобилизованных частиц, основную массу которых составляет инертный материал носителя. Носитель увеличивает средний свободный путь между внешней средой растворителя вокруг частиц иммобилизованного фермента и активными сайтами этого фермента, усугубляя диффузионные проблемы (Квиочо и Ричарде, Biochemistry 5: 4062-4076 (1967). У CLEC структурированная матрица кристалла обеспечивает себе свою собственную опору, устраняя необходимость в носителе. В результате, концентрация фермента в CLEC близка к теоретическому пределу загрузки, который может быть достигнут для молекул данного размера, значительно превышая плотности, достижимые даже в концентрированных растворах. Весь CLEC состоит из активного фермента и, таким образом, уменьшается до минимума связанное с проблемами диффузии снижение скорости ферментативной реакции, которое обычно наблюдается с ферментами, иммобилизованными традиционными методами по сравнению с ферментами в растворе (см. фиг. 1), поскольку средний свободный путь для субстрата и продукта между активным ферментом и свободным растворителем будет значительно укорочен у CLEC (по сравнению с частицами носителя с традиционно иммобилизованным ферментом). Важно, что составляющий CLEC фермент является в сущности, монодисперсным, и может быть выделен простыми приемами с CLEC-частицами, такими, как фильтрование, центрифугирование или декантация растворителя. П р и м е р 3. Кристаллизация, структурирование и лиофилизация эластазы, и оценка характеристик получаемого продукта Кристаллизация эластазы Лиофилизированную эластазу из поджелудочной железы свиньи растворяли в 0,1 М ацетат натрия с рН 5,0 до концентрации 5 мг/мл (вес/об) при комнатной температуре. Палочкообразные кристаллы эластазы становились видимыми в течение одной минуты полного растворения белка. Кристаллизационный раствор пе 48 реносили в холодильник с 4°С и оставляли до утра для завершения кристаллизации. Кристаллы выделяли центрифугированием, как уже было описано. 5 Структурирование кристаллов эластазы 200 мкл объема кристаллов эластазы добавляли к 1,3 мл раствора 5,77% глютаральдегида и 1,5 М ацетата натрия с рН 5,0. Кристаллы структурировали в те10 чение одного часа при мягком перемеши• вании (перемешивающая чашка). После структурирования кристаллы промывали тремя объемами по 15 мл 0,2 М Трис с рН 8,0. CLEC-эластазу лиофилизировали 15 как описано в примере 2. Ферментативная активность растворимой и CLEC-эластазы Каталитическую активность растворимой и CLEC-эластазы исследовали 20 спектрофотометрически посредством измерения гидролиза субстрата-сукцинил-/АІа/3 р-нидроанилиді (Bachem) Бит и щ)., Biochem. Med 11: 350-357 (1974) (см. табл. 13, фиг. 5). Расщепление исс25 ледовали по повышению поглощения при 400 нм. Исходная концентрация субстрата составляла 2 х 1 0 4 . Концентрация фермента была 2,8 х Ю"7 М. CLEC или растворимый фермент добавляли к 5 мл реак30 ционному объему, содержащему субстрат в 0,2 Трис с рН 8,0. Как описано выше, CLEC-фермент удаляли из реакционной смеси перед измерением поглощения. Резистентность к экзогенному протео35 лизу Также проводили оценку резистентности CLEC-эластазы к действию протеазы, и при условиях, идентичных тем, которые использовали для термолизина (см. 40 пример 2). Активность растворимого и CLEC-фермента после их инкубирования с протеазой оценивали посредством гидролиза нитроанилидного субстрата, как описано выше (табл. 14 и фиг.6). 