Молекула днк, яка кодує поліпептид, який зв’язується з внутрішньоклітинним доменом р55 tnf-рецептора, білок та спосіб його продукування

1. Выделенная молекула ДНК, кодирующая полипептид, способный связываться с внутриклеточным доменом р55-ТNF-рецептора, включающая: 2 UA 1 (13) (54) МОЛЕКУЛА ДНК, ЯКА КОДУЄ ПОЛІПЕПТИД, ЯКИЙ ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З ВНУТРІШНЬОКЛІТИННИМ ДОМЕНОМ Р55 TNF-РЕЦЕПТОРА, БІЛОК ТА СПОСІБ ЙОГО ПРОДУКУВАННЯ C2 ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (19) ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ 3 76933 4 остаткам 328-426 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:25. 4. Выделенная молекула ДНК по п.2, кодирующая белок 55.3, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую амонокислотным остаткам 277-426 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:25. 5. Вектор, содержащий последовательность ДНК по п.1. 6. Трансформированная клетка-хозяин, содержащая вектор по п.5. 7. Способ продуцирования белка, его аналога или производного, способных связываться с внутриклеточным доменом р55-ТNF-рецептора, предусматривающий культивирование трансформированных клеток-хозяев по п.6 в условиях, подходящих для экспрессии указанного белка, его аналога или производного; осуществление посттрансляционных модификаций указанного белка, если это необходимо для получения указанного белка; и экстракцию указанного экспрессированного белка, его аналога или производного из среды культивирования указанных трансформированных клеток или из клеточных экстрактов указанных трансформированных клеток. 8. Белок, его аналог или производное, кодируемые ДНК-последовательностью по п.1, причем, указанный белок, его аналог или производное способны связываться с внутриклеточным доменом р55ТNF-R. 9. Белок по п.8, выбранный из группы, включающей белки 55.1, 55.3 и 55.11, и их биологически активные аналоги и производные. 10. Белок по п.9, включающий аминокислотную последовательность белка 55.11. 11. Антитело, обладающее специфичностью по отношению к белку, его аналогам или производным по п.8. 12. Фармацевтическая композиция для модуляции действия лиганда р55-ТNF-R на клетки, содержащая в качестве активного ингредиента белок по п.8 или белок р55IC или р55DD, их биологически активные фрагменты, аналоги, производные или их смеси. 13. Фармацевтическая композиция для модуляции действия лиганда р55-ТNF-R на клетки, содержащая в качестве активного ингредиента рекомбинантный, происходящий от вируса животного, вектор, кодирующий белок, способный связываться с клеточным поверхностным рецептором, и кодирующий белок по п. 8 или белок р55IC или р55DD, их биологически активные фрагменты или анналоги. 14. Фармацевтическая композиция по п.12 для обработки клеток путем индуцирования в них ТNFассоциированных эффектов, содержащая в качестве активного ингредиента р55IC, его фрагмент, аналог или производное, и фармацевтически приемлемый носитель. Настоящее изобретение относится к рецепторам, принадлежащим к суперсемейству рецепторов TNF/NGF, и к регулированию их биологических функций. К суперсемейству рецепторов TNF/NGF принадлежат рецепторы факторов роста некроза опухолей р55- и р75 (TNF-R), рецептор лиганда FAS (называемый также FAS/APO1 или FAS-R, и обозначаемый далее FAS-R) и другие рецепторы. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новым белкам, которые связываются с внутриклеточными доменами (1С) р55- и p75-TNF-R и Fas- R, (обозначаемыми далее р551С, р751С и Fas=1C, соответственно), и которые обладают способностью модулировать функции р55- и р75-TNF-рецепторов, а также Fasрецептора. Одним из таких белков, способных связываться с р551С интактного p55-TNF-R, является сам р551C в виде молекулы р551С или ее части, например, так называемого "домена смерти" р551С. Таким образом, настоящее изобретение также относится к новым TNFассоциированным эффектам, которые могут быть индуцированы в клетках внутриклеточным доменом p55-TNF (p551C) или его частью лиганд (TNF)независимым образом. Кроме того, настоящее изобретение относится к получению и использованию указанных новых белков, связывающихся с р55- и p75-TNF-R, и белков, связывающихся с Fas R, которые в настоящем описании именуются р551С-, р751С- и Fas -1С-связывающими белками. В другом аспекте, настоящее изобретение также относится к новым растворимым олигомерны TNF-R, олигомерным FAS-R и олигомерным рецепторам, представляющим собой смесь TNF-R и FAS-R; к использованию этих рецепторов, и к способам их получения. Фактор некроза опухолей (TNF- ) и лимфотоксин (TNF- ) (обозначаемые далее TNF- и TNF- , соответственно) представляют собой многофунциональные цитокины образуемые, главным образом, мононуклеарными фагоцитами, и обладающие множественным действием на клетку [Wallach, D. (1986), в Interferon 7 (Ion Gresser, eo.), pp.83-122, Academic Press, London; и Beutler S Cerami (1987)]. Действие обоих указанных цитокинов, TNF- и TNF- инициируется посредством их связывания со специфическими рецепторами клеточной поверхности. Очевидно, что некоторые действия этих цитокинов благоприятно влияют на организм, то есть, они могут, например, разрушать опухолевые или вирус-инфицированные клетки и усиливать антибактериальную активность гранулоцитов. В этом случае, TNF обеспечивают защиту организма от опухолей и инфекционных агентов, а также способствует заживлению ран. Таким образом, TNF может быть использован в качестве противоопухолевого агента, который связывается 5 со своими рецепторами на поверхности опухолевых клеток и тем самым инициирует события, приводящие к гибели этих опухолевых клеток. TNF может быть также использован в качестве противоинфекционного средства. Однако, оба эти фактора, т.е., TNF- и TNFобладают также неблагоприятным действием. Было показано, что сверхпродуцирование TNFможет играть важную роль в патогенезе некоторых заболеваний. Так, например, в настоящее время уже известно, что действие TNF- , главным образом на сосудистую сеть органа, вызывает симптомы септического шока [Тrасеу et al., 1986]. При некоторых заболеваниях, TNF может также вызывать резкое снижение массы тела (кахексию) в результате подавления активности адипоцитов и провоцирования анорексии, а поэтому фактор некроза опухолей TNF- имеет также название кахексии) Сообщалось также, что TNF опосредует разрушение тканей при ревматических заболеваниях [Веutler S Cerami, 1987], и является главным медиатором отторжения, наблюдаемого в реакциях "трансплантант против хозяина" [Piquet и др. 1987]. Кроме того, известно, что TNF участвует в процессе воспаления и опосредует многие другие заболевания. Два отличающихся друг от друга и независимо экспрессируемых рецептора p55- и р75-TNF-R, которые специфически связываются с TNF- и TNF- инициируют и/или опосредуют биологические функции вышеуказанных TNF. Эти два рецептора имеют структурно отличающиеся внутриклеточные домены, что позволяет предположить, что они передают разные сигналы [см., Hohnman и др., 1989; Engelmann и др., 1990; Rrockhaus и др., 1990; Leotscher и др., 1990; Schall и др., 1990; Hophar и др., 1990; Smith и др., 1990; и Heller и др., 1990]. Однако, клеточные механизмы, например, различные белки и возможно другие факторы, участвующие в передаче внутриклеточного сигнала р55- и р75-TNF-R, пока еще не выявлены (ниже впервые описываются новые белки, способные связываться с р751С и p551C). Но именно такая передача сигналов, которая происходит обычно после связывания лиганда (т.е. TNF- или TNF- ) с рецептором, ответственна за инициацию каскада реакций, которые, в конце концов, приводят к наблюдаемому клеточному ответу на TNF. Что касается вышеупомянутого цитоцидного действия TNF, то в большинстве клеток, изученных до настоящего времени, это действие стимулируется, главным образом, рецептором p55-TNF. Антитела против внеклеточного домена (домен, связывающийся с лигандом) p55-TNF-R могут сами по себе быть стимуляторами цитоцидного эффекта [см., ЕР 412486], который коррелирует с эффективностью перекрестного связывания рецептора с антителами, и который является, очевидно, первой стадией процесса передачи внутриклеточного сигнала. Кроме того, исследования, проведенные методом мутаций [Brackebuch и др., 1992, Таrtaglia и др., 1993], показали, что биологическая функция p55-TNF-R зависит от целостности eгo внеклеточного домена, что дает основания предположить, что инициация трансдукции внут 76933 6 риклеточного сигнала, индуцирующая цитоцидное действие TNF, происходит в результате объединения двух или нескольких внутриклеточных доменов р55-TNF-R. Кроме того, TNF ( и ) присутствует в виде гомотридимера, и, как было предположено, индуцирует p55-TNF-Rопосредованную передачу внутриклеточных сигналов благодаря своей способности к связыванию и перекрестному сшиванию с рецепторными молекулами, т.е., к созданию агрегации с рецептором. Ниже, в настоящей заявке будет описано, каким образом р551С и р55DD могут ассоциироваться друг с другом, и индуцировать лиганднезависимым способом, TNF-ассоциированные эффекты в клетках. Другим членом суперсемейства TNF/NGFрецепторов является рецептор FAS (FAS-R), который называют также Fas-антигеном, и который представляет собой белок клеточной поверхности, экспрессируемый в различных тканях, и обладающий гомологией с рядом рецепторов клеточной поверхности, включая TNF-R и NGF-R, FAS-R опосредует гибель клеток по типу апоптоза [Iton и др., 1991], и служит, очевидно, в качестве негативного селектора аутореактивных Т-клеток, т.е., в процессе созревания Т-клеток, FAS-R опосредует апоптоз Т-клеток, распознающих аутоантигены. Было также обнаружено, что мутации в гене FASR (1рr) вызывают нарушение лимфопролиферации у мышей, которые имеют сходную с человеческой картину такого аутоиммунного заболевания, как системная красная волчанка (SLE) [WatanabeFukunada и др., 1992]. Лигандом для FAS-R является, очевидно, молекула, ассоциируемая с клеточной поверхностью, и несомая, среди прочих, Тклетками-киллерами (или цитотоксическими Тлимфоцитами - СТL), а поэтому, когда такие СТL контактируют с клетками, несущими FAS-R, они способны индуцировать апоптоз FAS-R-несущих клеток. Кроме того, было получено моноклональное антитело со специфичностью к FAS-R, которое обладало способностью индуцировать апоптоз клеток, несущих FAS-R, включая мышиные клетки, трансформированные кДНК, кодирующей FAS-R человека [Iton и др., 1991]. Было также обнаружено, что помимо Тлимфоцитов, имеются и другие нормальные клетки, которые экспрессируют FAS-R на своей поверхности, и которые могут быть уничтожены путем стимуляции этого рецептора. Было высказано предположение, что, нерегулируемая индукция такого процесса цитолиза приводит, при некоторых заболеваниях, к разрушению тканей организма, например, к деструкции клеток печени при остром гепатите. Поэтому, разработка способов ограничения цитотоксической активности FAS-R может привести к получению методов терапии, имеющих важное значение. И наоборот, поскольку было также обнаружено, что некоторые злокачественные клетки и ВИЧинфицированные клетки несут FAS-R на своей поверхности, то антитела против FAS-R или FASR-лиганда могут быть использованы для стимуляции FAS-R-опосредованных цитотоксических эффектов, что позволит получить средство уничто 7 жения указанных злокачественных или ВИЧинфицированных клеток [см., Ηton и др., 1991]. Кроме того, получение других способов усиления цитотоксической активности PAS-R может также иметь важное терапевтическое значение. Уже давно назрела необходимость в получении способа модуляции клеточного ответа к TNP ( или ) FAS-R-лиганду. Так, например, в патологических процессах, упомянутых выше, где происходит сверхсинтез TNF или FAS-R-лиганда, желательно ингибировать TNF- или FAS-R-лигандиндуцированные цитоцидные эффекты; а в других ситуациях, например, при заживлении ран, желательно стимулировать действие ΤΝF, либо, в случае опухолевых или ВИЧ-инфицированных клеток, желательно стимулировать FAS-Rопосредованный ответ. Авторами настоящего изобретения было разработано несколько способов [см., например, заявку на Европейский патент ЕР 186833, ЕР 308078, ЕР 398327 и ЕР 412486] регулирования нежелательных эффектов TNF путем ингибирования связывания TNF с его рецепторами с помощью антител против TNF или путем использования растворимых TNF-рецепторов (являющихся, в основном, растворимыми внеклеточными доменами рецепторов) для конкурирования на связывание TNF со TNF-рецепторами, ассоциированными с клеточной поверхностью. Кроме того, исходя из того, что для получения ΤNFиндуцированного клеточного ответа необходимо связывание TNF со своими рецепторами, авторами настоящего изобретения были разработаны способы [см., например ЕРО 568925] регулирования действия TNF путем модулирования активности TNF-рецепторов. В частности, [в ЕРО №568925] описан способ модуляции трансдукции сигнала и/или гидролиза в TNF-R, в результате чего пептиды или другие молекулы могут взаимодействовать либо с самим рецептором, либо с эффекторными белками, взаимодействующими с рецептором, осуществляя тем самым, модуляцию нормального функционирования TNF-R. [В ЕРО 568925] также описываются конструирование и характеризация различных мутантных р55-ТNFрецепторов, имеющих мутации во внеклеточном, трансмембранном и внутриклеточном доменах p55-TNF-R. Таким образом, области, находящиеся в вышеуказанных доменах р55-TNF-R, были идентифицированы как главные области функционирования рецептора (т.е. связывания с лигандом TNF) с последующей трансдукцией сигнала и внутриклеточной передачей сигнала, приводящих, в конечном счете, к TNF-эффекту, наблюдаемому на клетках. Кроме того, в этом патенте описан ряд методов выделения и идентификации белков, пептидов и других факторов, которые способны связываться с различными областями в вышеуказанных доменах ΤΝF-R, причем, указанные белки, пептиды и другие факторы могут участвовать в регуляции или модуляции активности TMF-R. В [ЕРО 568925] также раскрываются способы выделения и клонирования ДНК-последовательностей, кодирующих указанные белки и пептиды; способы конструирования экспрессирующих векторов для 76933 8 продуцирования этих белков и пептидов; и способы получения антител или их фрагментов, которые взаимодействуют с TNF-рецепторами или с вышеуказанными белками и пептидами, связывающимися с различными областями THF-R. Однако, в [ЕРО 568925] отсутствуют какие-либо описания белков и пептидов настоящего изобретения, которые связываются с внутриклеточными доменами TNF-R (например, р55-TNF-R), а также отсутствуют какие-либо описания способа выделения и идентификации таких белков или пептидов с использованием дрожжевой двухгибридной системы. Кроме того, до сих пор также не были описаны белки или пептиды, способные связываться с внутриклеточным доменом FAS-R. Таким образом, для ингибирования действия TNF или FAS-R-лиганда необходимо уменьшить количество или активность TNF-R или FAS-R на поверхности клетки, тогда, как для стимуляции действия ΤΝF или FAS-R-лиганда необходимо увеличить количество или активность TNF-R или FAS-R. Для этой цели, недавно, авторами настоящего изобретения были секвенированы и проанализированы промоторы p55-TNF-R и p75TNF-R, в результате чего было установлено, что ряд их ключевых "мотивов" имеют последовательности, характерные для различных факторов регуляции транскрипции; а поэтому, в сущности, экспрессия TNF-R, может регулироваться на уровне их промотора, т.