Антиміостатинове антитіло

Реферат: Винахід належить до моноклональних антиміостатинових антитіл, які зв'язують міостатин із більшою перевагою, аніж GDF-11, мають сильну зв'язувальну спорідненість до міостатину і є стійкими до хімічного розкладу. Антитіла за цим винаходом є придатними для лікування або профілактики виснаження м'язів, слабкості, вікової саркопенії, дисфункціональної атрофії та кахексії. UA 98308 C2 (12) UA 98308 C2 UA 98308 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ця заявка на патент претендує на пріоритет попередньої заявки № 60/824498 на патент США, поданої 5 вересня 2006 року. Цей винахід належить до галузі медицини, зокрема, до галузі моноклональних антиміостатинових антитіл. Конкретніше, цей винахід має відношення до антиміостатинових моноклональних антитіл, які зв'язуються з міостатином із більшою перевагою аніж із GDF-11, та є стійкими до білкового розщеплення, та має відношення до застосування цих антитіл для лікування, профілактики або діагностування різних розладів або патологічних станів у ссавців та птахів різних видів. Міостатин, який називають також фактором росту і диференціювання клітин-8 (GDF-8), є членом суперсімейства білків TGF-, що має спільні структурні риси з іншими членами сімейства TGF-. Міостатин експресується головним чином у скелетних м'язах, що розвиваються, та у розвинутих скелетних м'язах і функціонує як негативний регулятор скелетних м'язів. Міостатин може також приймати участь у інших фізіологічних процесах, у тому числі у процесі диференціювання преадипоцитів у адипоцити та опосередковано у гомеостазі глюкози та пригніченні процесу остеогенезу. Фактор росту і диференціювання клітин-11, який називають також GDF-11 або BMP-11, є членом суперсімейства білків TGF-, найбільш гомологічним по відношенню до міостатину. Амінокислотна послідовність зрілих форм людського міостатину і GDF-11 є ідентичною на приблизно 90%; однак GDF-11 експресується у ширшому діапазоні тканин аніж міостатин, у тому числі у пульта зубів, тканині головного мозку, серцевій, нирковій і легеневій тканинах, а також у м'язовій і жировій тканинах. Нещодавно було встановлено, що людський GDF-11 регулює часові вікна, впродовж яких поліпотентні клітини-попередники зберігають компетентність до продукування потомства різних нервових клітин. Існує терапевтична потреба у специфічному пригніченні активності міостатину з мінімальним пригніченням активності інших білків суперсімейства TGF-, зокрема, GDF-11. Окрім того, існує діагностична потреба у антиміостатиновому антитілі, яке є мінімально перехреснореактивним з іншим білком суперсімейства TGF-, зокрема, GDF-11, для точнішого контролювання або визначення рівнів міостатину у зразку. Антиміостатинові антитіла, які зв'язуються з міостатином із більшою перевагою, аніж із GDF-11, розкриті у WO 2005/094446. Гуманізовані моноклональні антитіла, які зв'язуються з міостатином із більшою перевагою аніж із GDF-11, розкриті у WO 2007/044411. Терапевтичні антитіла можуть бути піддані різноманітним реакціям розкладу, наприклад, дезамідуванню або розщепленню, які можуть відбуватись in vivo або під час виготовлення, одержання композицій, зберігання та терапевтичного застосування. Наприклад, залишки аспарагіну (Asn) у антитілах або інших поліпептидах особливо легко розкладаються у водному розчині. Таким чином, існує необхідність у антиміостатиновому антитілі, яке зв'язується з міостатином із більшою перевагою аніж із GDF-11, має сильну спорідненість до зв'язування з -8 міостатином (тобто не більшу за приблизно 3х10 M) і є стійким до хімічного розкладання. Антитіла за цим винаходом зв'язуються з міостатином із більшою перевагою аніж із GDF-11, тобто вони є значно менш реактивними з GDF-11 аніж із міостатином. Антитіло за цим винаходом зв'язує міостатин у щонайменше приблизно 2 рази, 3 рази, 5 разів, 10 разів, 20 разів, 22 рази або 25 разів більше, аніж воно зв'язує GDF-11, за результатами визначення за методами, прийнятими у цій галузі, наприклад, за допомогою конкурентного ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз) або аналізу BIACORE чи KINEXA, для демонстрації більшої спорідненості (тобто нижчого значення KD)) згаданого антитіла до GDF-8 аніж GDF-11. За варіантом, якому віддаєтеся найбільша перевага, рівні зв'язування GDF-H антитілами за цим винаходом, за результатами застосовуваного аналізу зв'язування, не перевищують фонових рівнів. Цей винахід пропонує антиміостатинове моноклональне антитіло, яке зв'язує міостатин із більшою перевагою аніж фактор росту, і диференціювання клітин-11 (GDF-11), де згадане -8 антитіло зв'язує міостатин із спорідненістю, що не перевищує приблизно 3x10 M, і де щонайменше 95% моноклонального антитіла не розщеплюються при зберіганні впродовж одного року при температурі 4C, шести місяців при температурі 25C, двох місяців при температурі 37°С або чотирьох тижнів при температурі 40C у вигляді розчину антитіла. Зразковий розчин антитіла містить 1 мг/мл антитіла за цим винаходом, 10 мМ розчин фосфату, рН 7,4 та 150 мМ розчин NaCl. За варіантом, якому віддається перевага, антитіла за цим винаходом додатково відрізняються тим, що вони мають ІС50 менше ніж 25 нМ у in vitro аналізі міостатину/SBE "репортерної" групи, опис якого наведено у Прикладі 4. За одним із прикладів здійснення антитіло за цим винаходом є стійким до хімічного розкладу, тобто 100%, 99%, 98%, 97%, 96% або 95% антитіл не розщеплюються при зберіганні 1 UA 98308 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 у вигляді розчину антитіла впродовж періоду часу та при температурі, вибраних із групи, яка включає: один рік при температурі 4C, шість місяців при температурі 25°С, два місяці при температурі 37°С та чотири тижні при температурі 40C у вигляді розчину антитіла. Періодом часу та температурою, яким віддають перевагу, є чотири тижні при температурі 40C. За одним із прикладів здійснення антитіла за цим винаходом додатково відрізняються тим, що зв'язують міостатин у межах домену, який стягує амінокислоти 40-64 [ANYCS GECEFVFLQKYPHTHLVHQA (Послідовність № 29) для людини], 43-57 [CSGECEFVFLQKYPH (Послідовність № 30) для людини] або 45-59 [GECEFVFLQKYPHTH (Послідовність № 31) для людини] зрілого міостатину. За іншим прикладом здійснення антитіла за цим винаходом додатково відрізняються тим, що зв'язують поліпептид, який містить амінокислоти 40-64, 43-57 або 45-59 зрілого міостатину. За одним із прикладів здійснення антитіло за цим винаходом містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (HCVR) з послідовністю, яка представлена Послідовністю № 11, і варіабельну ділянку легкого ланцюга (LCVR) з послідовністю, яка представлена послідовністю, вибраною з групи, яку складають Послідовність № 4, Послідовність № 5, Послідовність № 6 та Послідовність № 7. За іншим прикладом здійснення моноклональне антитіло за цим винаходом містить HCVR з послідовністю, яка представлена Послідовністю № 12, і LCVR з послідовністю, вибраною з групи, яку складають Послідовність № 9 та Послідовність № 10. За одним із прикладів здійснення антитіло за цим винаходом містить HCVR та LCVR, де згадана HCVR містить пептид на CDRH1 з послідовністю, яка представлена Послідовністю № 23, пептид на CDRH2 з послідовністю, яка представлена Послідовністю № 25, та пептид на CDRH3 з послідовністю, яка представлена Послідовністю № 27, і де згадана LCVR містить пептид на CDRL1 з послідовністю, яка представлена Послідовністю № 13, пептид на CDRL2 з послідовністю, яка представлена Послідовністю № 14, та пептид на CDRL3 з послідовністю, яка представлена послідовністю, вибраною з групи, яку складають Послідовність № 16, Послідовність № 17, Послідовність № 18 та Послідовність № 19. За іншим прикладом здійснення антитіло за цим винаходом містить HCVR та LCVR, де згадана HCVR містить пептид на CDRH1 з послідовністю, яка представлена Послідовністю № 24, пептид на CDRH2 з послідовністю, яка представлена Послідовністю № 26, та пептид на CDRH3 з послідовністю, яка представлена Послідовністю № 28, і де згадана LCVR містить пептид на CDRL1 з послідовністю, яка представлена Послідовністю № 13, пептид на CDRL2 з послідовністю, яка представлена Послідовністю № 14, та пептид на CDRL3 з послідовністю, яка представлена послідовністю, вибраною з групи, яку складають Послідовність № 21 та Послідовність № 22. За одним із прикладів здійснення антитіло за цим винаходом додатково містить константну ділянку, яка походить із людського геному або геному тварини, вибраної з групи, яку складають домашні тварини, спортивні тварини та сільськогосподарські тварини. За прикладом здійснення, якому віддається більша перевага, антитіло за цим винаходом містить легкий ланцюг з амінокислотною послідовністю, яка представлена Послідовністю № 32, і важкий ланцюг з амінокислотною послідовністю, яка представлена Послідовністю № 33. За іншим прикладом здійснення цей винахід пропонує композицію (наприклад, фармацевтичну композицію), яка містить антитіло за цим винаходом. Композиція за цим винаходом може додатково містити фармацевтично прийнятний носій. У згаданій композиції антитіло за цим винаходом являє собою активний інгредієнт. За варіантом, якому віддається перевага, композиція містить гомогенну або по суті гомогенну популяцію антиміостатинового антитіла за цим винаходом. Композиція для терапевтичного або профілактичного застосування є стерильною, може ліофілізуватись та за варіантом, якому віддається перевага, поставлятись із відповідним розріджувачем. Цей винахід пропонує спосіб пригнічення щонайменше однієї біологічної активності міостатину у тварини, за варіантом, якому віддається перевага, у ссавця або птаха, за варіантом, якому віддається перевага, у людини, що цього потребує, який включає введення терапевтично ефективної кількості або профілактично ефективної кількості антиміостатинового моноклонального антитіла за цим винаходом згаданому ссавцю або птаху. Цей винахід додатково пропонує спосіб збільшення м'язової маси або лікування чи профілактики захворювання, розладу або стану, інтенсивність симптомів якого зменшується завдяки нейтралізації або антагонізуванню біологічної активності міостатину, який включає введення хворому (наприклад, людині), який потребує такого лікування або профілактики, терапевтично або профілактично ефективної кількості антитіла за цим винаходом. Цей винахід пропонує антитіло за цим винаходом для застосування з терапевтичною метою. 