45 П р и м е р 4. Кристаллизация, структурирование и лиофилизация эстеразы, и оценка характеристик полученного продукта Кристаллизация эстеразы 50 Как раскрыто в настоящем описании, 30 мг/мл суспензии сульфата аммония эстеразы из печени свиньи (Fluka) растворили в 0,25 М ацетата кальция с рН 5,6 при комнатной температуре. Кристаллы 55 эстеразы становились видимыми через несколько минут после добавления раствора ацетата кальция. Кристаллизационный раствор оставляли стоять при комнатной температуре, и кристаллизацию завершали на следующее утро. Кристаллы 49 27035 выделяли посредством центрифугирования, как описано выше, в примере 2. Структурирование кристаллов эстеразы Как раскрыто здесь, 300 мкл кристаллов эстеразы добавляли к 5 мл раствора из 12,5% глютаральдегида и 0,5 М ацетата натрия с рН 5,5. Кристаллы структурировали в течение одного часа при легком помешивании (перемешивающая чашка). После структурирования кристаллы трижды промывали 15 мл 0,5 М ацетата кальция с рН 6,3. CLEC-эстеразу лиофилизировали как описано выше в примере 2. Ферментативная активность растворимой и CLEC-эстеразы Каталитическую активность растворимой и CLEC-эстеразы оценивали спектрофотометрически посредством мониторинга гидролиза субстрата, -р-нитрофенилацетата (Fluka) (табл. 15 и фиг.7). Расщепление изучали по усилению поглощения при 400 нм. Исходная концентрация субстрата составляла 0,001%. Концентрация фермента была 1 х 10'8 М. CLEC-фермент удаляли из реакционной смеси посредством центрифугирования перед измерением поглощения. Резистентность к экзогенному протеолизу Оценку резистентности CLEC-эстеразы к действию протеазы осуществляли при условиях, идентичных описанным для термолизина в примере 2. Активность растворимого и CLEC-фермента после их инкубирования с протеазой оценивали с помощью гидролиза субстрата, -р-нитрофенилацетата как описано выше (см. табл. 16 и фиг.8). П р и м е р 5. Кристаллизация, структурирование и лиофилизация липазы и оценка характеристик полученного продукта Кристаллизация липазы Как здесь раскрыто, фермент липазу (Geotvichum candrdum) кристаллизовали паровой диффузией из водного раствора 20 мг/мл белка в 5 мМ Трис с рН 7, содержащего 8% сульфата аммония. Кристаллы в виде двойных пирамид становились видимыми через 20-30 дней инкубирования при комнатной температуре. Кристаллы выделяли посредством центрифугирования, как описано выше а примере 2. Структурирование кристаллов липазы Как раскрыто, кристаллы липазы добавляли к раствору 12,5% глютаральдегида и 50 мМ Трис рН 5,6. Кристаллы ст 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 50 руктурировали в течение одного часа. После структурирования кристаллы промывали трижды 15 мл объемами мМ Трис с рН 7,0. CLEC-липазы лиофилизировали, как описано выше в примере 2. Ферментативная активность растворимой и CLEC-липазы Каталитическую активность растворимой и CLEC-липазы исследовали спектрофотометрически путем мониторинга гидролиза субстрата, -р-нитрофенилацетата, (табл. 17 и фиг.9). Расщепление изучали по увеличению поглощения при 400 нм. Исходная концентрация субстрата составляла 0,005%. Концентрация фермента была 1,5 х 10 е М, CLEC или растворимый фермент добавляли в 5 мл объем реакционной среды, содержащей субстрат в 0,2-Трис с рН 7,0 при комнатной температуре. Как описано выше в примере 2, CLEC-фермент удаляли из реакционной смеси и посредством центрифугирования перед измерением поглощения. П р и м е р 6. Кристаллизация, структурирование и лиофилизация лизоцима, и оценка характеристик полученного продукта Кристаллизация лизоцима Следуя методу Блейка с сотр., Nature, 196: 1173 (1962), 200 мг лиофилизированного лизоцима из белка куриного яйца (Берингер, Мангейм) растворяли в 2,5 мл 0,04 М натриево-ацетатном буфере с рН 4,7 при комнатной температуре. После растворения белка, к раствору лизоцима по каплям при помешивании добавляли 2,5 мл 10%-ного хлорида натрия. Кристаллизационный раствор оставляли стоять до утра при комнатной температуре, и кристаллизацию завершили через 48 часов. Кристаллы выделяли посредством центрифугирования, как описано выше в примере 2. Структурирование кристаллов лизоцима Как описано здесь, 500 мкл объем кристаллов лизоцима добавляли к 10 