е., может быть достигнуто ингибирование транскрипции, инициируемой промотором, в целях снижения числа рецепторов, либо усиление транскрипции, инициируемой промотором, в целях увеличения числа рецепторов [см., 1L 104355 и 1L·109633, и их соответствующие, еще не опубликованные Европейский патент и РСТ-патент]. О соответствующих исследованиях, относящихся к регулированию FAS-R на уровне промотора FAS-R-гена, пока еще не сообщалось. Кроме того, следует также отметить, что хотя, как известно, рецепторы фактора некроза опухолей (TNF) и их структурно родственный рецептор FAS-R (стимулятор в клетках), после стимуляции лейкоцит-продуцированными лигандами, проявляют деструктивную активность, что приводит к их собственному разрушению, тем не менее, механизмы такой стимуляции остаются все еще малопонятными. Мутационные исследования показали, что FAS-R и P55-TNF-рецептор (p55-R), передающие сигналы цитотоксичности, имеют в своих внутриклеточных доменах особые области [Brackebush и др., 1992; Tartaglia и др., 1993; Іton и Nagatа, 1993]. Эти области ("домены смерти") имеют сходные последовательности. Такие "домены смерти" обоих FAS-R и p55-R имеют тенденцию к самоассоциации. Самоассоциация этих доменов, очевидно, стимулирует агрегацию этих рецепторов, которая является необходимой для инициации передачи сигнала (как показано ниже, а также [как описано Song и др., 1994; Wallach и др.; 1994; Boldin и др., 1995], и при высоких уровнях экспрессии рецептора может приводить к стимуляции лиганд-независимой передачи сигнала 9 (как показано ниже, и [как описано Boldin и др., 1995]. Таким образом, до появления настоящего изобретения не было каких-либо сообщений о получении белков, которые могут регулировать действие лигандов, принадлежащих к суперсемейству TNF/NGF (например, действие TNF или FAS-R-лиганда на клетки), опосредуя передачу внутриклеточного сигнала, управляемую, по всей вероятности, внутриклеточными доменами (1С) рецепторов, принадлежащих к суперсемейству рецепторов TNF/NGF, (таких, как ΤΝF-рецепторы), а именно, внутриклеточными доменами р55- и p75-TNF-R (р551С и р751С, соответственно), а также EAS-1C. В соответствии с этим, одной из целей настоящего изобретения является получение белков, обладающих способностью связываться с внутриклеточными доменами TNF-R и FAS-R, причем, эти белки, как предполагается в настоящее время, участвуют во внутриклеточной передаче сигнала, инициируемой посредством связывания TNF с его рецепторами, или связывания FASлиганда с его рецепторами. Другой целью настоящего изобретения является получение антагонистов (например, антител) против указанных белков, связывающихся с внутриклеточным доменом (1С-связывающее антитело), которые, если это необходимо, могут быть использованы для ингибирования передачи сигнала, в том случае, если такие 1С-связывающие белки являются позитивными эффекторами сигнала (т.е., индуцируют передачу сигнала), либо они могут быть использованы для усиления передачи сигнала, в том случае, если такие 1Ссвязывающие белки являются негативными эффекторами сигнала (т.е., ингибируют передачу сигнала). Еще одной целью настоящего изобретения является использование таких 1С-связывающих белков для выделения и характеризации других белков или факторов, которые могут, например, участвовать в последующих процессах передачи сигнала, и/или для выделения и идентификации других рецепторов, участвующих в предшествующем процессе передачи сигнала, с которыми связываются эти 1С-связывающие белки (например, другие TNF-R или родственные рецепторы), и следовательно, за функции которых эти белки также ответственны. Кроме того, целью настоящего изобретения является использование вышеупомянутых 1Ссвязывающих белков в качестве антигенов для продуцирования поликлональных и/или моноклональных антител против этих белков. Полученные таким образом антитела могут быть, в свою очередь, использованы для очистки новых 1Ссвязывающихся белков из различных источников, таких, как клеточные экстракты или трансформированные клеточные линии. Эти антитела могут быть также использованы в диагностических целях, например, для идентификации расстройств, связанных с нарушением клеточных функций, опосредуемых рецепторами, 76933 10 принадлежащими к суперсемейству рецепторов TNP/NCF. Другой целью настоящего изобретения является получение фармацевтических композиций, содержащих вышеуказанные 1С-связывающие белки, и фармацевтических композиций, содержащих антагонисты 1С-связывающих белков, для лечения или профилактики TNF-индуцированных или FAS-лиганд-индуцированных состояний; причем, указанные композиции могут быть использованы для усиления действия TNF или FASлиганда, либо для ингибирования действия TNF или FAS-лиганда в зависимости от природы вышеуказанного 1С-связывающего белка или его антагониста, содержащегося в данной композиции. Кроме того, в соответствии с еще одной целью настоящего изобретения, в настоящем описании раскрываются другие способы элиминации или ингибирования эндогенно образуемого или экзогенно введенного TNF или FAS-R-лиганда посредством использования растворимых олигомерных TNF-рецепторов, олигомерных FASрецепторов, или олигомеров, представляющих собой смесь TNF-рецепторов и FAS-рецепторов. В этой связи следует отметить, что была предпринята одна попытка выделить и продуцировать, с помощью техники рекомбинантных ДНК, TNFсвязывающий белок, названный ТВР-1, который, как было показано, обладал способностью ингибировать действие TNF. Антагонизм указанного белка был определен путем измерения снижения цитотоксической активности TNF, а также путем измерения уровня его ингибирования связывания TNF со своими рецепторами [ЕР 308378]. Как было обнаружено, ТВР-1 обеспечивает защиту клеток от токсического действия TNF при концентрациях в несколько нанограммов на один миллилитр, и противодействует связыванию TNFи TNF-β с клетками при одновременном введении этого белка с указанными цитокинами. Последующее исследование механизма, по которому действует ТВР-1, выявило, что ТВР-1 не взаимодействует с клеткой-мишенью, а скорее всего, блокирует функцию TNF путем специфического связывания с TNF, конкурируя, тем самым, с его рецептором. Позднее, с использованием другого метода очистки, было обнаружено присутствие двух активных компонентов, одним из которых является ТВР-1, а другим является второй TNFсвязывающий белок, названный нами ТВР-11 (впервые описан в [ЕР 398327]). Оба эти белка обеспечивали защиту клеток от цитоцидного in vitro - действия ΤΝF, и оба белка связывались с TNF-β менее эффективно, чем TNF- . Хотя в анализе, проведенным с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН, было установлено, что белки ТВР-1 и ТВР-11 имеют очень близкие молекулярные массы, однако, их можно отличить друг от друга по отсутствию иммунологической перекрестной реактивности, по различию N-концевых аминокислотных последовательностей, и по различию аминокислотного состава. 11 Однако, вышеупомянутые TNF-связывающие белки являются мономерными и способны связываться лишь с одним мономером гомотримера TNF, натурального лиганда, в результате чего этот TNF все еще остается активным (т.е., неполностью нейтрализованным) благодаря тому, что у этого тримера имеется еще два активных мономера, не связанных TNF-связывающими белками. Кроме того, до сих пор не были описаны растворимые FAS-R (растворимые белки, связывающиеся с FAS-R-лигандом) , способные связываться с лигандом для FAS-R, который, как известно, представляет собой гомотримерную молекулу, ассоциированную с клеточной поверхностью. Так называемый "домен смерти (клеток)" рецептора р55-TNF (обозначенного р55-1С) был описан в [работе Tartaglia и др. (1993)], однако, в этой работе не показано (как это сделано в настоящей заявке), что р55-1С и его "домен смерти" являются самоассоциирующимися, и эта самоассоциация ответственна, главным образом, за передачу сигнала, приводящего к индуцированию цитотоксического воздействия на клетку. Кроме того, в этой публикации ничего не сообщается в возможности продуцирования растворимых олигомерных TNF-рецепторов или растворимых олигомерных Fas -рецепторов, а также умалчивается о других TNF-ассоциированных эффектах, индуцируемых р55-1С или его фрагментами, например, о таких эффектах, как индуцирование экспрессии гена 1L-8, которые рассматриваются в настоящем изобретении. В другой работе, опубликованной после подачи настоящей заявки, раскрывается способность к агрегации (т.е., к самоассоциации) р55-1С, но также ничего не упоминается ни о получении растворимых олигормерных TNF-рецепторов и FAS-рецепторов, ни о других TNF-ассоциированных эффектах, индуцируемых лиганд-независимым способом р55-1С или его фрагментами, раскрываемыми в настоящей заявке. При работе над настоящим изобретением, мы обнаружили новые белки, способные связываться с внутриклеточным доменом р55-TNF-рецептора (р551С-связывающие белки), р75-TNF-рецептора (р751С-связывающие белки), и FAS-рецептора (FAS-1С-связывающие белки). Эти р551С, р751С и FAS-1С-связывающие белки могут действовать как медиаторы или модуляторы эффекторного действия TNF или FAS-R-лиганда на клетки путем опосредования или модуляции внутриклеточной передачи сигнала, которая происходит после связывания TNF с р55- и/или p75-ΤΝΡ-R или связывания FAS-R-лиганда на клеточной поверхности. Кроме того, было неожиданно обнаружено, что р551С и FAS-1С обладают способностью к самоассоциации, и что фрагменты р551С, и FAS-1С одинаково способны связываться с р55-1С, особенно, с так называемыми "доменами смерти (клеток)" (DD), находящимися во внутриклеточных доменах (1С) этих рецепторов, т.е., р55DD и FASDD. Таким образом, р55-1С и FAS-1C и их фрагменты также I представляют собой белки, способные связываться с р551С и FAS-1С, а поэтому, 76933 12 они могут быть модуляторами действия TNF или-ί FAS-R-лиганда на клетки. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением была более полно раскрыта природа связывания одного из новых белков (обозначенного в настоящем описании белком 55.11) с внутриклеточным доменом р55-TNF-рецептора (см. Пример 1). Более того, в другом своем аспекте, настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что внутриклеточный домен рецептора p55-TNF (р55-1С); область, содержащаяся в нем (так называемый "домен смерти" р55-1С); а также внутриклеточный домен рецептора Fas/APO1 (Fas-1С); и область, содержащаяся в нем (так называемый "домен смерти" Fas-1С), обладают способностью к самоассоциации. В соответствии с этим, можно, с помощью стандартной техники рекомбинантных ДНК, сконструировать растворимый олигомерный TNF-рецептор, который является гибридным продуктом, содержащим, у одного своего конца, по крайней мере, два внеклеточных домена TNF-рецептора, и у другого своего конца, по крайней мере, два из вышеуказанных самоассоциирующихся внутриклеточных доменов или их фрагментов, где в результате такой самоассоциации образуется олигомер, имеющий, по крайней мере, два гибридных продукта, соединенных вместе. Таким ο6ρϋ3θΜ,указанный растворимый олигомерный TNF-рецептор способен связываться с двумя мономерами натурального гомотримера TNF, и как таковой эффективно нейтрализует активность TNF. Нейтрализация активности TNF является желательной во всех вышеупомянутых условиях, где наблюдается продуцированное эндогенно или введенное экзогенно чрезмерное количество TNF, приводящее к нежелательным побочным эффектам. Кроме того, эффективное связывание TNF с растворимыми олигомерными рецепторами настоящего изобретения может также служить для связывания экзогенно добавленного TNF и его последующего желательного прологнированного высвобождения в условиях, при которых введение TNF оказывает благоприятное действие, например, при опухолевой терапии. Аналогичным образом, с использованием стандартной техники рекомбинантных ДНК, может быть сконструирован олигомерный FAS-рецептор, являющийся гибридным продуктом, содержащим, по крайней мере, два внеклеточных домена FASрецептора на одном своем конце, и по крайней мере, два вышеуказанных самоассоциирующихся внутриклеточных домена или его Фрагментов, где в результате такой самоассоциации образуется олигомер, имеющий, по крайней мере, два гибридных продукта, соединенных вместе. Таким образом, указанный олигомерный FAS-R способен связываться с двумя мономерами натурального гомотримера FAS-R-лиганда, и эффективно нейтрализовать активность FAS-R-лиганда. Нейтрализация активности FAS-R-лиганда является желательной во всех вышеупомянутых ситуациях, где избыточное количество этого лиганда ассоциируется с нежелательными побочными эффектами. Аналогичным образом, если принять во 13 внимание недавние сообщения, указывающие на возможную связь между TNF и FAS-R-лигандиндуцированными воздействиями на клетки, а следовательно, на возможную их географическую ассоциацию на клеточной поверхности, где они связываются со своими рецепторами, то становится очевидным, что с помощью стандартной техники рекомбинантных ДНК можно сконструировать смешанный олигомерный рецептор, обладающий специфичностью как к TNF, так и к FAS-Rлиганду. Такой смешанный олигомер должен представлять собой смесь вышеуказанных гибридных продуктов, содержащих, по крайней мере, один внеклеточный домен TNF-рецептора и, по крайней мере, один внеклеточный домен FASрецептора у своего одного конца, и, по крайней мере, два вышеупомянутых самоассоциирующихся внутриклеточных домена или их фрагментов у своего другого конца, где в результате такой самоассоциации образуется смешанный олигомер, имеющий, по крайней мере, два таких гибридных продукта, соединенные вместе. Таким образом, указанный смешанный олигомер способен связываться в одно и то же время, по крайней мере, с одним мономером TNF и с одним мономером FASR-лиганда, способствуя, тем самым, снижению или эффективной нейтрализации активности TNF и FAS-R-лиганда ни клеточной поверхности в условиях, при которых, как указано выше, избыточные количества этих двух цитокинов ассоциируются с нежелательными побочными клеточными эффектами. Как указывалось выше, FAS-Rлиганд, в основном, ассоциирован с клеточной поверхностью, а в недавних публикациях также описаны формы TNF, ассоциированные с клеточной поверхностью. Поэтому, указанные смешанные олигомеры ΤΝF-R/FAS-R являются особенно эффективными для нейтрализации активности TNF и FAS-R-лиганда на клеточной поверхности. В соответствии с этим, настоящее изобретение относится к ДНК-последовательности, кодирующей белок, способный связываться с одним или несколькими внутриклеточными доменами одного или нескольких рецепторов, принадлежащих к суперсемейству рецепторов фактора некроза опухолей/фактора роста нервной ткани (TNF/NGF). В частности, настоящее изобретение относится к ДНК-последовательности, выбранной из группы, включающей в себя: а) кДНК-последовательность, происходящую от области, кодирующей нативный белок, связывающийся с внутриклеточным доменом TNF-R і b) ДНК-последовательности, способные к гибридизации с ДНК а) в условиях умеренной