2 UA 98308 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід пропонує застосування антитіла за цим винаходом для одержання лікарського засобу для лікування виснаження м'язів, слабкості, вікової саркопенії, атрофії від бездіяльності та кахексії. Цей винахід пропонує застосування антитіла за цим винаходом для одержання лікарського засобу для профілактики виснаження м'язів, слабкості, вікової саркопенії, атрофії від бездіяльності та кахексії. Цей винахід пропонує спосіб лікування виснаження м'язів, слабкості, вікової саркопенії, атрофії від бездіяльності та кахексії у ссавця, за варіантом, якому віддається перевага, у людини, що потребує цього, шляхом введення терапевтично ефективної кількості антитіла за цим винаходом. Цей винахід пропонує спосіб профілактики виснаження м'язів, слабкості, вікової саркопенії, атрофії від бездіяльності та кахексії у ссавця, за варіантом, якому віддається перевага, у людини, що потребує цього, шляхом введення профілактично ефективної кількості антитіла за цим винаходом. Короткий опис фігур На Фіг. 1A показано впорядковане розміщення амінокислотної послідовності зрілої форми людського міостатину і людського GDF-11 із підкресленою антигенною детермінантою Mabs (моноклональні антитіла) 510С2 та C12 і їх варіантів та виділеними жирним шрифтом залишками у межах згаданої антигенної детермінанти, якими відрізняються міостатин і GDF-11. На Фіг. 1B показані антигенні детермінанти, які зв'язуються Mabs 510C2 та С12 і їх варіантами. На Фіг. 2А і Фіг. 2В показані амінокислотні послідовності варіабельних ділянок вихідних Mabs 510C2 та С12, відповідно, а також декількох варіантів, які включають в себе гіперваріабельні та каркасні ділянки. Гіперваріабельні ділянки виділені жирним шрифтом, а варіанти гіперваріабельних ділянок підкреслені. На Фіг. 3 показано впорядковане розміщення амінокислотної послідовності гіперваріабельних ділянок вихідних Mabs 510C2 та C12 і антитіл за цим винаходом. Варіанти виділені жирним шрифтом та підкреслені. На Фіг. 4 показані амінокислотні послідовності легкого ланцюга і важкого ланцюга моноклонального антитіла за цим винаходом, тобто N93H-C12. На Фіг. 5А та Фіг. 5В показано порівняння визначеної за допомогою ELISA зв'язувальної спорідненості певних моноклональних антитіл за цим винаходом зі зв'язувальною спорідненістю їхнього вихідного антитіла. Визначення Вжитий у цьому описі термін "зрілий міостатин" (дивись Послідовність № 1 для людини, миші, пацюка, курки, індика, собаки, коня та свині) означає мономерну або гомодимерну форму білка, який одержали шляхом протеолітичного розщеплення, наприклад, для людей, на Arg 266 пропротеїнової форми міостатину довжиною 375 амінокислот. Вжитий у цьому описі термін "міостатин" означає зрілий міостатин, якщо у цьому описі не вказано інше. Непроцесоване антитіло у тому вигляді, у якому воно існує за природних умов, являє собою молекулу імуноглобуліну, яка складається із чотирьох поліпептидних ланцюгів, двох важких (H) ланцюгів (приблизно 50-70 кДа у непроцесованому вигляді) та двох легких (L) ланцюгів (приблизно 25 кДа у непроцесованому вигляді), взаємозв'язаних дисульфідними зв'язками. Амінокінцева частина кожного ланцюга містить варіабельну ділянку довжиною приблизно 100110 або більше амінокислот, яка відповідає, головним чином, за розпізнавання антигену. На карбоксильному кінці кожного ланцюга знаходиться константна ділянка, яка відповідає, головним чином, за ефекторну функцію. Як відомо у цій галузі, легкі ланцюги підрозділяються на ланцюги типу каппа або типу лямбда і відрізняються конкретною константною ділянкою. Важкий ланцюг кожного типу відрізняється конкретною константною ділянкою, відомою у цій галузі. IgG1 та IgG4 є ізотипами антитіл за цим винаходом, яким віддається перевага. Кожен важкий ланцюг містить N-кінцеву варіабельну ділянку важкого ланцюга (у цьому описі "HCVR") і константну ділянку важкого ланцюга. Константна ділянка важкого ланцюга складається з трьох доменів (CH1, СН2 та СН3) для IgG, IgD та IgA; і чотирьох доменів (CH1, СН2, СН3 та СН4) для IgM та IgE. Кожен легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга (у цьому описі "LCVR") і константну ділянку легкого ланцюга (CL). HCVR та LCVR можуть додатково підрозділятись на гіперваріабельні ділянки, які називають ділянками, що обумовлюють комплементарність (CDR), які перемежовуються більш консервативними ділянками, які називаються каркасними ділянками (FR). Кожна HCVR та LCVR складається з трьох CDR та чотирьох FR, які розміщуються у напрямку від аміно-кінця до карбоксильного кінця таким чином: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, 3 UA 98308 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CDR3 та FR4. У цьому описі 3 CDR важкого ланцюга позначають як "CDRH1, CDRH2 і CDRH3", а 3 CDR легкого ланцюга позначають як "CDRL1, CDRL2 і CDRL3". Гіперваріабельні ділянки (CDR) містять більшість залишків, які вступають до специфічних взаємодій з антигеном. Місцезнаходження амінокислот у кожному домені відповідає добре відомим умовним позначенням [Кебот (Kabat), "Sequences of Proteins of ImmunologicaiInterest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]. Функціональна здатність антитіла до зв'язування конкретного антигену значною мірою обумовлюється шістьма гіперваріабельними ділянками. Термін "антитіло", у відношенні до антиміостатинового моноклонального антитіла за цим винаходом (або просто "моноклональне антитіло за цим винаходом" чи "антитіло за цим винаходом"), вжитий у цьому описі, означає моноклональне антитіло. Термін "моноклональне антитіло" або "Mab", вжитий у цьому описі, означає химерне антитіло, гуманізоване антитіло або повністю людське антитіло, якщо у цьому описі не вказано інше. За варіантом, якому віддається перевага, моноклональне антитіло за цим винаходом існує у гомогенній або по суті гомогенній популяції. Моноклональні антитіла за цим винаходом можна одержати за допомогою гібридомної технології, добре відомої у цій галузі, а також методами рекомбінантних ДНК, методами проявлення у фагах, синтетичними методами або комбінаціями таких методів чи іншими методами, добре відомими у цій галузі. Термін "моноклональне антитіло" означає антитіло, одержане з унікальної копії або клону, у тому числі, наприклад, з будь-якого еукаріотного, прокаріотного або фагового клону, та не означає спосіб, за допомогою якого його продукують. "Моноклональним антитілом" може бути інтактне антитіло (що містить повну або непроцесовану Fc-ділянку), по суті інтактне антитіло або частина чи фрагмент антитіла, що містить антигензв'язувальну ділянку, наприклад, Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент або Р(аb')2фрагмент химерного, гуманізованого чи людського антитіла. Варіабельні ділянки кожної пари легкий/важкий ланцюг утворюють антигензв'язувальні центри антитіла. Отже, інтактне антитіло IgG має два зв'язувальні центри. За виключенням біфункціональних або біспецифічних антитіл, два зв'язувальні центри є однаковими. Вжитий у цьому описі термін "антигензв'язувальний домен", "антигензв'язувальна ділянка" або "антигензв'язувальний фрагмент" у цьому описі взаємозамінно означає ту частину молекули антитіла у межах варіабельної ділянки, яка містить амінокислотні залишки, які взаємодіють з антигеном і наділяють антитіло його специфічністю та спорідненістю до згаданого антигену. Антигензв'язувальний домен антитіла містить каркасні амінокислотні залишки, необхідні для підтримання відповідної конформації антигензв'язувальних залишків. За варіантом, якому віддається перевага, каркасні ділянки антитіл за цим винаходом мають людське походження або по суті людське походження (людське походження на щонайменше 85%, 90%, 95%, 97% або 99%). Окрім того, вжитий у цьому описі термін "моноклональне антитіло" може означати одноланцюговий Fv-фрагмент, який можна одержати шляхом об'єднання ДНК, що кодує LCVR та HCVR, із лінкерною послідовністю. (Дивись Плактан (Pluckthun), The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, том 113, Розенбург (Rosenburg) та Мур (Moore) (редактори), SpringerVerlag, New York, стор. 269-315, 1994). Слід розуміти, що незалежно від того, чи вказуються конкретно фрагменти або домени, вжитий у цьому описі термін "антитіло" означає такі фрагменти або домени, а також одноланцюгові форми. Доти, доки білок зберігає здатність до специфічного або переважного зв'язування своєї гаданої мішені (тобто антигенної детермінанти або антигену), він входить до обсягу терміну "антитіло". "Вихідним" антитілом за цим описом є антитіло, яке кодується амінокислотною послідовністю, яку застосовують для одержання модифікованого антитіла або варіанта. Вихідне антитіло може мати мишачий каркас, але за варіантом, якому віддається перевага, воно має людську каркасну ділянку. Згадане вихідне антитіло може бути мишачим, химерним, гуманізованим або людським антитілом. Термін "модифіковане" або "варіантне" антиміостатинове антитіло означає у цьому описі молекулу, амінокислотна послідовність якої відрізняється від амінокислотної послідовності "вихідного" антиміостатинового антитіла внаслідок додання, делеції та/або заміни одного або декількох амінокислотних залишків послідовності вихідного антитіла. За варіантом здійснення, якому віддається перевага, варіантне антитіло містить одну або декілька амінокислотних замін на гіперваріабельній ділянці, порівняно з вихідним антитілом. Антитіло за цим винаходом (варіантне антитіло) зберігає здатність свого вихідного антитіла до зв'язування з міостатином із більшою перевагою аніж із GDF-11, має зв'язувальну спорідненість до міостатину, подібну до зв'язувальної спорідненості свого вихідного антитіла або кращу за неї, і має властивості стабільності (тобто властивості хімічної стабільності), які перевищують властивості стабільності вихідного антитіла. 