мл 24%-ного глютаральдегида и 50 мМ Трис с рН 5,6, содержащим 20% хлорида натрия. Кристаллы структурировали в течение 20 минут при легком перемешивании (перемешивающая чашка). После структурирования, кристаллы промывали трижды 50 мл объемами 20 М ацетата кальция и 50 мМ хлорида калия с рН 5,3. CLECлизоцим лиофилизировали, как описано выше в примере 2. Ферментативная активность растворимого и CLEC-лизоцима Каталитическую активность растворимого и CLEC-лизоцима исследовали пос 51 27035 редством измерения скорости гидролиза субстрата, -4-метилумбеллиферил- N-ацетил-хитриозида (Fluka) Янг и Хамагучи, J.Biochem, 8: 1003-1014 (1980) (табл. 18 и фиг. 10). Освобождение 4-метилумбеллиферона устанавливали флуорометрически (Perkin Elmer, модель LS-50). Исходная концентрация субстрата составляла 1,42 х 1 0 3 . Концентрация фермента была 3 х 10' 7 , CLEC или растворимый фермент добавляли к 2 мл реакционной среды, содержащей субстрат в 20 мМ ацетата кальция и 50 мМ хлорида кальция с рН 5,3 при 42°С. Количество 4-метилумбеллиферона определяли флуорометрически, путем измерения флуоресценции при 450 нм с возбуждением при 360 нм. Ширина щели как для возбуждения, так и эмиссии была 10 мм. Как описано выше в примере 2, CLEC-фермент удаляли из реакционной смеси посредством центрифугирования перед измерением флуоресценции. П р и м е р 7. Кристаллизация, структурирование и лиофилизация аспарагиназы, и оценка характеристик полученного продукта Кристаллизация аспарагиназы В качестве модификации процедуры, описанной Грабнером и сотр., см. патент США № 3664926 (1972), 25 мг лиофилизированной аспарагиназы (Worthington) 1-аспарагин ос-кетоглютарат 52 растворяли в 500 мл 50 мМ натриевофосфатного буфера с рН 7,2. Раствор охлаждали до 4°С, а рН доводили до 5,0 с помощью 1М уксусной кислоты. Затем 5 к раствору аспарагиназы по каплям добавляли холодный (-20°С) этанол до конечной концентрации 33%. Раствор инкубировали при 4°С. Кристаллизацию завершали через сорок восемь часов. Крис10 таллы выделяли посредством центрифугирования как описано выше. Структурирование кристаллов аспарагиназы Как раскрыто здесь, кристаллы аспа15 рагиназы структурировали в растворе из 7,5% глютаральдегида в 50 мМ натриевофосфатного буфера с рН 5,6. После структурирования кристаллы промывали пять раз 15 мл объемами 5 0 мМ Трис с рН 20 7,0. CLEC-аспарагиназу лиофилизировали, как описано выше в примере 2. Ферментативная активность растворимой и CLEC-аспарагиназы 25 Каталитическую активность растворимой и CLEC-аспарагиназы исследовали спектрофотометрически посредством измерения эволюции иона аммония в сопряженной ферментативной реакции, опи30 сываемой ниже (все реагенты были закуплены у фирмы Берингер Майгейм) (табл. 19 и фиг. 11). аспарагиназа >аспарат + NH 4 + ; NH 4 + + NaDH Глютамат-дегидрогеназа -> глютамовая кислота + NaD + Окисление NaDH измеряли по уменьназы составляла 1 0 7 М. Концентрация асшению поглощения при 340 нм. Исходная парагиназы была 2,3 х 1 0 е М. Как опиконцентрация NaDH составляла 1,4 мг/ сано выше в примере 2, CLEC фермент мл. Концентрация аспарагина была 10~3 удаляли из реакционной смеси посредстМ. Концентрация а-кетоглютарата была 45 вом центрифугирования перед измерением 1 0 4 М. Концентрация глютаматдегидрогепоглощения. 