жесткости, и кодирующие биологически активный белок, который связывается с внутриклеточным доменом TNF-R; с) ДНК-последовательности, которые являются вырожденными по отношению к ДНКпосдедовательностям, определенным в а) и b) , в результате вырожденности генетического кода, и которые кодируют биологически активный белок, связывающийся с внутриклеточным доменом TNFR. 76933 14 Настоящее изобретение также относится к ДНК-последовательности, выбранной из группы, включающей в себя: а) кДНК-последовательность, происходящую от области, кодирующей нативный белок, связывающийся с внутриклеточным доменом FAS-R. b) ДНК-последовательности, которые способны к гибридизации с кДНК (а) в умеренно строгих условиях, и которые кодируют биологически активный белок, связывающийся с внутриклеточным доменом FAS-рецептора; с) ДНК-последовательности, которые являются вырожденными по отношению к ДНКпоследовательностям, определенным в а) и b), в результате вырожденности генетического кода, и которые кодируют биологически активный белок, связывающийся с внутриклеточным доменом FASR. В конкретных вариантах своего осуществления, настоящее изобретение относится к ДНКпоследовательностям, кодирующим белки, которые связываются с внутриклеточным доменом р55-TNF-рецептора, р75-TNF-рецептора и FASрецептора, например, к ДНКпоследовательностям, кодирующим белки, обозначенные 55.1; 55.3; 55.11; 75.3; 75.16; F2; F9 и DD11. Настоящее изобретение также относится к белкам, их аналогам или производным, кодированным любой из вышеуказанных последовательностей настоящего изобретения, и способным связываться с одним или несколькими внутриклеточными доменами одного или нескольких TNFрецепторов или FAS-рецептора. Варианты этого аспекта настоящего изобретения включают в себя белки, обозначенные 55.1, 55.3, 55.11, 75.3, 75.16, F2, F9 и DD11, их аналоги и их производные. Настоящее изобретение также относится к векторам, кодирующим вышеуказанные белки настоящего изобретения, и содержащим вышеуказанные ДНК-последовательности настоящего изобретения; причем, указанные векторы способны экспрессироваться в соответствующих эукариотических или прокариотических клеткаххозяевах. Кроме того, настоящее изобретение относится к трансформированным эукариотическим или прокариотическим клеткам-хозяевам, содержащим указанные векторы; и к способу продуцирования белков, их аналогов или производных настоящего изобретения путем культивирования таких трансформированных клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии указанных белков, с последующей пост-трансляционной модификацией указанных белков, если это необходимо, и экстракцией экспресси-рованного белка, его аналога или производного из культураль-ной среды указанных трансформированных клеток или из клеточных экстрактов указанных трансформированных клеток. В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к антителам или к их активным производным или фрагментам, специфичным к белкам, аналогам и производным белков настоящего изобретения. 15 В еще одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к использованию ДНКпоследовательностей настоящего изобретения или белков настоящего изобретения, кодируемых этими последовательностями; причем, это использование предусматривает осуществление, в частности, следующих способов: i) способа модуляции действия TNF или FASR-лиганда на клетки, несущие TNF-рецептор или FAS-рецептор, заключающегося в обработке указанных клеток одним или несколькими белками, выбранными из группы, включающей в себя белки, аналоги и производные настоящего изобретения, и белки р551С, p55DD FAS-1C или FAS-DD, их аналоги или производные, где все указанные белки способны связываться с внутриклеточным доменом и модулировать активность TNF-R или FAS-R, а указанная обработка клеток предусматривает введение в эти клетки одного или нескольких белков, их аналогов или производных в форме, подходящей для внутриклеточного введения; либо указанная обработка предусматривает введение в эти клетки ДНК-последовательности, в форме подходящего экспрессирующего вектора, кодирующей указанный один или указанные несколько белков, их аналогов или производных; ii) способ модуляции действия TNF или FASR-лиганда на клетки, несущие TNF-R или FAS-R, заключающегося в обработке этих клеток антителами, их активными производными или фрагментами настоящего изобретения; iii) способа модуляции действия TNF или FASR-лиганда на клетки, несущие TNF-R или FAS-R, заключающегося в обработке этих клеток олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей последовательность, являющуюся антисмысловой, по крайней мере, к части последовательности настоящего изобретения; либо олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей последовательность, являющуюся антисмысловой по отношению к последовательности р551С, р55DD, FAS1C или FAS-DD; причем, указанная олигонуклеотидная последовательность способна блокировать экспрессию, по крайней мере, одного из белков, связывающихся с внутриклеточным доменом TNF-R или FAS-R; iv) способа модуляции действия TNF или TNFR-лиганда на клетки, несущие TNF-R, или FAS-R, предусматривающего: а) конструирование рекомбинантного вектора, происходящего от вируса животных, и несущего последовательность, кодирующую белок вирусной поверхности, который способен связываться со специфическим рецептором клеточной поверхности, и последовательность, выбранную из олигонуклеотидной последовательности, кодирующей последовательность, являющуюся антисмысловой, по крайней мере, к части последовательности настоящего изобретения, и олигонуклеотидной последовательности, кодирующей последовательность, являющуюся антисмысловой по отношению к последовательности р551С, р55DD FAS-1C или FAS-DD причем, при введении в указанные клетки указанного вируса, указанная олигонуклеотидная последовательность способна 76933 16 блокировать экспрессию, по крайней мере, одного из белков, связывающихся с внутриклеточным доменом TNF-R или FAS-R; и b) инфицирование указанных клеток вектором, определенным в а); v) способ модуляции действия TNF или FASR-лиганда на клетки, несущие TNF-R или FAS-R, заключающегося в обработке этих клеток соответствующим вектором, кодирующим рибозиму, имеющую последовательность, специфичную к последовательности, выбранной из мРНКпоследовательности, кодирующей белок, аналог или производное настоящего изобретения, и мРНК-последовательности, кодирующей р551С, р55DD, FAS-1C или FAS-DD; причем, указанная последовательность рибозимы способна взаимодействовать с мРНК-последовательностью, а также способна расщеплять указанную мРНКпоследовательность, что приводит к ингибированию экспрессии белка, аналога или производного настоящего изобретения или к ингибированию экспрессии р551С, р55DD, FAS-1C или FAS-DD; vi) способа обработки опухолевых клеток или ВИЧ-инфицированных клеток или клеток, подверженных другим заболеваниям, предусматривающего: а) конструирование рекомбинантного вектора, происходящего от вируса животных, и несущего последовательность, кодирующую белок вирусной поверхности, который обладает способностью связываться с рецептором поверхности опухолевой клетки или рецептором поверхности ВИЧинфицированной клетки, или который обладает способностью связываться с другим рецептором поверхности клетки, подверженной другим нарушениям; и последовательность, выбранную из последовательности настоящего изобретения, кодирующей белок, аналог или производное настоящего изобретения, и последовательности, кодирующей р551С, р55DD, FAS-1C, FAS-DD, или их биологически активный аналог или производное; причем, указанный белок, аналог или производное настоящего изобретения, или р551С, р55DD, FAS-1C, FAS-DD или их аналог или производное, при введении в указанные опухолевые или ВИЧ-инфицированные клетки или клетки с другими нарушениями, обладают способностью к уничтожению этих клеток; b) инфицирование указанных опухолевых клеток или ВИЧ-инфицированных клеток или клеток с другими нарушениями вектором, определенным в (а); vii) способа выделения и идентификации белков, факторов или рецепторов, способных связываться с белками настоящего изобретения, связывающимися с внутриклеточным доменом, где указанный способ предусматривает осуществление аффинной хроматографии, в которой указанный белок настоящего изобретения связывают с матриксом для аффинной хроматографии, и этот связанный белок подвергают контакту с клеточным экстрактом, после чего белки, факторы или рецепторы из этого клеточного экстракта, которые связываются с указанным связанным белком, элюируют, выделяют и анализируют; 17 viii) способа выделения и идентификации белков, способных связываться с белками настоящего изобретения, связывающихся с внутриклеточным доменом, где указанный способ предусматривает получение дрожжевой двухгибридной системы, в которой последовательность, кодирующую указанный белок, связывающийся с внутриклеточным доменом, несет один гибридный вектор, а последовательность, происходящую из библиотеки кДНК или геномной ДНК, несет второй гибридный вектор, после чего, векторы, используемые для трансформации дрожжевых клетокхозяев выделяют с последующей экстракцией второго гибридного вектора для получения последовательности, кодирующей белок, который связывается с указанным белком, связывающимся с внутриклеточным доменом; и iх) способа выделения и идентификации белка, способного связываться с внутриклеточными доменами TNF-рецепторов или FAS-рецепторов, предусматривающего осуществление Саузернгиб-ридизации в нестрогих условиях с последующим РСR-клонированием, в котором последовательность настоящего изобретения или ее часть используют в качестве зонда для гибридизации с последовательностями из библиотеки кДНК или библиотеки геномной ДНК, имеющего, по крайней мере, частичную гомологию с указанными последовательностями, а затем, указанные гибридизирован-ные последовательности подвергают амплификации и клонированию с помощью полимеразной цепной реакции (PCR), в результате чего получают клоны, кодирующие белки, обладающие, по крайней мере, частичной гомологией к указанным последовательностям настоящего изобретения. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для модуляции действия TNF или FAS-лиганда на клетки, содержащей в качестве активного ингредиента любой один компонент из следующих компонентов: і ) белок настоящего изобретения, или такой белок, как р551С, р55DD, FAS-1C или FAS-DD, его биологически активные фрагменты, аналоги, производные или их смеси; (LL ) рекомбинантный вектор, происходящий от вируса животного, и кодирующий вирусный поверхностный белок, способный связываться с рецепторами TNF-Ц, или FAS-R-DD несущих клеток или опухолевых клеток, и последовательность, кодирующую белок, аналог или производное настоящего изобретения, или последовательность, кодирующую р551С, р55DD, FAS1C или FAS-DD; (iii) рекомбинантный вектор, происходящий от вируса животного, и кодирующий вирусный поверхностный белок, определенный выше в (ii) и олигонуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность, являющуюся антисмысловой по отношению к последовательности р551С, р55DD, FAS-1С или FAS-DD; и iv) вектор, кодирующий рибозиму с последовательностью, способной взаимодействовать с мРНК-последовательностью, кодирующей белок, аналог или производное настоящего изобретения, или с мРНК-последовательностью, кодирующей р551С, р55DD, FAS-1C или FAS-DD. 76933 18 В конкретном варианте вышеуказанных аспектов, настоящее изобретение относится к использованию р55-1С или ДНК, кодирующей р55-1С. Этот вариант изобретения основан на обнаружении того факта, что р55-1С может лиганд (ΤNF)независимым образом индуцировать в клетках другие TNF-ассоциированные эффекты. В соответствии с этим, настоящее изобретение относится к способу индуцирования TNFассоциированных эффектов в клетках или тканях, предусматривающему обработку указанных клеток одним или несколькими белками, их аналогами или производными, где указанные один или несколько белков выбирают из белков, все из которых являются самоассоциирующимися внутриклеточными доменами р55-ТNF-R (р55-1С) или их частями, способными к самоассоциации и индуцированию TNF-эффекта в клетках лиганд (TNF)независимым образом; причем, указанная обработка клеток предусматривает введение в эти клетки указанных одного или нескольких белков, их аналогов или производных в форме, подходящей для внутриклеточного введения, либо введение к эти клетки ДНК-последовательности, кодирующей указанные один или несколько белков, их аналогов или производных, в виде подходящего вектора, несущего эту последовательность, и способного вводить эту последовательность в указанные клетки так, чтобы эта последовательность могла экспрессироваться в этих клетках. Вариантами вышеуказанного способа настоящего изобретения являются: і) способ, где указанную обработку клеток осуществляют путем трансфекции указанных клеток рекомбинантным вектором на основе вируса животного; причем, указанный способ включает в себя следующие стадии: а) конструирование рекомбинантного вирусного вектора, несущего последовательность, кодирующую вирусный поверхностный белок (лиганд), способный связываться со специфическим рецептором на поверхности указанных обрабатываемых клеток; и вторую последовательность, кодирующую белок р55-1С или его фрагменты, аналоги и производные, где указанный белок, при его экспрессии в указанных клетках, способен к самоассоциации и индуцированию одного или нескольких TNF-ассоциирован-ных эффектов; и b) инфицирование указанных клеток вектором (а); ii) способ, где указанным TNF-эффектом, индуцируемым в указанных клетках, является индуцирование экспрессии гена 1L-8, а указанным вектором является вектор, несущий последовательность, кодирующую, в основном, весь указанный р55-1С, его фрагменты, аналоги и производные, которые, при их экспрессии в клетках, способны к самоассоциации и передаче сигнала для индуцирования экспрессии указанного гена 1L-8; iii) способ обработки опухолевых или вирусинфицированных клеток, или способ усиления антибактериального действия гранулоцитов, где указанный вирусный вектор несет последовательность, кодирующую вирусный лиганд, способный 19 связываться со специфическим рецептором на поверхности указанных опухолевых клеток, вирусинфицированных клеток или гранулоцитов, и последовательность, кодирующую указанный р551С, его фрагменты, аналоги и производные, которые при экспрессии в указанных опухолевых клетках, вирус-инфицированных клетках или гранулоцитах, индуцируют TNF-ассоциированные эффекты, приводящие к гибели этих клеток; iv) способ обработки опухолевых клеток, где указанный р55-1С, его фрагменты, аналоги или производные, при экспрессии в опухолевых клетках, индуцируют экспрессию 1L-8, которая вызывает цитолиз указанных опухолевых клеток благодаря их хемотаксической активности, притягивающей гранулоциты и другие лимфоциты к опухолевым клеткам, и приводящей, тем самым, к гибели опухолевых клеток. В этом своем аспекте, настоящее изобретение также относится к внутриклеточному домену р55R, (р55-1С) его фрагментам, аналогам и производным, используемым для обработки клеток путем индуцирования в этих клетках ТNРассоциированных эффектов; и к следующим его вариантам: v) р55-1С, его