4 UA 98308 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "хімічна стабільність" означає здатність протистояти хімічному розкладу, наприклад, розщепленню на пептидному зв'язку ("розщеплення"). Антитіла за цим винаходом, які за словосполученням, яке вживають у цьому описі, є "стійкими до хімічного розкладу", є стійкими до спонтанного розщеплення на пептидному зв'язку і мають підвищену хімічну стабільність порівняно з вихідним антитілом. За варіантом, якому віддається перевага, 100%, 99%, 98%, 97%, 96% або 95% антитіл за цим винаходом є стійкими до хімічного розкладу, тобто не розщеплюються при зберіганні впродовж одного року при температурі 4°С, шести місяців при температурі 25C, двох місяців при температурі 37°С або чотирьох тижнів при температурі 40C у вигляді розчину антитіла. Розчином антитіла є розчин, що застосовується у фармацевтичній композиції антитіла. Розчин антитіла, якому віддається перевага, містить 1 мг/мл антитіла, 10 мМ розчин фосфату, рН 7,4 та 150 мМ розчин NaCl. Модифікованим антиміостатиновим антитілом, яке становить особливий інтерес за цим описом, є антиміостатинове моноклональне антитіло з підвищеною хімічною стабільністю, порівняно із хімічною стабільністю вихідного антитіла, з видаленим лабільним залишком Asn дипептиду Asn-Pro вихідного антитіла, за варіантом, якому віддається перевага, шляхом заміни на природний залишок амінокислоти, за варіантом, якому віддають навіть ще більшу перевагу, шляхом заміни на залишок гістидину (H), серину (S), треоніну (T), аланіну (А) або аргініну (R). Окрім того, таке модифіковане антитіло відрізняється тим, що зв'язується з міостатином із більшою перевагою, аніж із GDF-11, і має значення KD для міостатину менше за приблизно -8 3х10 M, за варіантом, якому віддається перевага, додатково відрізняється тим, що має ІС50 менше ніж 25 нМ у in vitro аналізі міостатину/SBE "репортерної" групи, опис якого наведено у Прикладі 4. Вжитий у цьому описі термін "розщеплений або розщеплення" означає розщеплення пептидного зв'язку антитіла. Сайт розщеплення, який становить особливий інтерес, знаходиться на залишку Asn у складі антитіла, на аміно-кінці або карбоксильному кінці згаданого залишку Asn. Наслідком розщеплення антитіла може бути зниження стабільності та/або зниження або втрата активності білка, або втрата зв'язувальної спорідненості антитіла. Спонтанна модифікація, наслідком якої є розщеплення, може відбутись ex vivo під час одержання терапевтичної композиції, що негативно впливає на процес виготовлення та зберігання фармацевтичного засобу; Більше того, спонтанна модифікація може відбутись in vivo із негативним впливом на ефективність білка або антитіла та тривалість дії. Однак проста заміна амінокислоти на сайті розщеплення на будь-яку іншу амінокислоту може негативно вплинути на бажану біологічну активність антитіла, наприклад, зв'язувальну спорідненість або нейтралізацію. Термін "антигенна детермінанта" означає ту частину молекули, яка може розпізнаватись і зв'язуватись антитілом на одному або декількох антигензв'язувальних доменах антитіла. Антигенні детермінанти часто складаються із хімічно активного поверхневого угруповання молекул, наприклад, амінокислот або бічних ланцюгів цукрів, і мають специфічні об'ємні структурні характеристики, а також специфічні зарядові характеристики. Вжитий у цьому описі термін "антигенна детермінанта" також означає частину поліпептиду, яка має антигенну та/або імуногенну активність у тварини, за варіантом, якому віддається перевага, у ссавця, наприклад, миші або людини. Вжитий у цьому описі термін "антигенна детермінанта" визначається як частина поліпептиду, з якою може специфічно зв'язуватись антитіло, що визначається будь-яким методом, добре відомим у цій галузі, наприклад, традиційними імуноаналізами. Антигенні детермінанти не обов'язково повинні бути імуногенними, однак можуть бути імуногенними. Вжитий у цьому описі термін "імуногенна антигенна детермінанта" визначається як частина поліпептиду, яка викликає гуморальну імунну відповідь у тварини, що визначається будь-яким методом, відомим у цій галузі. (Дивись, наприклад, Гейсен (Geysen) та інші, Proc. Natl. Acad. ScU USA, 81:3998-4002 (1983)). Словосполучення "біологічна властивість" або "біоактивність", "активність" або "біологічна активність", по відношенню до антитіла за цим винаходом, вживаються у цьому описі взаємозамінно і означають (але без обмеження) спорідненість і специфічність антигенної детермінанти/антигену, здатність нейтралізувати або антагонізувати активність міостатину in vivo або in vitro. IC50 У аналізі міостатину/SBE "репортерної" групи, як показано у Прикладі 4 або інших in vitro аналізах активності, in vitro або in vivo стабільність антитіла. Іншими біологічними властивостями антитіла, які піддаються встановленню, є, наприклад, перехресна реактивність (тобто з нелюдськими гомологами пептиду-мішені або загалом з іншими білками чи тканинами) і здатність до збереження високих рівнів експресії білка у клітинах ссавців. Вищезгадані властивості або характеристики можуть спостерігатись або визначатись чи оцінюватись за допомогою визнаних у цій галузі методів, у тому числі (але без обмеження) ELISA, 5 UA 98308 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 конкурентного ELISA, аналізу поверхневого плазмонного резонансу, аналізів нейтралізації in vitro та in vivo без обмеження, зв'язування рецептора, аналізів BIACORE або KINEXA, продукування та/або секреції цитокіну або фактора росту, розвитку кепів шпоркової жаби Хепорш, трансдукції сигналів та імуногістохімії зі зрізами тканин із різних джерел, у тому числі від людини, приматів або будь-якого іншого джерела, потреба в якому може виникнути. Вжитий у цьому описі термін "активність міостатину" означає одну або декілька фізіологічних росторегулювальних або морфогенетичних активностей, пов'язаних з активним білком міостатином. Наприклад, активний міостатин є негативним регулятором маси скелетних м'язів. Активний міостатин може також модулювати продукування м'язоспецифічних ферментів (наприклад, креатинкінази), стимулювати проліферацію міобластів та модулювати диференціацію преадипоцитів у адипоцити. Термін "пригнічувати" або "нейтралізувати", вжитий у цьому описі відносно активності антитіла за цим винаходом, означає здатність значною мірою антагонізувати, пригнічувати, запобігати, стримувати, уповільнювати, переривати, ліквідувати, припиняти, зменшувати або звертати, наприклад, розвиток або тяжкість того, що пригнічується, у тому числі (але без обмеження) біологічної активності. Ступінь пригнічення або нейтралізації за варіантом, якому віддається перевага, становить щонайменше приблизно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% або більше активності за відсутності антитіла. Терміни "індивід", "суб'єкт" і "хворий", вжиті у цьому описі взаємозамінно, означають тварину, за варіантом, якому віддається перевага, ссавців (у тому числі неприматів і приматів) або птахів, у тому числі (але без обмеження) мишей, мавп, людей, сільськогосподарських тварин-ссавців (наприклад, велику рогату худобу, свиней, овець), спортивних тварин-ссавців (наприклад, коней) і хатніх тварин-ссавців (наприклад, собак і кішок); за варіантом, якому віддається перевага, цей термін означає людей. Згаданий термін означає також різні види птахів, у тому числі (але без обмеження) курок та індиків. За певним прикладом здійснення суб'єкт, за варіантом, якому віддається перевага, людина, додатково характеризується захворюванням або розладом чи станом, для якого сприятливим був би знижений рівень або зменшена біологічна активність міостатину. За іншим прикладом здійснення суб'єкт, за варіантом, якому віддається перевага, ссавець, за варіантом, якому віддається перевага, людина, додатково характеризується тим, що знаходиться під загрозою розвитку розладу, захворювання або стану, для якого сприятливим був би знижений рівень міостатину або зменшена біологічна активність міостатину. Визначення характеристик антитіла Цей винахід пропонує антитіло, яке зв'язується з міостатином із більшою перевагою, аніж із GDF-11, та є стійкішим за вихідне антитіло (тобто більш стійким до хімічного розкладу, аніж вихідне антитіло) з одночасним збереженням або поліпшенням зв'язувальної спорідненості до міостатину, порівняно зі зв'язувальною спорідненістю, яка демонструється вихідним антитілом. За одним із прикладів здійснення лабільний залишок Asn на CDRL3 вихідного антитіла, Mab C12 або Mab 510C2, як показано на Фіг. 2, замінений на іншу амінокислоту. Амінокислотними замінами у антитілі за цим винаходом, яким віддають перевагу, є заміни, які: (1) зменшують сприйнятливість до спонтанного хімічного розкладу, тобто розщеплення або дезамідування, та (2) зберігають зв'язувальну спорідненість антиген-антитіло, яка демонструється вихідним антитілом. За одним із прикладів здійснення, якому віддається перевага, залишок Asn на CDRL3 Mab C12 замінений на H або R. За іншим прикладом здійснення, якому віддається перевага, залишок Asn на CDRL3 Mab 510C2 замінений на H, S, T або А. За одним із варіантів здійснення антитіло за цим винаходом є стійким до спонтанного хімічного розкладу, тобто 100%, 99%, 98%, 97%, 96% або 95% антитіл не розщеплюються при зберіганні у вигляді розчину антитіла впродовж періоду часу та при температурі, вибраних із групи, яку складають: один рік при температурі 4C, шість місяців при температурі 25C, два місяці при температурі 37C та чотири тижні при температурі 40C у вигляді розчину антитіла. Розчином антитіла є будь-який розчин, придатний для фармацевтичної композиції, яка містить антитіло. Зразковий розчин антитіла містить 1 мг/мл антитіла, 10 мМ розчин фосфату, рН 7,4 та 150 мМ розчин NaCl. За одним із варіантів здійснення антитіла за цим винаходом додатково відрізняються тим, що мають сильну зв'язувальну спорідненість (KD) до міостатину, тобто меншу за приблизно -8 -8 -9 3х10 M, 1х10 М або 1х10 M, за варіантом, якому віддається перевага, меншу за приблизно -10 -10 9х10 М, 8,7х10 М або за варіантом, якому віддається більша перевага, меншу за приблизно -11 3х10 M. За альтернативним варіантом антитіла за цим винаходом відрізняються KD до -8 -8 -9 -10 міостатину, що не перевищує приблизно 3х10 M, 1х10 M, 1х10 M або 9х10 M, за 6 UA 98308 C2 -10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіантом, якому віддається більша перевага, не перевищує приблизно 8,7x10 M, а за -11 варіантом, якому віддається найбільша перевага, не перевищує приблизно 3х10 M. Зв'язувальна спорідненість антитіла за цим винаходом є подібною до зв'язувальної спорідненості його вихідного антитіла або кращою за неї. За варіантом, якому віддається перевага, антитіла за цим винаходом, які відрізняються сильною зв'язувальною спорідненістю, як описано вище, також мають ІС 50 менше ніж 25 нМ, 20 нМ, 16 нМ, 14 нМ, 10 нМ, 9 нМ, 6 нМ або 5,2 нМ у in vitro аналізі міостатину/SBE "репортерної" групи, опис якого наведено у Прикладі 4. За варіантом, якому віддається перевага, IC50 антитіла за цим винаходом є подібною до IC50 його вихідного антитіла або кращою за неї. Усі антитіла за цим винаходом є значно менш реактивними