53 27035 54 Т а б л и ц а Микробиальный Фермент или Ссылка (включая биологический источник Апкогольдегидрогеназа 1 упомянутые в тексте) Печень лошади Eklund et al, J Мої ВюІ 146 561-587 (1981) Алкогольоксидаза Pichia pastor»s Boys et al, J Мої Biol 208 211-212 (1989), Tykarska et a l , J Protein Chem 9 83-86(1990) Альдолаза (фруктозо- Мышцы кролика бифосфат) Eagles і» et J Мої Biol 45 al, 533-544 (1969) Heidmer 171 Мышцы теленка et al .Science 677-680(1971) Goryunov et ai, Biofizika 14 1116-1117(1969) Мышцы человека Millar et al, Trans Roy Soc Lond B293 209-214(1981) Drosophiia melanogaster Brenner et al, J Biol Chem 257 11747-11749 (1982) Альдолаза (PKDG) Pseudomonas putida Vandlen Chem et al, 248 J ВюІ 2251-2253 (1973) Щелочная фосфатаза Eschencrna coli Sowadsks et a l , J Мої Bio! 150 245-272(1981) Аспарагиназа Erwinia carotova North et a i , Nature 224 594-595(1969) Eschenchia coli Epp et a l , Eur J Biochem 20 432-437(1971) Eschencrua coti Yones et al ,J Мої ВюІ 110 179-186(1977) Proteus vulgaris Tetsuya et ai Chem (1972) 248 J Biol 7620-7621 55 27035 56 Продолжение табл. 1 Карбо-ангидраза Эритроцит челов.(С) Kannan et al, J.Mol Biol 12: 740-760(1965) Эритроцит челов. (В) Kannan et ai, J.Mol Biol. 63:601-604(1972) Эритроцит кр.рог.скота Carlsson et al., J.Mol.Bioi. 80:373-375(1973) Каталаза Эритроцит лошади Glauser et al., Acia Cryst. 21: 175-177(1966) Micrococcus Lutens Marie et al., J.Мої.Biol 129:675-676(1979) Penicilinum vitate Vainshtein et al., Acia Cryst, A37:C r 29 (1981) Печень кр.рог.скота Eventoff-et al., J.Mol.Biol. 1 Ш 799-801 (1976) Креатин-киназа Сердце кр.рог.скота Gilliland et al., J.Mol.Biol. 170:791-793(1983) Мышцы кролика McPherson, J.Mol.Biol. 81: 83-85(1973) Глютаминаза Actenobacter Wlodawer ghuanimasificans J.Mol.Biol. et al., 99: 295-299 (1975) Pseudomonas 7A Wlodawer et ' al., J.Mol/Biol. 112: 515-519 (1977) Глюкозооксидаза Aspergillus ruger Kalisz et at., J.Mol.Biol. 213:207-209(1990) Э-лактамаза Staphylococcus aureus Mouli et at., Biochem J. 225:167-176(1985) Bacillus cereus Sutton et al., Biochem J. 248:181-188(1987) Лактат-дегидрогеназа Свиная Hackert et al., J.Mol.Biol. 78:665-673(1973) ЦЫПЛЯЧЬИ Pickles et al., J.Mol.Biol. 27035 57 58 Продолжение табл. 1 9 598-600(1964) Акулья Adams et al , J Мої Biol 41' 159-188(1969) Bacillus stearathermophi lus 154:349-353(1982) Geotrachum candidum Липаза Schar et a l , J Мої Biof. Hata et al., J.Biochem. 86 1821-1827(1979) Поджел.железа лошади Lombardo et al., J.Mol.Biol 205:259-262(1989) Mucor meihei Brady et al., Nature 343. 767-770(1990) Поджел.железа челов. Winkler et al., Nature 343: 771-774(1990) Светлячок летающий Люцифераза Green,A A. et al., Biochem Biophys Acta 20: 170 (1956) • Люцифераза Vibrio harveyii Swanson et al., J. Biol. Chem, 260: 1287-1289 (1985) Нитрил-гидратаза BrevibacterumR312 Swanson et al., Biochem. Biophys. Res Commun 139: 1305-1312(1986) Nagasawa et a l , Eur P.chlororaphis B23 Biochem. 162: J 691-698 (1987) Пероксидаза Braithwaite et al., J. Мої. Хрен Корни хрена (тип Е4) BioS. 106: 229-230 (1976) Aibara et al., J.Biochem/ 90:489-496(1981) Хрен японский Morita.Acta Cryst. A28: S52(1979) Пероксидаза (хлорид) Caldaromyces fumago Rubin et al., J/Bol Chem. 257:7768-7769(1982) 27035 59 60 Продолжение табл. 1 Пероксидаза (цитохром) Sarchomyces cerevisae Poulos et al, J/Biol Chem 253 3730-3735(1978) Пероксидаза (глютатион) Эритроциты кр рог скота Ladenstem et a l , J Мої Biol 104 877-882(1979) Субтилизин Bacillus subulis (Novo) Drenth et al, J Мої Biol 28: 543-544 (1967) Bacillus amyiotiquefaciens Wright et a l , Nature 221(BPN1) Bacillus 235-242(1969) . subulhs Petsko et al, J Мої Bio! (Carlsberg) Супероксид дисмутаза 106 453 : 456(1976) Кр. рог. скот Richardson et al, J Biol Chem 2 4 7 : 6368-6369 (1972 Шпинат Morita et a l , J Мої.Biol 86:685-686(1974) Saccharomyces cerevisiae Beem et a l , J Мої Biol Escherichia coli 105327-332(1976) Bacillus Bndgen et al., J Мої Biol stearothermophHIus 105:333-335(1976) Pseudomonas ovalis Yamakura et al, J Biol. Chem 251:4792-4793(1976) Термолизин Mauhews et al, Nature thermoproteolycus Уреаза Bacillus New Biol. 238-37-41(1972) Бобы Sumner J.B., J.Biol Chem 69:435(1925) Ксилозоизомераза Streptomyces rubiginosus Carrell et a l , J Biol Chem 259.3230-3236(1984) Arthrobacter B3728 Akins et al., Biochym Biophys Acta 874 375-377 (1986)