части, аналоги, и производные для использования в обработке клеток путем индуцирования в них экспрессии гена 1L-8. vi) р55-1С, его части, аналоги и производные для использования в обработке опухолевых клеток путем индуцирования в них экспрессии гена 1L-8, приводящей к гибели этих опухолевых клеток. Кроме того, в этом аспекте, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для обработки клеток путем индуцирования в них TNF-ассоциированных эффектов, где указанная композиция содержит р55-1С, его фрагменты, аналоги, и все их производные в качестве активного ингредиента, и фармацевтически приемлемый носитель; а также к следующим вариантам этой фармацевтической композиции: i) фармацевтическая композиция для обработки клеток путем индуцирования в них TNFассоциированных эффектов, содержащая в качестве активного ингредиента рекомбинантный вектор, происходящий от вируса животного, и кодирующий р55-1С, его фрагменты, аналоги, и все их производные, и белок, способный связываться с поверхностным белком на обрабатываемых клетках; ii) фармацевтическая композиция для обработки опухолевых клеток, введение которой приводит к индуцированию экспрессии 1L-8, и последующей гибели опухолевых клеток. В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к растворимому олигомерному рецептору фактора некроза опухолей (TNF-R), состоящему, по крайней мере, из двух самоассоциированных гибридных белков, каждый из которых имеет а) на одном своем конце, ТNFсвязывающий домен, выбранный из внеклеточного домена TNF-R, его аналогов или производных; причем указанный внеклеточный домен, его аналоги или производные неспособны к нежелатель 76933 20 ной самоассоциации, и способны связываться с TNF; и с) на другом своем конце, самоассоциирующийся домен, выбранный из (і) в основном полного внутриклеточного домена p55-TNF (р551С), простирающегося примерно от аминокислотного остатка 206 до примерно аминокислотного остатка 426 нативной молекулы р55-ТNFрецептора (р55-R); ii) "домена смерти" р55-1С, простирающегося примерно от аминокислотного остатка 328 до примерно аминокислотного остатка 426 нативного р55-R; (iii) в основном, полного внутриклеточного домена рецептора FAS/APO1 (FAS-1C); iv) "домена смерти" FAS-1C; и v) аналогов, фрагментов, или производных любого из (i)(iv), обладающих способностью к самоассоциации, где указанные, по крайней мере, два самоассоциирующиеся белка подвергаются самоассоциации только в указанных концах (b), а у своих концов (а), эти белки способны связываться, по крайней мере, с двумя мономерами TNF, причем, каждый из концов (а) способен связываться с одним мономером TNF; и кроме того, настоящее изобретение относится к солям и функциональным производным указанного растворимого олигомерного TNF-R. Варианты этого аспекта настоящего изобретения включают в себя все комбинации вышеуказанных концов (а) с концами (b), так, например, к этим вариантам относится растворимый олигомерный TNF-R, содержащий в качестве внеклеточного домена внеклеточный домен р55-R, а в качестве самоассоциирующегося внутриклеточного домена домен р55-1С. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения растворимого олигомерного TNF-R, предусматривающему: а) конструирование экспрессирующего вектора, кодирующего любой один из указанных гибридных белков, где ДНК-последовательность каждого из указанных концов гибридного белка получают из клонированных ДНКпоследовательностей, кодирующих в основном, полный внеклеточный домен TNF-R, его аналоги или производные; и из клонированных ДНКпоследовательностей, кодирующих, в основном, полный р55-1С, "домен смерти" р55-1С, Fas-1C, " домен смерти" Fаs-1С, и все их аналоги и производные; и полученные концы лигируют друг с другом, образуя последовательность гибридного белка, которую затем вставляют в указанный вектор под контроль последовательностей, регулирующих транскрипцию и трансляцию; b) введение вектора (а) в соответствующую хозяйскую клетку, в которой экспрессируется указанный гибридный белок; и с) очистку гибридного белка, экспрессированного в указанных клетках-хозяевах; причем, указанный гибридный белок подвергается самоассоциации до, в течение, или после процесса очистки, в результате которой получают растворимый олигомерный TNF-R. Кроме того, настоящее изобретение относится к вектору, кодирующему вышеуказанные гибридные белки, используемые в вышеописанном способе настоящего изобретения; к клеткам 21 хозяевам, содержащим этот вектор; а также к фармацевтической композиции, включающей в себя растворимый олигомерный ΤΝF-R, его соли или функциональные производные и любые их смеси в качестве активного ингредиента в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Аналогично, в соответствии с настоящим изобретением, растворимый олигомерный TNF-R, его соли, функциональные производные и любые их смеси могут быть использованы для ингибирования нежелательного действия TNF в клетках млекопитающих, а в частности, для лечения состояний, обусловленных избыточным присутствием эндогенно образованного или экзогенно введенного TNF; либо, альтернативно, они могут быть использованы для длительного поддержания благоприятного действия TNF в клетках млекопитающих при экзогенном введении ТNF. В соответствии с вышеописанным аспектом настоящего изобретения, следует также указать, что можно сконструировать растворимый олигомерный рецептор FAS/APO1 (FAS-R), который может быть использован для ингибирования нежелательного действия FAS-лиганда. Поэтому, в еще одном аспекте, настоящее изобретение относится к растворимому олигомерному рецептору FAS/APO1 (FAS-R), состоящему, по крайней мере, из двух самоассоциированных гибридных белков, каждый из которых имеет (а) у одного своего конца, домен, связывающийся с FAS-лигандом, выбранный из внеклеточного домена FAS-R, его аналогов при производных, неспособных к самоассоциации и способных связываться с FASлигандом; и b) у другого своего конца, самоассоциирующийся домен, выбранный из (i) в основном, полного внутриклеточного домена P55-TNF-R, (р55-1С), простирающегося примерно от аминокислотного остатка 206 до примерно аминокислотного остатка 426 нативной молекулы р55-TNFR (р55-R); (іі) "домена смерти" р55-1С, простирающегося примерно от аминокислотного остатка 328 до примерно аминокислотного остатка 426 нативного p55-R; (iii) в основном, полного внутриклеточного домена рецептора FAS/APO1 (FAS-1C); (ivv) "домена смерти" FAS-1C; и (ν) аналогов и производных любого из (i)-(іv), обладающих способностью к самоассоциации, где указанные, по крайней мере, два самоассоциирующиеся белка подвергаются самоассоциации только в указанных концах (b), и имеют указанные концы (а), способные связываться, по крайней мере, с двумя мономерами FAS-лиганда, причем, каждый из концов (а) способен связываться с одним мономером FASлиганда; и кроме того, настоящее изобретение относится к солям и функциональным производным указанного растворимого олигомерного FASрецептора. В соответствии с этим аспектом, настоящее изобретение также относится к способу получения растворимого олигомерного FAS-R, предусматривающему: а) конструирование экспрессирующего вектора, кодирующего один из дюбых указанных гибридных белков, где ДНК-последовательность каж 76933 22 дого из указанных концов гибридного белка получают из клонированных ДНКпоследовательностей, кодирующих, в основном, полный внеклеточный домен FAS-R, его аналоги или производные; и из клонированных ДНКпоследовательностей, кодирующих, в основном, весь р55-1С, "домен смерти" р55-1С, FAS-1C, "домен смерти" FAS-1C, все их аналоги и производные; и полученные концы лигируют вместе, образуя последовательность гибридного белка, которую затем вставляют в указанный вектор под контроль транскрипционных и трансляционных регуляторных последовательностей; b) введение вектора (а) в соответствующую хозяйскую клетку, в которой экспрессируется указанный гибридный белок; с) очистку гибридного белка, экспрессированного в указанных клетках-хозяевах, причем, указанный гибридный белок подвергается самоассоциации до, во время, или после процесса очистки, в результате которой получают растворимый олигомерный FAS-R. Кроме того, настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему последовательность, кодирующую растворимый олигомерный FAS-R, используемый в вышеописанном способе; к клеткам-хозяевам, содержащим указанный вектор; и к фармацевтическим композициям, включающим в себя растворимый олигомерный FAS-R, его соли или функциональные производные, или любые их смеси в качестве активного ингредиента в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями. Аналогично, настоящее изобретение относится к растворимому олигомерному FAS-R, его солям, или функциональным производным или любым их смесям, которые могут быть использованы для ингибирования нежелательного действия FAS-лиганда в клетках млекопитающих, а в частности, для лечения состояний, обусловленных избыточным присутствием эндогенно образованного или экзогенно введенного FAS-лиганда. Аналогично вышеприведенному описанию, касающемуся олигомерных рецепторов TNF и олигомерных рецепторов FAS, можно также сконструировать смешанные олигомеры, способные специфически связываться как с TNF, так и с FASR-лигандом. Таким образом, настоящее изобретение также относится к смешанным оли-гомерным ТNF-R/FAS-R, состоящим, по крайней мере, из двух самоассоциированных гибридных белков, один из которых выбирают из любых вышеуказанных TNF-специфических гибридных белков, а другой выбирают из любых вышеуказанных FAS-Rлиганд-специфических гибридных белков, в результате чего получают смешанный олигомер, имеющий, по крайней мере, один внеклеточный домен TNF-R, и, по крайней мере, один внеклеточный домен FAS-R, соединенные вместе благодаря самоассоциации между внутриклеточными доменами или их фрагментами, гибридизированны-ми с каждым из этих внеклеточных доменов. Этисмешанные оли-гомерные рецепторы конструируют путем получения, как описано выше, олигомерных TNF-рецепторов и олигомерных FAS 23 рецепторов, их последующего смешивания, а затем отбора, стандартными способами, тех олигомеров, которые способны к специфическому связыванию с FAS-R-лигандом и TNF. Другой способ получения смешанных олигомерных рецепторов заключается в ко-трансфекции подходящих клеток-хозяев векторами (описанными выше), кодирующими любой из TNF-специфических гибридных белков (растворимых TNF-рецепторов), и кодирующими любой из FAS-R-лигандспецифических гибридных белков (растворимых FAS-рецепторов); очистки экспрессированных гибридных белков, которые подвергаются самоассоциации до, во время, и после очистки, в результате которой получают олигомерные рецепторы; и последующего отбора с помощью стандартной техники тех олигомерных рецепторов, которые обладают способностью связываться с TNF и FAS-R-лигандами. Аналогичным образом, могут быть получены фармацевтические композиции, содержащие смешанные олигомерные рецепторы, их соли или функциональные производные, или любые их смеси в качестве активного ингредиента в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Кроме того, настоящее изобретение относится к смешанным олигомерным рецепторам, их солям или функциональным производным или любым их смесям, которые могут быть использованы для ингибирования нежелательного действия TNF и FAS-R-лиганда в организме млекопитающих, а в частности, для лечения состояний, обусловленных избыточным присутствием эндогенно образованных или экзогенно введенных TNF и FAS-Rлиганда; либо альтернативно, они могут быть использованы для длительного (пролонгированного) поддержания благоприятного действия TNF и/или FAS-R-лиганда в тканях млекопитающих при экзогенном введении TNF и/или FAS-R-лиганда (в растворимой форме). Другие аспекты и варианты настоящего изобретения будут также очевидны из нижеприведенного подробного описания изобретения. При этом следует отметить, что используемые в настоящем описании термины "модуляция действия TNF на клетки" и "модуляция действия FASлиганда на клетки" подразумевают обработку как in vitro так и in vivo. На рис.1a-d схематически изображена неполная и предварительная нуклеотидная последовательность кДНК-клонов, кодирующих р551С- и р751С-связывающие белки, и выведенная аминокислотная последовательность белка 55.11, где на рис.1(а) изображена последовательность (SEQ ID NO:9) клона 55.11, кодирующая р551Ссвязывающим белок 55.11; на рис. 1(b) изображена частичная и предварительная последовательность (SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11) клона 75.3, кодирующая р751С-связывающий белок 75.3; и на рис.1(с) изображена частичная и предварительная последовательность (SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:13) клона 75.16, кодирующая р751Ссвязывающий белок р75.16 (все указанные последовательности описаны в Примере 1); а на рис.1(d) изображена выведенная аминокислотная 76933 24 последовательность белка 55.11 (SEQ ID NО:14), полученная исходя из нуклеотидной последовательности, изображенной на рис.1(а), и описанная в Примере 1. На рис.2 проиллюстрирован Нозерн-блотанализ, который выявил присутствие 55.11специфический мРНК в ряде тестированных клеточных линиях, как описано в Примере 1. На рис.3А и 3В представлены авторадиограммы, иллюстрирующие in vitro -связывание белка, кодируемого 55.11-кДНК, с GST-гибридными белками, содержащими части р55-1С; где на рис.3А проиллюстрировано связывание полноразмерного белка 55.11 (55.11-full) с различными GSTгибридными белками; а на рис.3В проиллюстрировано связывание части 55.11, сцепленной с октапептидом FLAG, с различными GST-гибридными белками (все они описаны в Примере 1). На рис.4 схематически иллюстрируется сравнение выведенной аминокислотной последовательности 55.11 человека (SEQ ID NO:14) с последовательностями родственных белков, происходящих от низших организмов: YHRO27c (дрожжи; SEQ ID NO:15), SEN3 (дрожжи; SEQ ID NO:16), A. thaliana (растение; SEQ ID NO:17) и С. elegans (нематода; SEQ ID NO:18), как представлено в Примере 1. На рис.5 показан Вестерн-блот, окрашенный поликлональной антисывороткой против МBР, и иллюстрирующий самоассоциацию р551С, где Вестерн-блот получали из ДСН-ПААГ-геля, на котором проводили электрофорез взаимодействующих бактериально продуцированных химерных белков р551С-МВР и р551С-GSТ (дорожки 14) или контроля (взаимодействие между химерным белком р551С-МВР и одним GST (дорожки 58); при этом взаимодействие между химерными белками (и контроля) проводили на глутатионагарозных шариках до осуществления электрофореза на ПААГ с ДСН, как описано в Примере 2. На рис.6 представлены фазово-контрастные микрофотографии, иллюстрирующие цитотоксическое действие полноразмерного р551С в клетках HTtal, трансфецированных экспрессирующим вектором, кодирующим этот р551С (правая панель); и ингибиро-вание этого цитотоксического действия в случае, если экспрессия вектора блокируется путем обработки клеток тетрациклином (левая панель) как описано в Примере 2. На рис.7 проиллюстрирована лиганднезависимая стимуляция цитоцидного эффекта в клетках НеLа, трансфецированных полноразмерным р55-R, его внутриклеточным доменом, или частями внутриклеточного домена, включая "домен смерти", где: i) в самой крайней части рис.7 схематически