з GDF-11, аніж із міостатином, тобто вони зв'язують міостатин із більшою перевагою, аніж GDF-11. Антитіла за цим винаходом за варіантом, якому віддається перевага, є химерними, гуманізованими або людськими антитілами або їхніми антигензв'язувальними доменами, і за варіантом, якому віддається перевага, зв'язуються з міостатином у межах ділянки зрілої форми міостатину, яка локалізується у межах амінокислот 40-64, або за варіантом, якому віддається більша перевага, у межах ділянки зрілої форми міостатину, яка локалізується у межах амінокислот 43-57 та/або 45-59. На додаток до цього антитіла за цим винаходом нейтралізують біологічну активність міостатину in vivo або in vitro. Специфічне зв'язування антиміостатинових моноклональних антитіл за цим винаходом дозволяє застосовувати антитіла за цимг винаходом як терапевтичні засоби або профілактичні засоби для пов'язаних із міостатином станів, захворювань або розладів, тобто станів, захворювань або розладів, сприятливим для яких було б зниження рівнів міостатину або антагонізування чи пригнічення біологічної активності міостатину. Окрім того, антитіла за цим винаходом можуть застосовуватись для діагностування або контролювання станів, захворювань або розладів, сприятливим для яких є змінений рівень або біологічна активність міостатину, чи для визначення рівня міостатину у зразку. Антиміостатинові моноклональні антитіла за цим винаходом зв'язують антигенну детермінанту, яка, як було встановлено, локалізується у межах амінокислот 40-64 (Послідовність № 1 для людини) зрілого міостатину, за варіантом, якому віддається перевага, у межах амінокислот 43-57 та/або 45-59 зрілого міостатину. На додаток до цього імуногенна антигенна детермінанта міостатину за цим винаходом локалізується у межах амінокислот 40-64 зрілого міостатину (Послідовність № 1 для людини), за варіантом, якому віддається перевага, у межах амінокислот 43-57 та/або 45-59 зрілого міостатину будь-якого виду ссавців або птахів. Передбачається також, що імуногенна антигенна детермінанта за цим винаходом є також антигенною детермінантою. На додаток до цього залишки міостатину за межами амінокислот 40-64 можуть впливати на конформаційну структуру антигенного домену і, тим самим, змінювати зв'язування антитіла за цим винаходом з антигенною детермінантою. Цим винаходом і терміном "антитіло" або "модифіковане антитіло" охоплюються також одноланцюгові антитіла та химерні, гуманізовані антитіла, а також химерні або CDRтрансплантовані одноланцюгові антитіла тощо, які містять частини, одержані від різних видів. Різні частини цих антитіл можуть об'єднуватись хімічним шляхом за допомогою традиційних методів, синтетичним шляхом або одержуватись у вигляді нескінченного білка за допомогою генно-інженерних методів. Наприклад, для продукування нескінченного білка можуть експресуватись нуклеїнові кислоти, що кодують химерний або гуманізований ланцюг. Крім того, продукуватись можуть також функціональні частини антитіл, у тому числі антигензв'язувальні частини химерних, гуманізованих, людських або одноланцюгових антитіл. Функціональні частини згаданих антитіл зберігають щонайменше одну антигензв'язувальну функцію та/або біологічну функцію чи біологічну активність непроцесованого антитіла, похідними якого вони є. Функціональні частини, яким віддають перевагу, зберігають антигензв'язувальну функцію відповідного непроцесованого антитіла (наприклад, здатність до зв'язування зрілої форми міостатину ссавців). Функціональні частини або фрагменти, яким віддається особлива перевага, зберігають здатність до пригнічення однієї або декількох функцій або біоактивностей, характерних для зрілого міостатину ссавців, наприклад, зв'язувальної активності, сигнальної активності та/або стимуляції клітинної відповіді. Наприклад, за одним із прикладів здійснення функціональна частина або фрагмент може пригнічувати взаємодію зрілого міостатину з одним або декількома з його лігандів та/або може пригнічувати одну або декілька функцій, опосередкованих рецептором. Передбачені за цим винаходом частини або фрагменти антитіл, здатні до зв'язування зрілого міостатину або його частини (за варіантом, якому віддається перевага, у межах амінокислот 40-64, 43-57 та/або 45-59 зрілого міостатину) включають (але без обмеження) Fv, Fab, Fab' та Р(аb')2-фрагменти. Такі фрагменти можуть продукуватись шляхом 7 UA 98308 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ферментативного розщеплення або методами рекомбінантних ДНК. Наприклад, шляхом розщеплення папаїном або пепсином можна одержати Fab- або Р(аb')2-фрагменти, відповідно. Найменшим антигензв'язувальним фрагментом є Fv, який містить HCVR та LCVR домени. Fabфрагмент містить HCVR-CH1 та LCVR-CL домени, ковалентно зв'язані дисульфідним зв'язком між константними ділянками. Для подолання схильності нековалентно зв'язаних HCVR та LCVR доменів у Fv до дисоціації при коекспресії у клітині-хазяїні, може бути сконструйований так званий одноланцюговий (sc) Fv-фрагмент (scFv), у якого гнучкий поліпептид відповідної довжини зв'язує С-кінець HCVR з N-кінцем LCVR або С-кінець LCVR з N-кінцем HCVR. Найпоширенішим лінкером є пептид довжиною у 15 залишків (Gly4Ser)3, однак у цій галузі відомими є також інші лінкери. Антитіла можуть також продукуватись у вигляді різноманітних скорочених форм за допомогою генів антитіл, до яких у 3'-5'-напрямку відносно природного стоп-сайту був введений один або декілька стоп-кодонів. Наприклад, химерний ген, що кодує частину важкого ланцюга F(ab')2, може конструюватись так, щоб включати послідовності ДНК, які кодують CH1 домен і шарнірну ділянку важкого ланцюга. Ідентифікація лабільного(-их) залишку(-ів) Asn Багато методів є доступними для виявлення і кількісного визначення спонтанних модифікацій лабільних залишків Asn у білку, наприклад, антитілі. Дезамідування, модифікація, наслідком якої є перетворення залишку аспарагіну на суміш ізоаспартату та аспартату, що може відіграти роль сигналу для розкладу білка, вводить негативний заряд і змінює масу білка (NH2 у зіставленні з OH, =1 Да) та гідрофобність. Методи відокремлення, у тому числі електронні та хроматографічні методи, наприклад, ізоелектричне фокусування, ізоелектричне фокусування капілярним електрофорезом, електрофорез у гелі сечовини, високоефективна рідинна хроматографія з оберненою фазою, іонообмінна високоефективна рідинна хроматографія та гідрофільна взаємодія, можуть застосовуватись для відокремлення або виділення дезамідованих або розщеплених форм антитіла або білка чи поліпептиду. Іонообмінна хроматографія широко застосовується для виділення дезамідованих білків. Місцезнаходження та ступінь спонтанних модифікацій антитіла або білка чи поліпептиду можуть додатково характеризуватись засобами рідинної хроматографії/мас-спектрометрії та шляхом секвенування N-кінця. Заміна лабільного(-их) залишку(-ів) Asn або інша модифікація антитіл Для видалення, наприклад, шляхом заміни амінокислоти, лабільного залишку Asn з антитіла або іншого білка, лабільний залишок Asn може бути замінений однією амінокислотою. Бажано, щоб заміна амінокислоти не змінювала (тобто негативно) або мінімально змінювала (наприклад, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% або менше) зв'язувальну спорідненість антитіло:антиген. Бажано також, щоб заміна амінокислоти не змінювала (тобто негативно) або мінімально змінювала нейтралізацію антитіла, специфічність антигенної детермінанти або здатність антитіла до зв'язування міостатину з більшою перевагою, аніж GDF-H. ELISA може застосовуватись для визначення впливу окремих амінокислотних замін на зв'язувальну спорідненість антитіла за цим винаходом до міостатину або на його антигенну детермінанту, і дані, одержані за допомогою ELISA, слід порівнювати з даними щодо зв'язування його вихідного антитіла (наприклад, С12 або 510С2) з тим самим антигеном. За альтернативним варіантом для визначення зв'язувальної спорідненості антитіла може застосовуватись аналіз BIACORE ® або KINEXA®. Антитіла за цим винаходом можуть додатково зазнавати мутагенезу (або зазнавати мутагенезу перед видаленням залишку Asn, наявність якого сприяє нестабільності вихідного антитіла), наприклад, у межах гіперваріабельної(-их) ділянки(-ок), для одержання варіантного антитіла з оптимізованою властивістю, яка становить інтерес, наприклад, зв'язувальною спорідненістю, ІС50, специфічністю тощо. Перевагу віддають антитілу за цим винаходом, яке одержали шляхом заміни амінокислоти і у якого щонайменше один амінокислотний залишок молекули вихідного антитіла був видалений, а на його місце вставлений інший залишок. Сайтами найбільшого інтересу для подібного замісного мутагенезу є гіперваріабельні ділянки, однак передбачаються також зміни каркасної ділянки. Зручним способом одержання замісних варіантів є "визрівання спорідненості" із застосуванням проявлення у фагах. Стисло, декілька сайтів гіперваріабельної ділянки піддають мутації для здійснення усіх можливих амінокислотних замін на кожному сайті. Варіанти антитіл, які одержують таким чином, проявляються моновалентним чином із нитчастих фагових частинок як гібриди з продуктом гена III Ml3, які заповнюють кожну частинку. Після цього варіанти з проявленням у фагах перевіряють на їхню біологічну активність (наприклад, зв'язувальну спорідненість, специфічність, ІС50), як розкрито у цьому описі. Для ідентифікації сайтів-кандидатів гіперваріабельної ділянки для модифікації, може здійснюватись мутагенез методом ідентифікації аланіну для ідентифікації залишків гіперваріабельної ділянки, які 8 UA 98308 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 значною мірою сприяють зв'язуванню антигену. За альтернативним варіантом або на додаток до цього сприятливим може бути проведення аналізу кристалічної структури комплексу антигенантитіло для ідентифікації ділянок контактування між антитілом і міостатином. Такі контактні залишки і сусідні залишки є кандидатами на заміну за методами, розробленими за цим винаходом або відомими у цій галузі. За альтернативним варіантом або на додаток до цього неспецифічний мутагенез може здійснюватись на одній або декількох послідовностях гіперваріабельної ділянки на одному або декількох положеннях залишків, коли CDR є функціонально зв'язаною з варіабельною ділянкою або коли CDR є незалежною від іншої послідовності варіабельної ділянки, з подальшим повертанням зміненої CDR у варіабельну ділянку за допомогою методу рекомбінантних ДНК. Після одержання і