показаны различные ДНК-молекулы, кодирующие полноразмерный ρ55-Βν, его внутриклеточный домен и фрагменты внутриклеточного домена, которые были встроены в вектор, с помощью которого трансфецировали клетки HeLa. ii) левый и средний столбцы графика иллюстрируют экспрессию рецептора TMF в клетках HеLа для каждого из типов рецептора, показанных в самой левой части рис.7, при этом, левый столбец 25 представляет количества рецептора в нг/кл. образца, а средний столбец графика представляет количества рецептора, выраженные в единицах радиоиодированного ΤNF, связанного с трансфецированными клетками; и iii) правый столбец иллюстрирует вариабельность клеток HeLa, экспрессирующих различные типы рецепторов; и где: во всех графиках, незаштрихованные прямоугольники представляют клетки, трансфецированные в присутствии тетрациклина, а заштрихованные прямоугольники представляют клетки, трансфецированные в отсуствии тетрациклина (все указанные варианты описаны в Примере 2). На рис.8 проиллюстрировано лиганднезависимое индуцирование экспрессии гена 1L-8 в клетках HeLa, трансфецирован-ных полноразмерным р55-R или его внутриклеточным доменом (р551С), где на панели А проиллюстрирован Нозерн-блот-анализ РНК, экстрагированной из клеток НеLа, обработанных или необработанных TNF (две левые дорожки, обозначенные "контроль" и "TNF"), и РНК, экстрагированной из клеток НеLа, трансфецированных векторами, кодирующими р55-R, р55-1С или контрольный белок, люциферазу (остальные дорожки, обозначенные "р55-1С", "p55-R", и "Luc", соответственно); при этом, в каждом случае, клетки были трансфецированы в присутствии (+) или в отсутствии (-) тетрациклина (поэтому для трансфецированных клеток имеются две дорожки); и где на панели В проиллюстрировано окрашивание 18S рРНК метиленовым голубым в каждом из образцов клеток НеLа, показанных на панели А (все вышеуказанные варианты описаны в Примере 2). На рис.9 (А и В) графически проиллюстрировано лиганд-независимое стимулирование цитоцидного эффекта в клетках HeLa, трансфецированных р55R или его фрагментами, или FAS-1С, где на рис.9А представлены результаты для p55R, или их фрагментов, а на рис. 9В представлены результаты для FAS-1C. Слева, на панелях А и В, схематически изображены части р55R или FAS1C, используемые для трансфекции, а справа на этих панелях графически представлены экспериментальные результаты (все указанные варианты описаны в Примере 2). На рис.10 схематически изображена частичная и предварительная нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:19 и SEQ ID NO:20) кДНКклона (обозначенного "F2"), который кодирует белок, способный связываться с р551С и FAS-1C, как описано в Примере 3. На рис.11 схематически изображена частичная и предварительная нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:21-23) кДНК-клона (обозначенного F9), которая кодирует белок, способный связываться с р551С и FAS-1C, как описано в Примере 3. На рис.12 схематически изображена частичная и предварительная нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:24) кДНК-клона (обозначенного DD11), которая кодирует белок, способный связываться с р551С, а в частности р55DD и FAS-1C, как описано в Примере 3. 76933 26 В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к новым белкам, которые обладают способностью связываться с внутриклеточным доменом рецепторов, принадлежащих к суперсемейству TNF/NGF, таким, как рецепторы TNF (TNF-R) и рецептор FAS (FAS-R), и которые, поэтому, являются медиаторами или модуляторами этого суперсемейства рецепторов, например, TNF-R, и FAS-R, играя определенную роль, например, в передаче сигналов, инициируемой посредством связывания TNF с рецептором TNF и FAS-лиганда с рецептором FAS. В качестве примеров могут служить белки, которые связываются с внутриклеточным доменом p75-ΤΝF-R (р551С), такие, как белки, обозначенные в настоящем описании 55.1, 55.3 и 55.11 (Пример 1), а также белки, кодируемые кДНК-клонами F2, F9 и DD11 (Пример 3); белки, которые связываются с внутриклеточным доменом р75-TNF-R (р751С), такие, как белки, обозначенные 75.3 и 75.16 (Пример 1); и белки, которые связываются с внутриклеточным доменом FAS-R (FAS-1C), такие, как белки, кодируемые кДНК-клонами F2, F9 и DD11 (Пример 3). Было установлено, что белки 55.1 и 55.3 представляют собой части или фрагменты внеклеточного домена р55-TNF-R, (р551С); а другие белки, а именно, 55.11, 75.3 и 75.16, не были вообще описаны до настоящего изобретения (75.3, 75.16), либо они были описаны (55.11, см., Khan и др., 1992), но об их функциях или других свойствах, в частности, о способности связываться с TNF-R ничего не сообщается (см. ниже, Пример 1). Новые белки, кодируемые кДНК-клонами F2, F9 и DD11 также представляют собой белки, которые ранее не были описаны, т.е., их последовательности отсутствуют в банках данных с ДНК ("GENEBANK") или в банках данных о аминокислотных последовательностях ("PROTEIN ВАNK"). Таким образом, настоящее изобретение относится к ДНК-последовательностям, кодирующим указанные белки, и к белкам, кодируемым этими ДНК-последовательностями. Кроме того, настоящее изобретение также относится к ДНК-последовательностям, кодирующим биологически активные { аналоги и производные этих белков, и к аналогам и производным, кодируемым этими последовательностями. Получение указанных аналогов и производных осуществляют стандартными методами (см., например Sambrook и др., 1989), где, в ДНК-последовательностях, кодирующих эти белки, могут быть делетированы, добавлены, или заменены один или несколько кодонов, так, чтобы полученный в результате аналог имел изменение, по крайней мере, в одной аминокислоте по сравнению с нативным белком. Приемлемыми аналогами являются такие аналоги, которые сохраняют, по крайней мере, свою способность к связыванию с внутриклеточным доменом рецептора, принадлежащего к суперсемейству рецепторов TNF/NGF, таких, как FAS-R, или TNF-R, например, р551С, р751С, или FAS-1C, или которые могут опосредовать любое другое связывание или ферментативную активность, например, такие аналоги, которые связываются с р55, р751С или FAS-1C, но которые не передают 27 сигнал, т.е., не связываются с другим ниже расположенным рецептором, белком или другим фактором, или не катализируют сигнал-зависимую реакцию. Таким образом, могут быть продуцированы аналоги, которые обладают так называемым преобладающим негативным эффектом, а именно, аналоги, которые являются дефектными либо в отношении связывания, например, с р551С, р751С или FAS-1C, либо в отношении последующей передачи сигнала после связывания. Эти аналоги могут быть использованы, например, для ингибирования действия TNF или FAS-лиганда путем конкуренции с натуральными 1С-связывающими белками. Аналогичным образом, могут быть продуцированы так называемые доминантнопозитивные аналоги, которые обладают способностью усиливать действие, например, TNF или FAS-лиганда. Эти аналоги должны иметь аналогичные или даже лучшие 1С-связывающие свойства, а также аналогичную или даже лучшую способность к передаче сигнала, чем натуральные 1С-связывающие белки. Аналогичным образом, производные могут быть получены путем стандартных модификаций боковых групп одного или нескольких аминокислотных остатков белков, или путем конъюгирования белков с другой молекулой, например, с антителом, ферментом, рецептором и другими молекулами, хорошо известными специалистам. Новые белки, связывающиеся с внутриклеточным доменом TNF-R, и FAS-R, например, белки 55.1, 55.3, 55.11, 75.3, 75.16 а также белки, кодированные кДНК-клонами F2, F9 и DD11 (обозначаемых далее F2, F9 и DD11) могут быть использованы в различных целях, например: і) Они могут быть использованы для имитации или усиления функции TNF или FAS-R-лиганда в тех случаях, когда усиленное действие TNF или FAS-R является желательным, например, при противоопухолевой, противовоспалительной или анти-ВИЧ терапии, где необходимо достичь TNFили FAS-R-лиганд-индуцированной цитотоксичности. В этих случаях, белки, например, белки, связывающиеся с р551С, такие, как 5.1, 55.3, а также F2, F9 и DD11, и непосредственно сам р551С (см. ниже, и Пример 2) , а также "домен смерти" р551С (p55DD), который усиливает действие TNF; либо белки F2, F9 и DD11, а также FAS-1C и FAS-DD, которые усиливают действие FAS-R-лиганда, т.е., обладают цитотоксическим действием, могут быть введены в клетку с использованием стандартной техники, известной per se. Так, например, поскольку эти белки являются внутриклеточными, и поскольку желательно, чтобы они были введены только в те клетки, где предпочтительно индуцировать действие TNF или FAS-R-лиганда, то для специфического введения этих белков в клетки необходимо использовать определенную систему. Одним из способов конструирования такой системы является создание рекомбинантного вируса животного, например, вируса, происходящего от вируса коровьей оспы, для получения ДНК, из которой могут быть взяты и последовательно введены два гена: ген, кодирующий лиганд, который связывается с белками клеточной поверхности, 76933 28 экспрессированными клетками, например, такими, как белок gр12О вируса СПИД'а (ВИЧ), который специфически связывается с некоторыми клетками (СD4-лимфоцитами и родственными клетками лейкозов) либо ген, кодирующий другой лиганд, который специфически связывается с клетками, несущими TNF-R или FAS-R, так, чтобы рекомбинантный вирусный вектор был способен к связыванию клеток, несущих TNF-R или FAS-R; и ген, кодирующий новый белок, связывающийся с внутриклеточным доменом, или белок р551С, р55DD, FAS-1C или FAS-DD. Таким образом, белок на поверхности вируса, связывающийся с клеточной поверхностью, будет специфически направлять этот вирус на опухолевую клетку или на другую клетку, несущую TNF-R или FAS-R, после чего последовательность, кодирующая белок, связывающийся с внутриклеточным доменом, или последовательность, кодирующая р551С, p55DD, FAS-1C или FAS-DD, будет введена в клетки с помощью этого вируса, а после ее экспрессии в этих клетках, будет индуцироваться усиление действия TNF или FAS-R-лиганда, что приведет к гибели опухолевых клеток, или других клеток, несущих TNF-R или FAS-R, уничтожение которых было бы желательным. Конструирование такого рекомбинантного вируса животных может быть осуществлено с использованием стандартной техники [см., например, Sambrook и др., 1989]. Другая возможность введения указанных белков в клетки может быть реализована путем введения последовательностей этих новых белков или р551С, p55DD, FAS-1C или FAS-DD в форме олигонуклеотидов, которые могут быть абсорбированы клетками и экспрессированы в них. ii) Они могут быть использованы для ингибирования действия TNF или FAS-R-лиганда, например, в случаях разрушения ткани в результате септического шока, реакции отторжения типа "трансплантат против хозяина", или острого гепатита, где необходимо блокировать TNFиндуцированную внутриклеточную передачу сигнала TNF-R или FAS-R-лиганд индуцированную внутриклеточную передачу сигнала FAS-R. В этом случае, можно, например, ввести в клетки, с помощью стандартной техники, олигонуклеотиды, имеющие антисмысловые кодирующие последовательности для этих новых белков, или антисмысловые кодирующие последовательности для р551С, р55DD, FAS-1C или FAS-DD, которые могли бы эффективно блокировать трансляцию мРНК, кодирующих эти белки, и тем самым блокировать их экспрессию, что, в конечном счете, привело бы к ингибирова-нию действия TNF или FASR-лиганда. Такие олигонуклеотиды могут быть введены в клетки с использованием вышеописанного вируса; причем, второй последовательностью, содержащейся в этом вирусе, должна быть олигонуклеотидная последовательность. Другим способом является использование антител против указанных белков, которое приведет к ингибированию их способности к внутриклеточной передаче сигнала. Возможно, что эти новые белки имеют внеклеточный домен и внутриклеточный домен, при 29 этом, внутриклеточный домен связывается с TMFR- или FAS-R-связывающим доменом, и тогда антитела, генерированные против их внеклеточных доменов, могут быть использованы для блокирования TNF или FAS-R-ассоциированных функций. Еще одним способом ингибирования действия TNF или FAS-R-лиганда является недавно разработанный метод с использованием рибозимов. Рибозимы представляют собой каталитические молекулы РНК, которые специфически расщепляют РНК (т.е., обладают свойством автокатализа). Рибозимы могут быть сконструированы для расщепления нужных РНК, например, мРНК, кодирующих новые белки настоящего изобретения, или мРНК, кодирующие р551С, р55DD, FAS-1C или FAS-DD. Такие рибозимы должны иметь последовательность, специфичную для выбранной мРНК, а также должны обладать способностью к взаимодействию с ней (комплементарное связывание) с последующим расщеплением этой мРНК, что должно, в конечном счете, приводить к снижению (или полному подавлению) экспрессии белка, который необходимо ингибировать, причем, уровень снижения экспрессии зависит от уровня экспрессии рибозимы в клетке-мишени. Для введения рибозимов в выбранные клетки (например, в клетки, несущие TNF-R или FAS-R) может быть использован любой подходящий вектор, например, плазмида, вирусные векторы животных (ретровирусы), и векторы, которые обычно используются в этих целях (см., выше, где вирус имеет, в качестве второй последовательности, кДНК, кодирующую выбранную последовательность рибозима). Кроме того, могут быть сконструированы рибозимы, имеющие множество мишеней (многоцелевые рибозимы), которые могут быть использованы, например, для ингибирования экспрессии одного или нескольких белков настоящего изобретения и/или р551С, р55DD, FAS-1C или FAS-DD, обзор методом и т.п., посвященных рибозимам, [см., Chen et al., 1992; Zhao & Pick, 1993; Shore et al., 1993; Joseph & Burke, 1993; Shimayama et al., 1993; Cantor et al., 1993; Barinaga, 1993; Crisell et al., 1993; Koizumi et al., 1993]. iii) Они могут быть использованы для выделения, идентификации и клонирования других белков, способных связываться с ними, например, других белков, участвующих в процессе передачи сигнала, которые находятся ниже от внутриклеточного домена TNF-R или FAS-R. В этом случае, указанные варианты, а именно ДНКпоследовательности, кодирующие эти белки, могут быть использованы в дрожжевой двухгибридной системе (см. Пример 1), в которой последовательность этих белков может быть использована в качестве "приманки" для выделения, клонирования и идентификации из библиотек кДНК или геномной ДНК других последовательностей ("добычи"), кодирующей белки, которые могут связываться с этими новыми белками, связывающимися с внутриклеточным доменами TNF-R или FAS-R. Аналогичным способом может быть также определено могут ли конкретные. белки настоящего изобретения, а именно, белки, которые свя 76933 30 зываются с р551С, р75С или FAS-1C, связываться с другими рецепторами суперсемейства рецепторов TNF/NGF. Например, недавно сообщалось [Schwalb и др., 1993; Boens и др., 1993, Crowe и др., 1994], что помимо р55- и p75-TNF-R, существуют и другие рецепторы TNF. В соответствии с этим, используя дрожжевую двухгибридную систему, можно точно проверить обладают ли белки настоящего изобретения способностью к специфическому связыванию с этими другими TNFрецепторами или другими рецепторами суперсемейства TNF/NGF. Кроме того, этот способ, может быть, также использован для определения обладают ли белки настоящего изобретения способностью связываться с другими известными рецепторами, в активности которых они могут играть функциональную роль. iv) Эти новые белки могут быть также использованы для выделения, идентификации и клонирования других белков того же самого класса, т.е., белков, связывающихся с внутриклеточными доменами TNF-R или FAS-R или с функционально родственными рецепторами, и участвующими во внутриклеточной передаче сигнала. В этом случае, может быть использована вышеописанная дрожжевая двухгибридная система, либо может быть использована недавно разработанная (Wilks и др., 1989) система с применением нестрогой Саузерн-гибридизации с последующим РСRклонированием. в публикации Wilks и др. описываются идентификация и клонирование двух предполагаемых протеин-тирозин-киназ с использованием нестрогой Саузерн-гибридизации с последующим клонированием посредством РСR исходя из известной последовательности "мотива" киназы предполагаемой киназной последовательности. В соответствии с настоящим изобретением, этот метод может быть применен с использованием последовательностей новых белков для идентификации и клонирования белков, родственных белкам, связывающимся с внутриклеточным доменом TNF-R, FAS-R или родственного рецептора (рецепторов суперсемейства TNF/NGF). v) В еще одном варианте, новые белки настоящего изобретения могут быть использованы в методах аффинной хроматографии для выделения и идентификации других белков или факторов, с которыми они способны связываться, например, других рецепторов, родственных TNF-R (рецепторам суперсемейства TNF/NGF) или других белков или факторов, участвующих в процессе передачи сигнала. В этом случае, белки настоящего изобретения могут быть отдельно связаны с матриксом, используемом для аффинной хроматографии, а затем подвергнуты контакту с клеточными экстрактами или выделенными белками или факторами, которые подозреваются в участии в процессе передачи внутриклеточного сигнала. После проведения аффинной хроматографии, другие белки или факторы, которые связываются с новыми белками настоящего изобретения, могут быть проэлюированы, выделены и охарактеризованы. vi) Как указывалось выше, новые белки настоящего изобретения могут быть также исполь 31 зованы в качестве иммуногенов (антигенов) для продуцирования антител против них. Эти антитела могут быть также использованы для очистки новых белков либо из клеточных экстрактов, либо из продуцирующих их трансформированных клеточных линий. Кроме того, эти антитела могут быть также использованы в диагностических целях идентификации расстройств, связанных с аномальным функционированием системы TNF или FAS-R-лиганда, например, клеточных эффектов, индуцированных сверхактивными или малоактивными TNF или FAS-R-пигандами. Так, например, в случае, когда такие расстройства связаны с недостаточным функционированием системы передачи внутриклеточного сигнала, в которой участвуют новые белки, указанные антитела могут служить важным диагностическим инструментом. При этом следует отметить, что выделение, идентификация и характеризация новых белков настоящего изобретения могут быть осуществлены с помощью хорошо известных стандартных методов скрининга. Так, например, один из таких методов скрининга (метод с получением двойного дрожжевого гибрида, как описано ниже в Примерах 1 и 3) был использован для идентификации новых белков настоящего изобретения. Как описано выше и ниже, могут быть использованы другие хорошо известные методы, такие, как аффинная хроматография, ДНК-гибридизация, и т.п. для выделения, идентификации и характеризации новых белков настоящего изобретения, или для выделения, идентификации и характеризации других белков, факторов, рецепторов и т.п., обладающих способностью связываться с новыми белками настоящего изобретения или с рецепторами, принадлежащими к семейству рецепторов TNF/NGF. Что касается вышеупомянутых антител, то термин "антитело", используемый в настоящем описании, означает поликлональ-ные антитела, моноклональные антитела (mAb), химерные антитела, антиидиотипические антитела (анти-1d), против антител, которые могут быть помечены в растворимой или связанной форме, а также к их фрагментам, полученным с использованием известной техники, такой, как ферментативное расщепление, пептидный синтез или техника рекомбинантных ДНК, и т.п. Поликлональные антитела представляют собой гетерогенные популяции молекул антител, полученных из сыворотки животных, иммунизированных антигеном. Моноклональные антитела представляют собой, в основном, гомогенную популяцию антиген-специфических антител, которые имеют, в основном, аналогичные эпитопсвязывающие сайты. Моноклональные антитела могут быть получены известными методами. [См., например, Kohier & Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975); патент США №4 376 110; Ausubel et.al., eds., Harlow & Lane ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Gold Spring Harbor Laboratory (1988); u Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology,Creene publishing Assoc. & Wiley Interscience N. Y., (1992, 1993)], причем, содержимое этих работ вводится в настоящее описание 76933 32 посредством ссылки. Указанными антителами могут быть любые иммуноглобулины классов 1gG, 1gΜ, 1gE, 1gA, GULD, и любых их подклассов. Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела настоящего изобретения могут быть культивированы in vitro, in situ, in vivo. Возможность продуцирования высокого титра моноклональных антител in vitro или in situ делает этот метод особенно предпочтительным. Химерные антитела представляют собой молекулы, состоящие из разных частей, происходящих от разных видов животных, например, такие молекулы, которые имеют вариабельную область, происходящую от мышиных mАb, и константную область, происходящую от человеческого иммуноглобулина. Химерные антитела используют, главным образом, для снижения иммуногенности и для увеличения выхода при продуцировании, например, такие химерные человек/мышиные mАb могут быть использованы в тех случаях, когда мышиные mАb имеют повышенные выходы из гибридом, но обладают повышенной иммуногенностью для человека. Химерные антитела и способы их получения являются известными и описаны в литературе [Cabilly et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312: 643-646 (1984); Cabilly et al., заявка на Европейский патент 125023 (опубликованная 14 ноября 1984); Neuberger et al., Nаture 314: 268-270 (1985); Morrison et al. Заявка на Европатент 173494 (опубл. 5 марта 1986) Тaniguichi et al., заявка на Европейский патент 173494 (опубликованная 5 марта 1986.), Neuberger et al., РСТ заявка WO 8601533 (опубликованная 13 марта 1986); Kudo и др. заявка на Европейский патент 184187 (опубликованная 11 июня 1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137; 1066-1074 (1986); Robinson и др. заявка на Международный патент WO 8702671 (опубликованная 7 мая 1987); Liu et аl., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84; 214-218 (1987); Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988); и Harlow & Lane., ΑNTIBODIS: АLΑΒΟRΑΤΟRY MANUAL. (см. выше)]. Все указанные работы вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Антиидиотипическое (анти-1d) антитело представляет собой антитело, распознающее антигенные детерминанты, в основном, ассоциированные с антигенсвязывающим центром антитела. Идиотипическое антитело может быть получено путем иммунизации животного того же вида и генетического типа (например, мышиной линии), что и источник mAb, моноклональные антителом, к которому продуцируют анти-1d антитело. Иммунизированные животные могут распознавать и реагировать на идиотипическиедетерминанты иммунизирующего антитела путем продуцирования антител к указанным идиотипическим детерминантам (анти-1d антител). [См., например, патент США 4 699 880], который вводится в настоящее описание посредством ссылки. Антиидиотипическое антитело может быть также использовано в качестве "иммуногена" для индуцирования иммунного ответа у другого жи 33 вотного, продуцирующего так называемое антиантиидиотипическое антитело. Это антиантиидиотипическое антитело может быть по своим антигенным детерминантам идентичным исходному mAb, которое индуцирует антиидиотипическое антитело. Таким образом, путем использования антител к идиотипическим детерминантам mAb могут быть идентифицированы другие клоны, экспрессирующие антитела идентичной специфичности. В соответствии с этим, моноклональные антитела, продуцированные против 1С-связывающих белков, их аналогов или производных настоящего изобретения или против р551С, р55DD, FAS-DD, 1С, FAS-DD, их аналогов или производных, могут быть использованы для генерирования антиидиотипических антител у соответствующих животных, такие, как мыши ВАЦВ/с. Клетки селезенки от этих иммунизированных мышей используют для продуцирования анти-1d гибридом, секретирующих анти-1d mAb, Кроме того, эти анти-1d mAb могут быть конъюгированы с носителем, таким, как гемоцианин лимфы улитки (КLН), и использованы для иммунизации других мышей BALB/c. Сыворотки этих мышей будут содержать антиантиидиотипические антитела, обладающие связывающими свойствами исходного mAb, специфичного к эпитопу вышеуказанного 1Ссвязывающего белка, его аналогов или производных, а также р551С, p55DD, FAS-1C или FAS-DD, их аналогов или производных. Таким образом, анти-1d mAb имеют свои собственные идиотипические эпитопы, или "идиотипы", структурно сходные с оцениваемым эпитопом, таким, как белок- GPB. Термин "антитело", используемый в настоящем описании, означает также интактные молекулы и их фрагменты, например, такие, как Fab и F(аb')2, которые способны связываться с антигеном. Fab- и F(аb')2-фрагменты представляют собой часть интактного антитела без Fc-фрагмента, и более быстро выводятся из кровотока и обладают меньшим ткане-неспецифическим связыванием, чем интактное антитело [Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)]. При этом следует отметить, что Fab-, F(ab)2 и другие фрагменты, применяемые в настоящем изобретении, могут быть использованы для обнаружения и количественной оценки 1Ссвязывающих белков или р551С, р55DD, FAS-1C или FAS-DD в соответствии с методами, описанными в настоящей заявке для интактных молекул антитела. Обычно, эти фрагменты получают путем протеолитического расщепления с использованием таких ферментов, как папаин (для продуцирования Fаb-фрагментов) или пепсин (для продуцирования F(аb')2-фрагментов). Считается, что антитело "способно связываться" с молекулой в том случае, если оно способно вступать в специфическую реакцию с этой молекулой, в результате которой эта молекула связывается с антителом. Термин "эпитоп" означает часть любой молекулы, способной связываться с антителом, которая может распознаваться этим антителом. Эпитопы или "антигенные 76933 34 детерминанты" обычно состоят из химически активных групп поверхности молекул, таких, как группы аминокислотных остатков или боковые полисахаридные цепи, и имеют специфическую пространственную структуру, а также специфический заряд. "Антиген" представляет собой молекулу или ее часть, способную связываться с антителом, и способную, кроме того, индуцировать у животного вырабатывание антител, способных связываться с эпитопом этого антигена. Антиген может иметь один или несколько эпитопов. Под понятием "специфическая реакция антигена" подразумевается, что этот антиген может реагировать при высоком уровне селективности с соответствующим ему антителом, и не может реагировать со многими другими антителами, продуцированными другими антигенами. Антитела, включая фрагменты антител, применяемые в настоящем изобретении, могут быть использованы для количественного или качественного обнаружения 1С-связывающих белков или р551С, p55DD, FAS-1C, FAS-DD в образце, или для обнаружения присутствия клеток, которые экспрессируют 1С-связывающие белки настоящего изобретения или белки р551С, р55DD, FAS-1C, и FAS-DD. Это обнаружение может быть осуществлено с помощью иммунофлуоресцентной техники с использованием флуоресцентно меченных антител (см. ниже), в сочетании с методами оптической микроскопии, проточной цитометрии, или флуорометрии. Антитела (или их фрагменты), применяемые в настоящем изобретении, могут быть использованы гистологически в иммунофлурресцентной или иммуноэлектронной микроскопии для in sitiобнаружения 1С-связывающих белков настоящего изобретения или р551С, р55DD, FAS-1C, FАS-DD. In situ - детекция может быть осуществлена путем взятия гистологического образца у пациента, и введения меченного антитела настоящего изобретения в такой образец. Антитело (или его фрагмент) предпочтительно вводить путем нанесения или покрытия этим меченным антителом (или его фрагментом) биологического образца. Используя такой метод, можно определить не только присутствие 1С-связывающих белков или р551С, p55DD, FAS-1С, FAS-DD, но также и оценить распределение этих белков в исследуемой ткани. Любому специалисту совершенно очевидно, что с использованием настоящего изобретения можно модифицировать любые гистологические методы широкого ряда (например, методы окрашивания) для осуществления такой in situ детекции. Указанные анализы на присутствие 1Ссвязывающих белков настоящего изобретения или р551С, p55DD, PAS-1С, FAS-DD обычно осуществляют путем инкубирования биологического образца, такого, как физиологическая жидкость, тканевый экстракт, свежесобранные клетки, например, лимфоциты или лейкоциты, или клетки, которые были инкубированы в тканевой культуре, в присутствии детектируемого меченного антитела, способного к идентификации 1С-связывающих белков или р551С, р55DD, FAS-1С, FAS-DD, и по 35 следующего обнаружения этого антитела любым из имеющихся стандартных способов. Биологический образец может быть иммобилизован на твердофазном носителе, таком, как микроцеллюлоза или другой твердофазный носитель, способный иммобилизовывать клетки, частицы клеток, или растворимые белки. Этот носитель может быть затем промыт соответствующими буферами, а после этого обработан детектируемым меченным антителом в соответствии с настоящим изобретением, как указано выше. Твердофазный носитель может быть, затем еще раз промыт буфером для удаления несвязанного антитела. После этого, количество связанной метки на указанном твердом носителе или подложке может быть определено стандартными методами. Термины "твердофазная подложка", "твердофазный носитель", "твердый носитель", "твердая подложка", "подложка" или "носитель" означает любую подложку или любой носитель, способные связываться с антигеном или антителами. Хорошо известными подложками или носителями являются стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, декстран, найлон, амилазы, натуральные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, габбро и магнетит. По своей природе, этот носитель может быть растворимым до определенной степени, либо нерастворимым в зависимости от целей настоящего изобретения. Материал для носителя может иметь фактически любую конфигурацию, при условии, что иммобилизованная на нем молекула способна связываться с антигеном или антителом. Так, например, подложка или носитель может иметь сферическую в виде шариков) и цилиндрическую (в виде внутренней поверхности лабораторной пробирки) конфигурацию, или представлять собой внешнюю поверхность стержня. Альтернативно, поверхность носителя может быть плоской, такой, как лист, полоска, и т.