експресії таких варіантних антитіл панель варіантів піддають перевірці, як описано у цьому описі, і антитіла з найкращими властивостями у одному або декількох відповідних аналізах можуть відбиратись для додаткової розробки. Експресія антитіл Цей винахід спрямовано також на лінії клітин, які експресують антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом або його частину. Одержання і виділення ліній клітин, які продукують моноклональне антитіло за цим винаходом, може здійснюватись за допомогою стандартних методів, відомих у цій галузі. Лініями клітин, яким віддається перевага, є COS (культура клітин яєчника мавпи), CHO (культура клітин яєчника китайського хом'ячка), SP2/0, NSO та дріжджові клітини (які можна одержати із загальнодоступних депозитаріїв, наприклад, ATCC (Американська колекція типових культур), Manassas, штат Вірджинія). Для експресії антитіла за цим винаходом можуть застосовуватись найрізноманітніші експресійні системи-хазяї, у тому числі прокаріотні (бактеріальні) та еукаріотні експресійні системи (наприклад, дріжджі, бакуловірус, рослинні клітини, клітини ссавців та інших тварин, трансгенні тварини та клітини гібридом), а також експресійні системи проявлення у фагах. Прикладом прийнятного бактеріального експресійного вектора є pUC119, і прийнятним еукаріотним експресійним вектором є модифікований вектор pcDNA3.1 з ослабленою системою вибору DHFR (дигідрофолатредуктаза). У цій галузі відомі також інші системи експресії антитіла, які передбачаються цим винаходом. Антитіло за цим винаходом можна одержати шляхом рекомбінантної експресії імуноглобулінових генів легкого і важкого ланцюгів у клітині-хазяїні. Для експресії антитіла рекомбінантним шляхом клітина-хазяїн трансформується, трансдукується, інфікується тощо одним або декількома векторами рекомбінантної експресії, що несуть фрагменти ДНК, які кодують імуноглобулінові легкі та/або важкі ланцюги антитіла, так що згадані легкі та/або важкі ланцюги експресуються у клітині-хазяїні. Важкий ланцюг і легкий ланцюг можуть експресуватись незалежно з різних промоторів, з якими вони функціонально зв'язані, у одному векторі, або за альтернативним варіантом важкий ланцюг і легкий ланцюг можуть експресуватись незалежно з різних промоторів, з якими вони є функціонально зв'язані, у двох векторах - один із них експресує важкий ланцюг, а другий експресує легкий ланцюг. Факультативно важкий ланцюг і легкий ланцюг можуть експресуватись у різних клітинах-хазяях. За варіантом, якому віддається перевага, рекомбінантні антитіла секретуються у середовище, у якому культивують клітинихазяї, з якого антитіла можуть виділятись або очищатись. Стандартні методи рекомбінантних ДНК застосовують для одержання генів важкого і легкого ланцюгів антитіла, включення цих генів до рекомбінантних експресійних векторів і введення цих векторів до клітин-хазяїв. Виділена ДНК, яка кодує HCVR, може бути перетворена на непроцесований ген важкого ланцюга шляхом функціонального зв'язування ДНК, яка кодує HCVR, з іншою молекулою ДНК, яка кодує константні ділянки важкого ланцюга (CH1, СН2 та СН3). Послідовності людських генів константної ділянки важкого ланцюга є відомими у цій галузі. Дивись, наприклад, Кебот (Kabat) та інші, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, публікація NIH № 91-3242 (1991). Фрагменти ДНК для цих ділянок можуть бути одержані, наприклад, шляхом стандартної ПЛР-ампліфікації. Константна ділянка важкого ланцюга може бути константною ділянкою будь-якого типу (наприклад, IgG, IgA, IgE, IgM або IgD), класу (наприклад, IgG1, IgG2, IgG3 та IgG4) або підкласу і будь-яким алотиповим варіантом, як описано у Кебот (дивись вище). За альтернативним варіантом антигензв'язувальним фрагментом може бути Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, Р(аb')2-фрагмент, Fd-фрагмент або одноланцюговий Fv-фрагмент (scFv). Для гена Fab-фрагмента важкого ланцюга ДНК, яка кодує HCVR, може функціонально зв'язуватись з іншою молекулою ДНК, яка кодує лише константну ділянку CH1 важкого ланцюга. Виділена ДНК, яка кодує LCVR, може бути перетворена на непроцесований ген легкого ланцюга (а також ген Fab-фрагмента легкого ланцюга) шляхом функціонального зв'язування 9 UA 98308 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ДНК, яка кодує LCVR, з іншою молекулою ДНК, яка кодує константну ділянку легкого ланцюга, CL. Послідовності людських генів константної ділянки легкого ланцюга відомі у цій галузі. Дивись, наприклад, згадану вище роботу Кебот (Kabat). Фрагменти ДНК для цих ділянок можуть бути одержані шляхом стандартної ПЛР-ампліфікації. Константна ділянка легкого ланцюга може бути константною ділянкою легкого ланцюга типу каппа або лямбда. Для одержання scFv гена фрагменти ДНК, які кодують HCVR і LCVR, функціонально зв'язують з іншим фрагментом, який кодує гнучкий лінкер, наприклад, що кодує амінокислотну послідовність (Gly4-Ser)3, завдяки чому HCVR та LCVR послідовності можуть експресуватись як суміжний безперервний одноланцюговий білок з LCVR та HCVR ділянками, що з'єднуються гнучким лінкером. Для експресії антитіла за цим винаходом ДНК, яка кодує частковий або повномірний легкий та/або важкий ланцюг, одержану так, як було описано вище, вводять у експресійний вектор так, що ген функціонально зв'язується з контрольними послідовностями транскрипції та трансляції. Експресійний вектор та контрольні послідовності експресії вибирають так, щоб вони були сумісними із застосовуваними експресійними клітинами-хазяями. Ген легкого ланцюга антитіла і ген важкого ланцюга антитіла можуть бути введені у окремі вектори, або варіантом, якому віддається більша перевага, обидва гени вводять у один і той самий експресійний вектор. Гени антитіла вводять у експресійний вектор стандартними методами. Крім того, рекомбінантний експресійний вектор може кодувати сигнальний пептид, який полегшує секрецію легкого та/або важкого ланцюга антиміостатинового моноклонального антитіла з клітини-хазяїна. Ген легкого та/або важкого ланцюга антиміостатинового моноклонального антитіла може клонуватись у вектор так, що сигнальний пептид виявляється функціонально зв'язаним у межах рамки зчитування з амінокінцем гена ланцюга антитіла. Згаданий сигнальний пептид може бути імуноглобуліновим сигнальним пептидом або гетерологічним сигнальним пептидом. Окрім гена(-ів) важкого та/або легкого ланцюга антитіла, рекомбінантний експресійний вектор за цим винаходом несе регуляторні послідовності, які контролюють експресію гена(-ів) ланцюга антитіла у клітині-хазяїні. Термін "регуляторна послідовність" означає промотори, енхансери та інші контрольні елементи експресії (наприклад, сигнали поліаденілування), за потребою, які контролюють транскрипцію або трансляцію гена(-ів) ланцюга антитіла. Конструювання експресійного вектора, в тому числі вибір регуляторних послідовностей, може залежати від таких факторів як вибір клітини-хазяїна, яка підлягає трансформуванню, бажаний рівень експресії білка. Послідовностями для експресії клітинами-хазяями ссавців, яким віддається перевага, є вірусні елементи, які забезпечують високі рівні експресії білка у клітинах ссавців, наприклад, промотори та/або енхансери, які одержують із цитомегаловірусу (CMV), вірусу мавп 40 (вірусу SV40), аденовірусу (наприклад, головний пізній промотор аденовірусу (AdMLP)) та поліомавірусу. На додаток до генів важкого та/або легкого ланцюга антитіла і регуляторних послідовностей рекомбінантні експресійні вектори за цим винаходом можуть нести додаткові послідовності, наприклад, послідовності, які регулюють реплікацію вектора у клітинах-хазяях (наприклад, точки початку реплікації), та один або декілька селектовних маркерних генів. Селектовні маркерні гени полегшують селекцію клітин-хазяїв, у які було введено вектор. Наприклад, за варіантом, якому віддається перевага, селектовний маркерний ген наділяє стійкістю до лікарських засобів, наприклад, G418, гігроміцину або метотрексату, клітину-хазяїна, у яку було введено згаданий вектор. Селектовними маркерними генами, яким віддається перевага, є ген дигідрофолатредуктази (DHFR) (для застосування у клітинах-хазяях без DHFR із селекцією/ампліфікацією метотрексатом), пео ген (для G418 селекції) та глютамат-аміак-лігази (GS) у лінії клітин, яким бракує GS (наприклад, NSO) для селекції/ампліфікації. Для експресії легких та/або важких ланцюгів, експресійний(-ні) вектор(-и), що кодує(-ють) важкі та/або легкі ланцюги, вводять до клітини-хазяїна стандартними методами, наприклад, шляхом електропорації, осадження фосфатом кальцію, трансфекції DEAE (діетиламіноетилцелюлоза)-декстрану, трансдукції, інфекції тощо. Незважаючи на теоретичну можливість експресії антитіл за цим винаходом у прокаріотних або еукаріотних клітинах-хазяях, перевагу віддають еукаріотним клітинам, а найбільшу перевагу віддають клітинам-хазяям ссавців, оскільки такі клітини з більшою ймовірністю складають і секретують відповідно укладене і імунологічно активне антитіло. Клітинами-хазяями ссавців для експресії рекомбінантних антитіл за цим винаходом, яким віддається перевага, є клітини яєчника китайського хом'ячка (клітини CHO), клітини мієломи лінії NSO, клітини COS та клітини SP2/0. Якщо рекомбінантні експресійні вектори, які кодують гени антитіла, вводять у клітини-хазяї ссавців, то антитіла продукуються шляхом культивування клітин-хазяїв впродовж періоду часу, достатнього для уможливлення експресії згаданого 10 UA 98308 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 антитіла у клітинах-хазяях, або за варіантом, якому віддається більша перевага, секреції антитіла у культуральне середовище, у якому вирощують клітини-хазяї. Антитіла можуть виділятись із клітини-хазяїна та/або культурального середовища стандартними методами очищення. Клітини-хазяї можуть також застосовуватись для продукування частин або фрагментів інтактних антитіл, наприклад, Fab-фрагментів або scFv молекул, традиційними методами. Фахівцю у цій галузі буде зрозуміло, що у обсяг цього винаходу входять й варіанти вищезгаданих методів. Наприклад, може виникнути необхідність трансфікування клітинихазяїна ДНК, яка кодує легкий ланцюг або важкий ланцюг антитіла за цим винаходом. Метод рекомбінантних ДНК може також застосовуватись для видалення певної частини або усієї ДНК, яка кодує будь-який або обидва (легкий і важкий) ланцюги, яка не є необхідною для зв'язування з міостатином. Молекули, які експресуються такими скороченими молекулами ДНК, також належать до антитіл за цим винаходом. У системі для рекомбінантної експресії антитіла за цим винаходом, якій віддають перевагу, рекомбінантний експресійний вектор, який кодує як важкий ланцюг антитіла так і легкий ланцюг антитіла, вводять у клітини CHO шляхом, наприклад, трансфекції, опосередкованої фосфатом кальцію. У межах рекомбінантного експресійного вектора кожен із генів важкого і легкого ланцюгів антитіла є функціонально зв'язаним з енхансером/промоторним регуляторним елементом для стимулювання високих рівнів транскрипції генів. Рекомбінантний експресійний вектор несе також DHFR ген, який уможливлює селекцію клітин CHO, які були трансфіковані згаданим вектором шляхом селекції/ампліфікації метотрексатом. Селектовані клітини-хазяїтрансформанти культивують для уможливлення експресії важких і легких ланцюгів антитіла, і інтактне антитіло виділяють із культурального середовища. Для одержання рекомбінантного експресійного вектора, трансфекції клітин-хазяїв, селекції трансформантів, культивування клітин-хазяїв та виділення антитіяа з культурального середовища застосовують стандартні методи молекулярної біолога. Антитіла або їхні антигензв'язувальні домени за цим винаходом можуть експресуватись у тварині (наприклад, миші), яка є трансгенною за людськими імуноглобуліновими генами (дивись, наприклад, Тейлор (Taylor) та інші, Nucleic Acids Res., 20:6287-6295, 1992). Варіанти застосування Антитіла за цим винаходом є придатними для терапевтичного, профілактичного, діагностичного та науково-дослідного застосування, як описано у цьому описі. Антитіло за цим винаходом може застосовуватись для діагностування розладу або захворювання, пов'язаного з експресією людського міостатину. Подібним чином антитіло за цим винаходом може застосовуватись у дослідженні для контролювання рівнів міостатину у суб'єкта, якого піддають лікуванню з приводу паталогічного стану, пов'язаного з міостатином. Варіанти терапевтичного застосування антитіла Міостатин відіграє роль у процесі розвитку м'язів та у ряді споріднених розладів або захворювань. У дорослих мРНК міостатину виявляють, головним чином, у скелетних м'язах, хоча менші концентрації знаходять також у жировій тканині і серцевій тканині (Шарма M. (Sharma M.) та інші, /. Cell Physiol, 180:181, 1999). Маса м'язів у мишей з блокованим міостатином у два-три рази перевищує відповідний показник у одноприплідних тварин дикого типу. Збільшена маса м'язів є наслідком гіпертрофії і гіперплазії волокна (Макферрон A. (McPherron A.) та інші, Nature, 387:83-90, 1997 і Чжу C. (Zhu X.) та інші, FEBS Letters, 474:71). Крім того, миші з блокованим міостатином накопичують менше жирового компоненту тіла аніж одноприплідні тварини дикого типу, але виглядають нормальними і здоровими у всіх інших відношеннях. Нещодавно було показано, що міостатин є важливим регулятором адипогенезу (Реббапрагада A. (Rebbapragada A.) та інші, Мої. and Cell Bio., 23:7230-7242, 2003). Крім того, нещодавно у мишей із дефіцитом міостатину дослідили структуру і вміст кісткової тканини (Хемрік М.В. (Hamrick M.W.) та інші, /. Orthopaedic Research, 21:1025, 2003; Хемрік М.В. (Hamrick M.W.) та інші, Calcif. Tissue Int. 71:63, 2002). Отже, композиція, яка містить антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом, може застосовуватись для збільшення м'язової маси, підвищення густини кісткової тканини, зменшення виснаження м'язів або може застосовуватись для лікування чи профілактики патологічних станів, при яких наявність міостатину спричинює або сприяє виникненню небажаних патологічних ефектів, або зниження рівнів міостатину терапевтично сприятливо впливає на ссавців, за варіантом, якому віддається перевага, людей. За варіантом, якому віддається перевага, композиція, яка містить антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом, може застосовуватись для збільшення м'язової маси. 11 UA 98308 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 За варіантом, якому віддається перевага, антитіло за цим винаходом може застосовуватись для лікування або профілактики виснаження м'язів, пошкодження м'язів, хірургічного втручання, відновлення пошкодженого м'язу, слабкості, вікової саркопенії, атрофії від бездіяльності, остеопорозу, остеоартриту, росту і відновлення зв'язок, ожиріння, пригнічення накопичення жирового компоненту тіла, ожиріння, дистрофії м'язів будь-якого типу, міопатії при інтенсивній терапії і реанімації, алкогольної міопатії, кахексії (наприклад, ракової кахексії або спричиненої ВІЛ кахексії, кахексії внаслідок хронічного обструктивного захворювання легень (COPD)5 хронічного захворювання легень, видужання від сепсису, ниркової недостатності, печінкової недостатності, серцевої недостатності або захворювання серця), порушення обміну речовин, післяопікового виснаження м'язів та діабету типу II. За варіантом, якому віддається більша перевага, антитіло за цим винаходом може застосовуватись для лікування або профілактики виснаження м'язів, слабкості, вікової саркопенії, атрофії від бездіяльності та кахексії. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, антитіло за цим винаходом може застосовуватись для лікування або профілактики атрофії від бездіяльності або кахексії. Атрофія від бездіяльності може бути наслідком численних причин або випадків, у тому числі будь-якого розладу, захворювання або стану, що обумовлює тривалу непорушність, бездіяльність або постільний режим, у тому числі (але без обмеження) трансплантації органів, які не мають порожнин, протезування суглобів, інсульту, пошкодження спинного мозку, видужання від тяжкого опіку, стаціонарного хронічного гемодіалізу, видужання після сепсису та впливу зменшеної сили тяжіння. Оскільки послідовність і функція міостатину є висококонсервативними у різних видів тварин, антитіла за цим винаходом можуть застосовуватись для збільшення м'язової маси, підвищення густини кісткової тканини або лікування чи профілактики станів у ссавців, окрім людини, чи птахів різних видів [наприклад, домашніх тварин (наприклад, собак і кішок), спортивних тварин (наприклад, коней), сільськогосподарських тварин (наприклад, великої рогатої худоби, свиней і овець), птахів різних видів (наприклад, курок, індиків, інших мисливських або домашніх птахів)], де наявність міостатину спричинює або сприяє виникненню небажаних патологічних ефектів або зниження рівнів міостатину чинить терапевтично сприятливу дію. Цим винаходом передбачається застосування антиміостатинового моноклонального антитіла за цим винаходом для лікування або профілактики щонайменше одного з вищезгаданих розладів, при якому активність міостатину є шкідливою, або сприятливим для якого є зниження рівнів біоактивного міостатину. Крім того, передбачається застосування антиміостатинового моноклонального антитіла за цим винаходом при виготовленні лікарського засобу для лікування щонайменше одного з вищезгаданих розладів. Вжиті у цьому описі терміни "лікування", "лікувати" тощо означають досягнення бажаного фармакологічного та/або фізіологічного ефекту. Згаданий ефект може бути терапевтичним з точки зору часткового або повного вилікування від захворювання та/або позбавлення від негативного впливу, пов'язаного із захворюванням. Вжитий у цьому описі термін "лікування" означає введення сполуки за цим винаходом для лікування захворювання або патологічного стану у ссавця, зокрема, у людини, і включає: (а) пригнічення захворювання, тобто припинення його розвитку; і (с) полегшення симптомів захворювання, тобто спричинення зворотного розвитку захворювання або розладу чи полегшення його симптомів або ускладнень. Схеми приймання лікарського засобу можуть підбиратись так, щоб забезпечити оптимальну бажану реакцію. Вжитий у цьому описі термін "профілактика" означає повну або часткову профілактику захворювання або його симптомів. Вжитий у цьому описі термін "профілактика" означає введення сполуки за цим винаходом для профілактики виникнення захворювання у суб'єкта, що є схильним до згаданого захворювання, але який ще не був діагностований як такий, що має згадане захворювання. Композиція Антитіло за цим винаходом може включатись до складу фармацевтичних композицій, придатних для введення суб'єкту. Сполуки за цим винаходом можуть вводитись самостійно або у поєднанні із фармацевтично прийнятним носієм, розріджувачем та/або наповнювачами у вигляді одно- чи багаторазових доз. Композиції для введення розробляються так, щоб бути придатними для вибраного способу введення, і відповідним чином застосовуються фармацевтично прийнятні розріджувачі, носій, та/або наповнювачі, наприклад, диспергувальні речовини, буфери, поверхнево-активні речовини, консерванти, солюбілізатори, засоби регулювання ізотонічності, стабілізатори тощо. Згадані композиції розробляються за традиційними методами, опис яких наведено, наприклад, у довіднику Remington. The Science th and Practice of Pharmacy, 19 edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, штат 12 UA 98308 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Пенсільванія, 1995, який надає стислий опис способів одержання лікарських форм, які є загальновідомими лікарям-практикам. Композиція за цим винаходом за варіантом, якому віддається перевага, являє собою "терапевтично ефективну кількість" або "профілактично ефективну кількість" антитіла за цим винаходом. Термін "терапевтично ефективна кількість" означає кількість, ефективну у дозах та впродовж періодів часу, необхідних для досягнення бажаного терапевтичного результату. Терапевтично ефективна кількість антитіла може змінюватись у залежності від таких факторів, як стан захворювання, вік, стать і маса пацієнта, та здатність антитіла або частини антитіла до викликання бажаної реакції у пацієнта. Терапевтично ефективною кількістю є також кількість, при якій будь-яка токсична або шкідлива дія антитіла переважається його терапевтично сприятливою дією. Термін "профілактично ефективна кількість" означає кількість, ефективну у дозах та впродовж періодів часу, необхідних для досягнення бажаного профілактичного результату. Як правило, оскільки профілактична доза застосовується у суб'єктів перед або на початковій стадії захворювання, то профілактично ефективна кількість може бути меншою аніж терапевтично ефективна кількість. Терапевтично ефективна або профілактично ефективна кількість є принаймні мінімальною дозою, але меншою за токсичну дозу, активного засобу, яка є необхідною для справляння терапевтично сприятливої дії на пацієнта. Інакше кажучи, терапевтично