п. Предпочтительными носителями являются полистироловые шарики. Однако, при этом следует отметить, что путем рутинного экспериментирования, любой специалист может самостоятельно подобрать подходящие носители для связывания антитела или антигена. Связывающая активность данного антитела, описанного выше, может быть определена известными методами. При этом, каждый специалист, посредством рутинного экспериментирования, может определить рабочие и оптимальные условия анализа для каждого конкретного случая. В каждом конкретном случае анализа могут быть дополнительно осуществлены другие стадии, такие, как промывка, размешивание, фильтрация и т.п., если это необходимо. Один из способов получения детектируемого меченого антитела настоящего изобретения предусматривает связывание этого антитела с ферментом с последующим проведением иммуноферментного анализа (ИФА). Этот фермент, в свою очередь, может быть, подвергнут затем взаимодействию с соответствующим субстратом, так, чтобы в результате этой реакции с субстратом продуцировалась химическая молекула или группа, которая могла бы быть обнаружена мето 76933 36 дами спектрофотометрии, флуорометрии, или путем визуального наблюдения. Ферментами, которые могут быть использованы для получения детектируемого меченного антитела, являются (но не ограничиваются ими) малатдегидрогеназа, стафилококковая нуклеаза, стероид- S-изомераза, дрожжевая алкогольдегидрогеназа, альфаглицерофосфат-дегидрогеназа, триозофосфатизомераза, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, аспарагиназа, глюкозооксидаза, бетагалактозидаза, рибонуклеаза, уреаза, каталаза, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа, глюкоамилаза и ацетилхолинэстераза. Детекция антитела может быть осуществлена колориметрическими методами, в которых используется хромогенный субстрат для фермента. Детекция может быть также осуществлена путем визуального сравнения степени ферментативной реакции субстрата со стандартами, изготовленными аналогичным образом. Детекция может быть также осуществлена с использованием любого другого иммуноанализа. Так, например, радиоактивно меченные антитела или их фрагменты могут быть обнаружены по RРТРазе с использованием радиоиммунологического анализа (РИА). Хорошее описание РИА приводится [Work Т. и др., Laboratory Technigues and Biochemistry in Molecular Biology; Noeth Holland Publishing Company NY (1978) со ссылкой на главу под названием " An Introduction to Radioimmune Assay and Related Technigues", Chard Т.]; указанная работа вводится в настоящее описание посредством ссылки. Радиоактивный изотоп может быть обнаружен с помощью гамма-счетчика, сцинтилляционного счетчика, или с помощью авторадиографии. В соответствии с настоящим изобретением, антитело может быть также помечено флуоресцентным соединением. При этом, если флуоресцентно меченное антитело подвергнуть световому облучению с соответствующей длиной волны, то присутствие этого антитела может быть обнаружено благодаря флуоресценции. Наиболее распространенными соединениями, применяемыми для флуоресцентного мечения, являются изотиоцианат флуоресцеина, родамин, фикоэритрин, пикоцианин, аллофикоцианин, о-фтальдегид, и флуорескамин. Антитело, для его обнаружения, может быть также помечено с использованием флуоресцирующих металлов, таких, как 152Δ или других металлов ряда лантанидов. Эти металлы могут быть связаны с антителом посредством групп, образующих хелатные комплексы металлов, например, таких групп, как диэтилентриаминпентауксусная кислота (ЕТРА). Для своего обнаружения, антитело может быть также помечено путем его связывания с хемолюминисцентным соединением. Присутствие такого хемилюминесцентно-меченного антитела может быть, затем обнаружено по наличию люминесценции, продуцируемой в результате химической реакции. Примерами подходящих хемилюминесцентных соединений-меток являются люминол, изолюминол, термоустойчивый сложный эфир 37 акридиния, имидазол, соли акридиния и сложный эфир акридиния и щавелевой кислоты. Аналогичным образом, биолюминесцентное соединение также может быть использовано для мечения антитела настоящего изобретения. Биолюминесценция является одним из видов хемилюминесценции, наблюдаемой в биологических системах, где каталитический белок усиливает эффективность хемилюминесцентной реакции. Присутствие биоллюминесцентного белка может быть обнаружено по наличию люминесценции. Подходящими для мечения биолюминесцентными соединениями являются люциферин, люцифераза и экуорин. Молекула антитела настоящего изобретения может быть адаптирована для использования в иммунометрическом анализе, известным под названием "двухслойного" (или "двухстадийного") анализа или "сэндвич"-анализа. В типичном иммунометрическом анализе, определенное количество немеченого антитела (или его фрагмента) связывают с твердой подложкой или с твердым носителем, и добавляют определенное количество детектируемого меченного растворимого антитела, после чего анализируют на присутствие и/или определяют количество тройного комплекса, образующегося между антителом, иммобилизованном на твердофазном носителе, антигеном и меченым антителом. Обычно и предпочтительно, иммунометрический анализ представляет собой "прямой" анализ, в котором антитело, связанное с твердофазным носителем, сначала подвергают контакту с тестируемым образцом для экстракции антигена из этого образца посредством образования двойного комплекса "антитело на твердофазном носителе антиген". После инкубирования в течение соответствующего периода времени, твердый носитель промывают для удаления остатков жидкого образца, включая непрореагировавший антиген, если таковой имеется, и подвергают контакту с раствором, содержащим неизвестное количество меченного антитела (которое функционирует как "репортерная молекула"). После второго периода инкубирования, во время которого меченое антитело образует комплекс с антигеном, связанным с твердой фазой посредством немеченого антитела, твердый носитель промывают второй раз в целях удаления непрореагировавшего меченого антитела. В "сэндвич"-анализе другого типа, который также может быть применен в антигенам настоящего изобретения, используют так называемый "одновременный" и "обратный" анализы. Одновременный анализ предусматривает одну стадию инкубирования, поскольку антитело, связанное с твердым носителем, и меченое антитело добавляют к тестируемому образцу одновременно. После завершения стадии инкубирования, твердый носитель промывают для удаления остатков жидкого образца и неконъюгированного меченого антитела. Затем присутствие меченого антитела, связанного с твердым носителем, определяют так же, как и в "прямом" анализе, описанным выше. 76933 38 В "обратном" анализе, сначала добавляют раствор меченого антитела к жидкому образцу, а затем, после соответствующего периода инкубирования, добавляют немеченое антитело, связанное с твердым носителем. После второго инкубирования, твердую фазу промывали стандартным способом для удаления остатков тестируемого образца и раствора непрореагировавшего меченного антитела. Определение меченого антитела, связанного с твердым носителем, осуществляют как в "одновременном" и "прямом" анализах. Новые белки настоящего изобретения, после их выделения идентификации, и характеризации любым из стандартных методов скрининга, например, методом с использованием дрожжевого двойного гибрида, аффинной хроматографии и других известных методов, могут быть, затем продуцированы стандартными методами рекомбинантных ДНК [см., например, Sambrook и др., 1989], в которых подходящие эукариотические или прокариотические клетки-хозяева трансформируют соответствующими эукариотическими или прокариотическими векторами, содержащими последовательности, кодирующие белки. В соответствии с этим, настоящее изобретение также относится к указанным экспрессирующим векторам и трансформированным клеткам-хозяевам. Как упоминалось выше, к этим белкам также относятся их биологически активные аналоги и производные, а поэтому, настоящее изобретение также относится к векторам, кодирующим аналоги этих белков; и к трансформированным клеткам-хозяевам, продуцирующим эти аналоги. Производные указанных белков получают путем стандартной модификации белков или их аналогов, продуцируемых трансформированными клетками-хозяевами. В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к использованию отдельного внутриклеточного домена p55-TNF-R (р551С) или FASR (FAS-1C) или их так называемых "доменов смерти" (p55DD) или FAS-DD, соответственно) в качестве агентов для усиления действия TNF или FAS-R-лиганда на клетки, независимо друг от друга (см. Пример 2). Если в данных клетках, например, в раковых или ВИЧ-инфицированных клетках, необходимо генерировать TNF- или FAS-Rлигандиндуцируемый цитотоксический эффект, то в эти клетки могут быть введены р551С, p55DD или FAS-DD с использованием вышеописанной методики (см. выше п.(і)) с применением рекомбинантного вируса животных (например, вируса коровьей оспы). Кроме того, в настоящем изобретении могут быть использованы нативные р551С, р55DD, FAS-1C или FAS-DD, их биологически активные аналоги, производные или фрагменты, причем, все они могут быть получены методами, описанными выше. Аналогичным образом, настоящее изобретение также относится к специфическому блокированию TNF-эффекта или FAS-R-лигандного действия путем ингибирования активности р551С, р55DD, FAS-1C или FAS-DD, например, путем введения в клетки антисмыслового олигонуклеотида, приводящего к блокированию экспрессии р551С, р55DD, FAS-1C или FAS-DD. 39 Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим рекомбинантные векторы на основе вирусов животных, кодирующие белки, связывающиеся с внутриклеточным доменом рецептора TNF или FAS (включая р551С, р55DD, FAS-1C и FAS-DD), а также кодирующие вирусные поверхностные белки, способные специфически связываться с поверхностными белками клеток-мишеней (например, раковых клеток), в результате чего, указанные векторы обеспечивают направленную инсерцию последовательностей белков, связывающихся с внутриклеточным доменом, в нужные клетки. В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится, в частности, к эффектам самоассоциации внутриклеточного домена р55-TNFрецептора (р55-1С, см. Пример 2). Примером таких эффектов, которые обычно опосредуются связыванием TNF со своим рецептором, и которые имитируются сигнал-передающей активностью самоассоциирующихся р55-1С или их частей, является индуцирование экспрессии гена, кодирующего 1L-8. Интерлейкин-8 (1L-8) представляет собой цитокин, принадлежащий к подклассу хемокинов, обладающих выраженной хемотаксической активностью, и, как было показано, играющий важную роль в хемотаксисе гранулоцитов и клеток других типов, ассоциированных с рядом патологических состояний [см., например, Endo и др., 1994; Sekido и др., 1993; Harada и др., 1993; и Fеrrick и др., 1991]. Фактор некроза опухолей (TNF) обладает полезной активностью, и поэтому, он может быть использован непосредственно для разрушения опухолевых клеток и вирус-инфицированных клеток, либо для усиления антибактериальной активности гранулоцитов. Однако, как указывалось выше, TNF также обладает нежелательной активностью, и в этих случаях, его активность желательно блокировать, включая, те случаи, когда используются повышенные дозы TNF, например, при противораковой, противовирусной и антибактериальной терапии. В соответствии с этим, желательно разработать метод, который позволял бы регулировать активность TNF, либо получить такое соединение, которое было бы способно имитировать полезную активность TNF в клетках или тканях, нуждающихся в специальной обработке. В соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что самоассоциирующийся внутриклеточный домен р55-R (р55-1С) может, лиганд-независимым способом, имитировать ряд эффектов TNF, например, "домен смерти" р55-1С может индуцировать цитотоксические эффекты в клетках, а р55-1С может индуцировать экспрессию гена 1L-8. Таким образом, используя р55-1С, можно имитировать функцию TNF по сайтнаправленному механизму, т.е., можно вводить р55-1С только в те клетки или ткани, которые нуждаются в обработке. Одним из примеров вышеупомянутых методов может служить специфическая трансфекция 76933 40 (трансформация) опухолевых клеток или злокачественной ткани ДНК-молекулой, кодирующей р551С или его фрагмент, который может не только индуцировать цитотоксические эффекты на этих клетках или тканях, но и также усиливать эти эффекты путем ко-индукции 1L-8, которая будет приводить к аккумуляции в области этих клеток или тканей гранулоцитов или других лимфоцитов, которые, в свою очередь, могут способствовать разрушению опухолевых клеток или ткани. Этот метод позволяет избежать необходимости введения больших доз TNF, ассоциируемых с нежелательными побочными эффектами. С использованием стандартной техники рекомбинантных ДНК могут быть получены различные участки р55-1С и определено, какая именно область ответственна за каждый TNFиндуцирован-ный эффект. Например, было установлено, что "домен смерти" ответственен за цитотоксичность (Пример 2), и были получены различные другие конструкции, содержащие части р55-1С, которые (вместе с частью или полным "доменом смерти") могут быть ответственны за другие TNF-эффекты, и которые могут быть использованы, лиганд-независимым образом, после их самоассоциации, в целях индуцирования указанных эффектов, например индуцирования экспрессии 1L-8. Следует отметить, что последовательность р55-1С, участвующая в индуцировании других TNF-ассоциированных эффектов (например индуцирование 1L-8), может отличаться от последовательности, которая ответственна за цитотоксичность, т.е., она может не иметь, или иметь только часть "домена смерти", и иметь другие "мотивы", происходящие из других участков внутриклеточного домена, либо она сама может быть последовательностью этих других отличительных признаков последовательности (последовательностью другого "мотива"), участвующих в индуцировании других эффектов. В соответствии с этим, как подробно описано выше и ниже, могут быть получены экспрессирующие векторы, содержащие указанные области р55-1С, их аналоги или производные, и экспрессированы в клетках-хозяевах, а затем очищены и проанализированы на их активность. В этом методе, могут быть получен ряд фрагментов р55-1С, обладающих одним или несколькими TNFaccoциированными эффектами, и эти фрагменты могут быть использованы различным способом для лечения патологических состояний любого ряда, например, вирусных инфекций, бактериальных инфекций, опухолей, и т.