ефективною кількістю антитіла за цим винаходом є кількість, яка у ссавців, за варіантом, якому віддається перевага, людей, збільшує м'язову масу, підвищує густину кісткової тканини або лікує стани, при яких наявність міостатину спричинює або сприяє виникненню небажаних патологічних ефектів або зниження рівнів міостатину терапевтично сприятливо впливає на ссавця, за варіантом, якому віддається перевага, людини, у тому числі (але без обмеження) при виснаженні м'язів, пошкодженні м'язів, хірургічному втручанні, слабкості, віковій саркопенії, атрофії від бездіяльності, остеопорозі, остеоартриті, рості і відновленні зв'язок, ожирінні, пригніченні накопичення жирового компонента тіла, дистрофії м'язів будь-якого типу, міопатії при інтенсивній терапії і реанімації, кахексії (наприклад, раковій кахексії або спричиненій ВІЛ кахексії, кахексії унаслідок хронічного обструктивного захворювання легень, нирковій недостатності, печінковій недостатності, серцевій недостатності або захворюванні серця), порушенні обміну речовин та діабеті типу II. Атрофія від бездіяльності може бути наслідком численних причин або випадків, у тому числі будь-якого розладу, захворювання або патологічного стану, який обумовлює тривалу непорушність, бездіяльність або постільний режим, у тому числі (але без обмеження) трансплантації органів, які не мають порожнин, протезування суглобів, інсульту, пошкодження спинного мозку, видужання від тяжкого опіку, стаціонарного хронічного гемодіалізу, видужання після сепсису та впливу зменшеної сили тяжіння. Шлях введення антитіла за цим винаходом є парентеральним. За варіантом, якому віддається перевага, антитіла за цим винаходом можуть включатись до складу фармацевтичної композиції, придатної для парентерального введення. Вжитий у цьому описі термін "парентеральне введення" означає внутрішньовенне, внутрішньом'язове, підшкірне, ректальне, вагінальне або внутрішньоочеревинне введення. Перевагу віддають периферичній системній доставці шляхом внутрішньовенного, внутрішньоочеревинного або підшкірного введення. Придатні носії для таких видів введення є відомими у цій галузі. Як правило, композиція повинна бути стерильною і стійкою за умов виготовлення і зберігання у наданому контейнері, у тому числі, наприклад, герметичному флаконі або шприці. Отже композиції можуть фільтруватись за стерильних умов після їх виготовлення, або їхня мікробіологічна прийнятність повинна забезпечуватись іншими способами. Типова композиція для внутрішньовенного вливання повинна містити 20-1000 мл рідини, наприклад, стерильного розчину Рінгера, фізіологічного розчину, розчину декстрози, розчину Хенкса, і терапевтично ефективну дозу (наприклад, від 1 мг до 1000 мг) концентрації антитіла. Доза може змінюватись у залежності від типу і тяжкості захворювання. Як добре відомо у галузі медицини, дози для будь-якого суб'єкта залежать від багатьох факторів, у тому числі розміру хворого, площі поверхні тіла, віку, конкретної сполуки, призначеної для введення, статі, часу і шляху введення, загального стану здоров'я та інших лікарських засобів, які вводяться одночасно. Типова доза може бути, наприклад, у межах від 1 мг до 1000 мг; однак передбачаються дози, які є меншими або більшими за цей зразковий діапазон, особливо приймаючи до уваги вищезгадані фактори. За типовою схемою приймання може передбачатись щоденне, щотижневе введення лікарського засобу, введення лікарського засобу двічі на тиждень або щомісячне введення лікарського засобу. За типовою схемою приймання лікарського засобу парентеральна доза може становити від приблизно 10 мкг/кг до приблизно 20 мг/кг загальної маси тіла, за варіантом, якому 13 UA 98308 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 віддається перевага, від приблизно 20 мкг/кг до приблизно 10 мг/кг. Розвиток може контролюватись шляхом періодичних досліджень. Для повторних введень у залежності від стану лікування може повторюватися доти, доки не відбудеться бажане пригнічення симптомів захворювання або бажана профілактика симптомів захворювання. Однак придатними можуть бути інші схеми приймання лікарського засобу, які не виключаються з цього винаходу. Ці запропоновані кількості антитіла у більшості випадків визначає лікар на власний розсуд. Ключовим фактором у виборі відповідної дози і схеми застосування лікарського засобу є одержаний результат. Факторами, які повинні прийматись до уваги у цьому контексті, є конкретний розлад, який піддають лікуванню, конкретний ссавець, який зазнає лікування, клінічний стан окремого конкретного хворого, причина захворювання, місце введення антитіла, конкретний тип антитіла, спосіб введення, схема застосування та інші фактори, відомі лікарямпрактикам. Терапевтичні засоби за цим винаходом можуть заморожуватись або ліофілізуватись для зберігання та відновлюватись у прийнятному стерильному носії перед застосуванням. Наслідком ліофілізації і відновлення може бути втрата активності антитіла різного ступеню. Дози повинні регулюватись для компенсації можливої втрати активності. Загалом перевагу віддають рН у межах 6-8. Готові вироби За іншим прикладом здійснення цього винаходу пропонується готовий виріб, який вміщує речовини, придатні для лікування або профілактики розладів або станів, опис яких наведено вище. Готовий виріб включає в себе контейнер і етикетку. Прийнятними контейнерами є, наприклад, флакони, ампули, шприци і пробірки. Контейнери можуть виготовлятись із різноманітних матеріалів, наприклад, скла або пластику. Контейнер вміщує композицію за цим винаходом, яка є ефективною для профілактики або лікування розладу чи патологічного стану, і може мати стерильний вхідний отвір (наприклад, контейнер може бути пластиковим пакетом із розчином для внутрішньовенного введення або флаконом із пробкою, яку проколюють голкою для підшкірних ін'єкцій). Активною речовиною у згаданій композиції є антиміостатинове антитіло за цим винаходом. На етикетці, яка розміщується на контейнері або додається до нього, зазначається, що композиція застосовується для лікування відповідного патологічного стану. Готовий виріб може додатково включати в себе другий контейнер, який вміщує фармацевтично прийнятний буфер, наприклад, фосфатно-сольовий буферний розчин, розчин Рінгера і розчин декстрози. Він може додатково включати в себе інші матеріали або елементи, необхідні з комерційної точки зору або точки зору споживача, у тому числіінші буфери, розріджувачі, фільтри, голки, шприци і пакувальні вкладки з інструкціями для застосування. Наведені нижче приклади пропонуються лише з ілюстративними цілями і не призначені для будь-якого обмеження обсягу цього винаходу. ПРИКЛАДИ Приклад 1: Ідентифікація сайту розщеплення на Mabs C12 та 510С2 Розчини антитіл (1 мг/мл) за різних умов забуферення (10 мМ розчин цитрату, рН 5, 10 мМ розчин цитрату, рН 6, 10 мМ розчин цитрату, рН 7 та 10 мМ розчин цитрату/150 мМ розчин NaCl, рН 7) інкубують при різних температурах (-20C, 4°С, 25C та 40C) впродовж 4 тижнів. Після завершення інкубування характеристики зразків визначають засобами електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію. Для антитіл, які містять змінний домен G12 або 510С2 (у численних Fc-ізотипів), окрім очікуваних смуг для важких і легких ланцюгів антитіла, наявні додаткові смуги. Ці смуги наявні лише для зразків, які інкубуються при рН 7 (з NaCl або без нього); у відновних умовах наявні дві смуги з приєднаними масами ~8-10 кДа та - 12-14 кДа, а у невідновних умовах наявна одна смуга з приєднаною масою ~8-10 кДа. Виявляється, що ступінь розщеплення, який визначається за відносною інтенсивністю цих смуг, є залежним від рН (оскільки інтенсивність смуг є меншою при інкубуванні зразків при рН 6 і непомітною при інкубуванні зразків при рН 5) та від температури. З метою визначення місцезнаходження розщеплення та кількісного визначення ступеня розщеплення додаткове визначення характеристик таких самих розчинів антитіл здійснюють засобами рідинного хроматографування/мас-спектрометрії та шляхом секвенування N-кінця. Аналіз зразків засобами рідинного хроматографування/мас-спектрометрії здійснюють таким чином. Для часткового відновлення антитіл 4 мкл кожного зразка змішують із 36 мкл води. Після цього 15 мкл кожного розчину змішують з 0,5 мкл 3 M буферного розчину трис-НСІ, рН 8,0, 0,5 мкл розчину 50 мкг/мл дитіотреїтолу (DTT) та 45 мкл води. Обидва розчини кожного зразка аналізують засобами рідинного хроматографування/мас-спектрометрії. Для деглікозилування антитіла 3 мкл кожного зразка змішують з 60 мкл води, 1,0 мкл З M буферного розчину трисНСІ, рН 8,0 та 1,0 мкл розчину PNGase F (компанія PROZYME®, 1 Од/мл). Розчини інкубують 14 UA 98308 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 при температурі 37°С впродовж 6 год, після чого аналізують засобами рідинного хроматографування/мас-спектрометрії. Для повної трипсинізації 20 мкл кожного зразка ліофілізують досуха у системі швидкого вакуумування, після чого відновлюють у 4,5 мкл 7 M розчину гуанідину-НСІ, 0,4 M буферному розчині трис-НС1, рН 8,0 і 0,5 мкл розчину 50 мг/мл DTT. Розчини інкубують при температурі 37C впродовж 40 хв, після чого розбавляють 95 мкл води. Кожен розчин обробляють 2,0 мкл розчину 0,5 мг/мл свинячого трипсину при температурі 37°С впродовж 3 год. Розчини підкислюють оцтовою кислотою, після чого аналізують засобами рідинного хроматографування/мас-спектрометрії або рідинного хроматографування/масспектроскопії/мас-спектрометри. Інтактні, частково відновлені та деглікозиловані зразки аналізують за допомогою хроматографічної системи Waters HPLC/LCT premier або мікромасспектрометра Q-TOF. Параметри високоефективної рідинної хроматографічної системи та масспектрометра регулюють у залежності від зразків та вимог. Розгорнуті мас-спектри антитіла С12, яке інкубували при рН 7 і температурі 40C впродовж чотирьох тижнів, демонструють два піки (з масами 134894 Да та 145116 Да). Різниця мас між ними становить приблизно 10220 Да, що відповідає очікуваній залишковій масі N-кінцевого пептиду 1-93 (очікується: 10221,4 Да) легкого ланцюга. Цей результат підтверджується даними аналізу частково відновлених зразків засобами рідинного хроматографування/масспектрометрії. У цьому зразку виявлено три маси (23312,7 Да, 13091,3 Да та 10239,4 Да), що відповідає інтактному легкому ланцюгу 1-219 (очікується: 23313,1 Да), С-кінцевому пептиду 94219 (очікується: 13091,6 Да) та N-кінцевому пептиду 1-93 (очікується: 10239,4 Да) легкого ланцюга. По суті ідентичні результати одержали також з антитілом 510С2, хоча для цього антитіла відносна кількість розщеплених продуктів є меншою. У Таблиці 1 узагальнюється відсоток розщепленого легкого ланцюга, визначений при проведенні аналізу частково відновлених зразків. Для визначення характеристик інкубованих зразків вдаються також до N-кінцевого секвенування. Автоматизований деградаційний аналіз амінокислотної послідовності за Едманом здійснюють на зразках, внесених у капсулу для підготовки зразків компанії PROSORB® із застосуванням методу газової фази (GP-PVDF) компанії Applied Biosystem Inc. (ABI). Кожен залишок аналізують на колонці sphere-5 PTH 220x2,1 мм ABI BROWNLEE® при температурі 55°С і швидкості потоку 325 мкл/хв. Дані аналізують за допомогою програми для аналізу даних ABI's Model 610A. У зразках антитіл, інкубованих при температурі 40C, наявні дві послідовності; для С12 двома наявними послідовностями є "DIQMTQ" (Послідовність № 34), яка відповідає очікуваному N-кінцю легкого ланцюга C12, та "PLTFGG" (Послідовність № 35), яка відповідає залишкам 94-99 легкого ланцюга С12. Ідентичні результати одержали при аналізі інкубованих розчинів антитіла 510С2. Об'єм розщепленого продукту обчислюють із застосуванням відносних кількостей кожної послідовності, і результати узагальнюються у Таблиці 1. Приклад 2: Видалення сайту хімічного розщеплення антитіл С12 та 510С2 Для видалення сайту розщеплення на С12 та 510С2 здійснюють поодинокі амінокислотні заміни кожної окремої амінокислоти для заміни залишку аспарагіну на CDRL3 обох моноклональних антитіл. ELISA застосовують для визначення впливу заміни окремих амінокислот на спорідненість до міостатину, у порівнянні з Fab-фрагментами С12 або 510С2. Планшети для проведення ELISA сенсибілізують міостатином, розбавленим до 4 мкг/мл у карбонатному буфері (50 мМ розчин NaHCO3, рН 8,3), і до кожної лунки вносять 50 мкл. Планшети обгортають ущільнювальною стрічкою та інкубують впродовж ночі при температурі 4°С. Після цього планшети (планшети з U-подібним дном, компанія Greiner, каталожний номер 650061) тричі промивають фосфатно-сольовим буферним розчином (PBS-T) (0,1% твін-20), за 15 UA 98308 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 допомогою автоматичної машини для миття планшетів. У кожну лунку додають 200 мкл блокувального буфера (PBS (фосфатно-сольовий буферний розчин) + 1% BSA (бичачий сироватковий альбумін) + 0,1% твін-20), та інкубують при кімнатній температурі впродовж 1 год. Планшети промивають, і додають 50 мкл зразка на лунку. Зразки містять заздалегідь одержані Fab-фрагменти, розбавлені розчином PBST/BSA, розпочинаючи з розведення 1:3 з подальшим серійним розведенням напівлогарифмічними стадіями. Планшети промивають, і у кожну лунку додають 50 мкл другого розчину антитіл (1:2000 у PBST/BSA, козяче-антилюдське-каппа-АР, компанія Southern Biotech, каталожний № 2060-04). Після додаткової стадії промивання у кожну лунку додають 100 мкл AP субстрату та інкубують при кімнатній температурі впродовж приблизно 10 хв. Оптичну густину (OD) зчитують при 560 нм. С12 або 510С2 включають до кожного планшета для проведення ELISA як еталонний стандарт спорідненості. Концентрацію Fab-фрагментів визначають за допомогою кількісного ELISA із застосуванням анти-Fd антитіла (овече анти-Fd, компанія Biodesign) для захоплення білка і виявлення козячого анти-людськогокаппа-AP антитіла (компанія Southern Biotech). Очищений стандарт Fab-фрагментів пропускають через кожний планшет для одержання стандартної кривої для визначення концентрацій. Модифіковані Fab-фрагменти, одержані з С12 та 510С2, у яких залишок Asn на CDRL3 замінено на H або R у С12 чи H, S, T або А у 510С2, зберігають спорідненість до міостатину, подібну до спорідненості вихідного Fab-фрагмента, за даними ELISA. Кожна із цих замін дає криві спорідненості (ELISA), подібні до відповідного вихідного Fab-контролю, що визначається подібними значеннями оптичної густини при однаковій концентрації Fab (дивись Фіг. 4). Однак якщо залишок аспарагіну на CDRL3 замінюють на валін, пролін, гліцин, глутамін, триптофан, тирозин, цистеїн, лейцин, ізолейцин, метіонін, фенілаланін, треонін, серин, лізин, аланін, аспарагінову кислоту або глутамінову кислоту у С12 або на аргінін, аспарагінову кислоту, цистеїн, глутамінову кислоту, глутамін, гліцин, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, тирозин, валін, триптофан або пролін у 510С2, кожна із цих замін зменшує зв'язувальну спорідненість модифікованих Fab-фрагментів до міостатину, порівняно зі зв'язувальною спорідненістю вихідного Fab-фрагмента. Крім того, спроби модифікування залишку Pro дипептиду Asn-Pro закінчились невдачею, оскільки усі заміни зменшують зв'язувальну спорідненість модифікованих Fab-фрагментів до міостатину, порівняно зі зв'язувальною спорідненістю вихідного Fab. Приклад 3: Порівняння розщеплення між антитілом С12 і варіантом LC-N93H Розчини антитіл (1 мг/мл у 10 мМ розчині фосфату, рН 7,4/150 мМ розчині NaCl) інкубують при різних температурах (4°С, 25C та 40C) впродовж 4 тижнів. Після завершення інкубування характеристики зразків визначають засобами електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію (SDS-PAGE) та шляхом секвенування N-кінця, як описано вище. У таких умовах при проведенні SDS-PAGE у зразка антитіла C12, який інкубували при температурі 40C, наявні додаткові смуги, окрім очікуваних смуг для важких і легких ланцюгів антитіл; наявні смуги мігрують при -8 кДа у невідновних умовах та при ~8 кДа і 14 кДа у відновних умовах. У протилежність до цього для варіанта LC-N93H додаткових смуг не виявлено. N-кінцеве секвенування інкубованих зразків підтверджує, що у зразка антитіла С12 розщеплення відбувається між Asn93 та Рrо94 на легкому ланцюзі, де -10-20% послідовності відповідає новому N-кінцю (PLTFGG (Послідовність № 35)), у той час як у варіанта LC-N93H додаткової послідовності легкого ланцюга, окрім очікуваного N-кінця, не виявлено. Приклад 4: Аналіз міостатину/SBE "репортерної" групи. У цьому аналізі "репортерної" групи плазміда, що кодує ген люциферази у 5'-3' напрямку відносно SMAD-зв'язувального елемента ("SBE-люцифераза"), конкретніше (CAGA)12, експресує білок люциферази, коли молекула, наприклад, міостатин, GDF-11 або інший член суперсімейства TGF-в зв'язує свій власний рецептор, з ініціюванням тим самим передавання сигналу SMAD, наслідком чого є утворення фосфорилованого комплексу SMAD, який є здатним до зв'язування SBE. Послідовність CAGA являє собою TGF--реагуючу послідовність у межах промотору індукованого TGF- гена PAI-1 (Деннер (Denner) та інші, EMBO J., 17:3091-3100, 1998). Для одержання згаданої плазміди, повторювану послідовність SBE: tcgagagccagacaaaaagccagacatttagccagacactcgagagccagacaaaaagccagacatttagccagacactcgagag ccagacaaaaagccagacatttagccagacactcgagagccagacaaaaagccagacatttagccagacactcgagagccagacaaa aagccagacatttagccagacac (Послідовність № 36) клонують у сайт Nhel -HindIII вектора на основі pGL3 (компанія Promega, каталожний № E1751). Цю плазміду застосовують для тимчасових трансфекцій у клітини НЕК293 EBNA. Визначена кількість світла пропорційна кількості продукованої люциферази, яка пропорційна кількості міостатину, впливу якого зазнають клітини. Наявність інгібітора (наприклад, антитіла, 16 UA 98308 C2 5 10 15 20 25 30 35 що зв'язує міостатин) зменшує кількість міостатину, здатного активувати SBE, наслідком чого зрештою є зменшене продукування світла. У цьому аналізі клітини НЕК293 EBNA (компанія Edge Biosystems) у живильному середовищі DMEM (модифіковане за способом Дульбекко середовище Ігла)/F12 (3:1) (компанія Gibco, каталожний № 93-0152DK), 10% FBS (сироватка плоду корови), 20 мМ розчин ГЕПЕС, 4 мМ розчин L-глутаміну ("живильне середовище повного складу"), висівають із розрахунку приблизно 25000 клітин на лунку на внутрішні, сенсибілізовані полілізином, лунки 96-лункового планшету (компанія BD Biocoat, каталожний № 35-4461) та інкубують впродовж ночі при температурі 37C. Наступного дня клітини промивають PBS, і у кожну лунку додають 50 мкл середовища OptiMEM I (компанія Gibco, каталожний № 31985-070). Клітини трансфікують 50 мкл наведеної нижче суміші SBE-ДНК люциферази: 80 мкл ліпофектаміну (компанія Gibco, каталожний № 11668-019) у поєднанні з 1,5 мл середовища OptiMEM із витримуванням до осадження впродовж 5 хв із подальшим перенесенням у пробірку, у якій об'єднують 20 мкг SBE ДНК люциферази з 1,5 мл середовища OptiMEM і 200 мкл реактиву Plus (компанія Invitrogen), перемішують і витримують до осадження впродовж 5 хв. Після об'єднання двох сумішей розчин енергійно перемішують і витримують з відстоюванням впродовж 30 хв перед доданням 50 мкл цього розчину у кожну лунку ("трансфекційне середовище"). Після цього клітини інкубують впродовж ночі при температурі 37C у 5% CO2. Для кожного планшета з клітинами міостатин (компанія R&D Systems, каталожний номер 788-G8) розбавляють до 20 нг/мл у живильному середовищі повного складу. Кожне антитіло за цим винаходом, призначене для перевірки, титрують у живильному середовищі повного складу, наприклад, від приблизно 40 мкг/мл до приблизно 50 нг/мл. Трансфекційне середовище видаляють з лунок, і додають 50 мкл розведення антитіла на лунку і 50 мкл GDF-8 (міостатину) або GDF-11 (компанія R&D Systems) на лунку. Планшет із клітинами після цього інкубують впродовж ночі при температурі 37°С у 5% CO2. Наступного дня середовище відсмоктують, клітини промивають у PBS, і додають 75 мкл лізисного буфера (компанія Promega, каталожний № Е266А). Активність люциферази у клітинному лізаті визначають за допомогою люциферазного реактиву за інструкціями виробника (компанія Promega, каталожний № Е2620). Люмінесценцію наносять на криву залежності від Logio концентрації Mab (мкг/мл), і обчислюють ІС50 для кожного Mab для міостатину і GDF-11. Моноклональне антитіло С12 та модифіковане моноклональне антитіло, яке є похідним С12 (C12-N93H), при випробуванні за цих умов із міостатином дають значення IC50 приблизно 9,59 нМ та 7,03 нМ, відповідно. Ні С12, ні C12-N93H не демонструвало нейтралізуючої активності у цьому аналізі при перевірці з GDF-11 замість міостатину, що вказує на те, що модифіковане антитіло, подібно до свого вихідного антитіла, зв'язує міостатин із більшою перевагою, аніж GDF-Il. 17 UA 98308 C2 18 UA 98308 C2 19 UA 98308 C2 20 UA 98308 C2 21 UA 98308 C2 22 UA 98308 C2 23 UA 98308 C2 24 UA 98308 C2 25 UA 98308 C2 26 UA 98308 C2 27 UA 98308 C2 28