п. Во всех указанных случаях, специфическая активность этих фрагментов может быть усилена путем совместного введения (или ко-трансфекции) фрагмента р551С, ответственного за индуцирование экспрессии гена lL-8, что приведет к желательной хемотаксической активности 1L-8 и усилению деструкции клеток или тканей, которые необходимо разрушить. Таким образом, не прибегая к системному введению TMF, можно индуцировать его полезные эффекты путем специфического введения всего 41 р55-1С или его фрагмента в клетки или ткани, предназначенные для обработки. р55-1С может быть специфически введен в клетки или ткани для их разрушения с использованием любого из вышеупомянутых способов. Так, например, один из этих способов предусматривает конструирование рекомбинантного вируса животного (например, происходящего от вируса коровьей оспы), в ДНК которого вводят два следующих гена: ген, кодирующий лиганд, который связывается с белками клеточной поверхности, специфически экспрессируемыми клетками, например, белком gр120 вируса СПИД'а, который специфически связывается с некоторыми клетками (СD4-лимфоцитами и родственными клетками лейкоза); либо другой лиганд, который специфически связывается с клетками, несущими TNF-R, и благодаря которому рекомбинантный вирусный вектор может связываться с такими TNF-Rнесущими клетками; и ген, кодирующий р55-1С или его фрагмент. Таким образом, экспрессия белка, связывающегося с клеточной поверхностью, на поверхности вируса будет специфически направлять этот вирус на опухолевую клетку или на другую TNF-R-несущую клетку, в результате чего последовательность, кодирующая р55-1С или его фрагмент, будет, с помощью этого вируса, введена в клетки, и последующая экспрессия этой последовательности в указанных клетках приведет к усилению TNF-эффекта, способствующего гибели опухолевых или других TNF-R-несущих клеток, которые необходимо уничтожить, либо индуцирующего, например, экспрессию 1L-8, приводящей к гибели этих клеток. Конструирование указанного рекомбинантного вируса животного может быть осуществлено с использованием стандартной техники [см., например, Sambrook и др., 1989]. Другой способ предусматривает введение последовательностей р55-1С или их фрагментов в виде олигонуклеотидов, которые могут быть абсорбированы клетками и экспрессированы в них. Настоящее изобретение также относится, в частности, к фармацевтическим композициям, содержащим вышеуказанные рекомбинантные вирусные векторы, кодирующие р55-1С или его фрагменты, а также кодирующие поверхностный вирусный белок, способный специфически связываться с поверхностными белками клетокмишеней (например, раковых клеток), в результате чего указанный вектор обеспечивает инсерцию последовательности р55-1С или его фрагментов в указанные клетки. В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к новым синтетическим TNFрецепторам, которые являются растворимыми, и обладают способностью к олигомеризации с образованием димерной, а возможно и более высокого порядка мультимерной TNF-рецепторной молекулы, каждая мономерная часть которой способна связываться с мономером TNF. Нативный TNF представляет собой гомотример, содержащий три активных TNF-мономера, каждый из которых способен связываться с одной молекулой рецептора; тогда, как природные рецепторы TNF представ 76933 42 ляют совой мономеры, каждый из которых способен связываться только с одним мономером гомотримерноц TNF-молекулы. Таким образом, если TNF связывается с TNF-рецепторами на клеточной поверхности, то он способен связываться с тремя рецепторными молекулами, что приводит к образованию TNF-рецепторных кластеров, которые, очевидно, инициируют процесс передачи сигнала, приводящий, в конечном счете, к индуцированию наблюдаемых TNF-эффектов. Хотя TNF обладает множеством полезных эффектов, таких, как способность к разрушению нежелательных клеток, например, опухолевых клеток или вирус-инфицированных клеток, а также к усилению антибактериальной активности гранулоцитов, однако, при этом, TNF обладает множеством нежелательных эффектов, например, таких, которые приводят к тяжелым заболеваниям, включая, аутоиммунные расстройства, ревматоидный артрит, реакция отторжения типа "трансплантат против хозяина" (отторжение трансплантата) и септический шок; причем, подозревается, что TNF является главной причиной патологической деструкции тканей. TNF может также вызывать чрезмерную потерю массы организма (кахексию) путем подавления активности адипоцитов. Кроме того, даже при введении TNF в целях использования его полезной активности, например, при лечении различных злокачественных опухолей или вирусных заболеваний, применяемые дозы TNF часто оказываются достаточно высокими и вызывают у пациента ряд нежелательных цитотоксических побочных эффектов, например, деструкцию здоровой ткани. Поэтому, во всех вышеуказанных случаях, где действие TNF является неблагоприятным, желательно использовать эффективный ингибитор TNF. Было разработано множество TNFблокирующих агентов, включая, растворимые белки, обладающие способностью связываться с TNF и ингибирующие связывание TNF с его рецепторами, и тем самым ингибирующие цитотоксическое действие TNF [см. ЕР 308378, ЕР 398327 и ЕР 568925]. Однако, эти TNF-связывающие белки, или растворимые TNF-рецепторы являются мономерными, а значит, каждый из них способен связываться лишь с одним из мономеров гомотримера TNF. Поэтому, блокирование функции TNF этими белками не может быть полным, поскольку, каждая молекула TNF, связанная с мономерным рецептором, имеет еще два свободных TNFмономера, которые способны связываться с TNFрецепторами клеточной поверхности, и тем самым способствовать неблагоприятному воздействию TNF на клетки. Поэтому, для решения проблемы, связанной с блокированием функции TNF, в соответствии с настоящим изобретением был разработан метод, позволяющий сконструировать гибридные белки, а именно, растворимые олигомерные TNFрецепторы, которые обладают способностью связываться, по крайней мере, с двумя мономерами нативной гомотримерной молекулы TNF. В соответствии с этим методом, указанные растворимые олигомерные рецепторы TNF связываются со 43 своим TNF-лигандом с более высокой авидностью, чем известные ранее полученные растворимые TNF-связывающие белки или рецепторы. Так, например, если растворимый TNF-рецептор настоящего изобретения был получен в форме димера, то он способен связываться с двумя мономерами тримера TNF, что приводит к более полной и более продолжительной нейтрализации TNF вследствие более низкой скорости диссоциации димерных растворимых рецепторов из TNF. Кроме того, эти растворимые олигомерные рецепторы являются также более крупными молекулами, чем их мономерные аналоги, а поэтому, с фармацевтической точки зрения, они обладают большим преимуществом из-за вероятности того, что их выведение из организма будет более медленным. Предпосылкой для разработки растворимых олигомерных рецепторов TNF настоящего изобретения было обнаружение того факта, что внутриклеточный домен р55-TNF-рецептора обладает способностью к самоаасоциации, а также того факта, что в этом внутриклеточном домене (р551С) имеется участок, так называемый "домен смерти", который также обладает способностью к самоассоциации, и который непосредственно, лиганд-независимым образом, может вызывать цитотоксические эффекты на клетках (см. Пример 2). Используя такое свойство к самоассоциации внутриклеточного домена (р55-1С) и его "домена смерти", можно, с помощью стандартной техники рекомбинантных ДНК, сконструировать гибридный белок, содержащий, в основном, весь внеклеточный домен TNF-рецептора, такого, как рецептор р75-R или р55-R, а предпочтительно р55-R, и сшитый с ним, в основном, весь внутриклеточный домен (р55-1С) или его "домен смерти". Таким образом, можно сконструировать новый гибридный продукт, который на своем одном конце, имеет TNF-связывающий домен, т.е., внеклеточный домен рецептора, а на своем другом конце, имеет внутриклеточный домен, или его "домен смерти", способный к самоассоциации. В соответствии с этим, указанный продукт будет обладать способностью к олигомеризации благодаря самоассоциации между двумя его (а возможно и более) внутриклеточными доменами или "доменами смерти", что приведет к образованию олигомеров (или, по крайней мере, димеров), содержащих, по крайней мере, два домена, связывающихся с TNF. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением, было также обнаружено, что рецептор FAS/APO1 имеет самоассоциирующийся внутриклеточный домен, включая самоассоциирующийся "домен смерти", обладающий определенной гомологией с р55-1С и его "доменом смерти" (Пример 2). Поэтому, в соответствии с настоящим изобретением можно сконструировать растворимые олигомерные TNF-рецепторы путем гибридизации внеклеточного домена TNF-рецептора (описанного выше) с внутриклеточным доменом или "доменом смерти" FAS/APO1-рецептора. В обоих вышеуказанных случаях, олигомерные TNF-рецепторы настоящего изобретения являются растворимыми, благодаря лишь тому, что 76933 44 они имеют растворимый внеклеточный домен рецептора TNF и растворимый внутриклеточный домен или его "домен смерти" либо рецептора p55-TMF, либо рецептора FAS/ΑΡΟ1, т.е. они не содержат трансмембранный (нерастворимый) домен какого-либо из указанных рецепторов. Подробное описание конструирования вышеуказанных олиго-мерных рецепторов TNF настоящего изобретения приводится ниже, в Примере". Однако, при этом, следует отметить, что после конструирования олигомерных рецепторов TNF настоящего изобретения может возникнуть ситуация, ранее не описанная, при которой внеклеточный домен рецептора TNF окажется способным к самоассоциации, и такая ситуация может быть нежелательной, поскольку, она будет препятствовать способности олигомерного рецептора связываться с двумя или более мономерами гомотример-ной молекулы TNF, либо она может приводить к менее оптимальному связыванию этих мономеров TNF. Поэтому, во избежание таких ситуаций, можно, с помощью стандартной техники рекомбинантных ДНК, модифицировать внеклеточный домен TNF-рецептора, например, путем делеции или замещения одной или нескольких аминокислотных остатков, содержащихся в самоассоциирующейся области, в целях предупреждения возможной самоассоциации. Такая модификация внеклеточного домена TNFрецептора является, поэтому, также частью настоящего изобретения, а модифицированные таким образом домены являются аналогами или производными внеклеточного домена рецептора TNF. Аналогичным образом, самоассоциирующийся внутриклеточный домен (1С) или его "домен смерти" (DD) рецептора p55-R или рецептора FAS/APO1, используемый в олигомерных рецепторах TNF настоящего изобретения, также может быть аналогом или производным натурального домена, т.е., он может представлять собой любую модификацию последовательности р55-1С или ее фрагментов, включая, "домен смерти" (р55-DD), или любую модификацию последовательности внутриклеточного домена (FAS-1C) или его фрагментов рецептора FAS/APO1, включая "домен смерти" (FASDD), при условии, что в результате этих модификаций образуется самоассоциирующийся продукт. Аналогичным образом, после продуцирования и очистки, растворимые олигомерные рецепторы TNF, их аналоги или производные могут быть затем модифицированы стандартными химическими средствами для образования солей и функциональных производных в целях изготовления фармацевтических композиций, содержащих TNFрецепторы настоящего изобретения в качестве активных ингредиентов. Для продуцирования растворимых олигомерных TNF-рецепторов настоящего изобретения, из существующих клонов полного рецептора TNF получают ДНК-последовательности, кодирующие внеклеточный домен рецептора TNF, и таким же образом получают ДНК-последовательности, кодирующие внутриклеточный домен или его "домен смерти" рецептора TNF, а также внутриклеточный 45 домен или его "домен смерти" рецептора FAS/APO1 (см. Пример 2 и Пример 5). Затем, ДНКпоследовательность нужного внеклеточного домена лигируют с ДНК-последовательностью нужного внутриклеточного домена или его части, содержащей "домен смерти", и полученный таким образом гибридный продукт встраивают (и лигируют) в соответствующий экспрессирующий вектор под контроль промотора или других регулирующих экспрессию последовательностей. После создания такого экспрессирующего вектора, этот вектор вводят в подходящие клетки-хозяева (т.е., эти клетки трансформируют, трансфецируют, и т.п. этим вектором), и после экспрессии указанного вектора в этих клетках получают гидридный продукт настоящего изобретения, который представляет собой растворимую самоассоциирующуюся молекулу рецептора TNF. Затем продуцированные таким образом молекулы выделяют из клеток-хозяев с помощью стандартной техники, и получают в качестве конечного продукта растворимые олигомерные рецепторы TNF. В предпочтительном варианте, гибридные последовательности, кодирующие внеклеточный домен и внутриклеточный домен или его часть, получают с помощью РСR-методики с использованием олигонуклеотидов, специфических к данным целевым последовательностям, копируемым из клонов, кодирующих полную TNF-peцепторную молекулу. При этом можно использовать и другой способ, который заключается в выделении нужных участков, кодирующих внеклеточный домен и внутриклеточный домен, посредством рестриктирующих эндонуклеаз с последующим сплайсингом известным способом для их объединения, без модификации или с модификацией концов рестрикционных фрагментов для гарантии правильности лигирования нужных фрагментов рецептора (т.е., внеклеточного и внутриклеточного его доменов или их частей). Полученные таким образом гибридные продукты затем вставляют в выбранный вектор экспрессии. Аналогично, настоящее изобретение также относится к растворимым олигомерным FAS/APO1 (FAS)-рецепторам, содержащим внеклеточный домен FAS/APO1-рецептора и самоассоциирующийся внутриклеточный домен р55-R (рр55-1С) его "домен смерти" (р55DD), либо самоассоциирующийся внутриклеточный домен FAS/APO1рецептора (FAS-1C) или его "домен смерти" (FAADD), или любые их аналоги или производные (см. выше). Ниже, в Примере 5 приводится подробное описание конструирования этих растворимых олигомерных FAS-рецепторов, где в качестве исходного материала использовали имеющуюся клонированную полноразмерную последовательность, кодирующую рецептор FAS и соответствующие олигонуклеотиды для РСRпродуцирования нужных внеклеточного и внутриклеточного доменов с последующим их лигированием для получения гибридного продукта, который затем встраивали в нужный экспрессирующий вектор. Как подробно описано выше и ниже, для продуцирования нужных растворимых олигомерных FAS-рецепторов могут быть использованы как 76933 46 прокариотические, так и эукариотические клеткихозяева, а после продуцирования этих рецепторов, они могут быть очищены и использованы в качестве активных ингредиентов в фармацевтических композициях. Вышеуказанные растворимые олигомерные FAS-рецепторы настоящего изобретения предназначены для эффективного блокирования FASлиганда, который может также существовать в виде тримера (аналогично TNF, см. выше), причем, каждый из олигомерных рецепторов настоящего изобретения способен связываться с двумя или более FAS-лигандами, и тем самым, нейтрализовывать их активность. Известно, что FASлиганд является, в основном, лигандом, ассоциированным с клеточной поверхностью, но, он может также существовать и в растворимой форме. В любом случае, олигомерные FAS-рецепторы настоящего изобретения способны связываться, по крайней мере, с двумя мономерами этого лиганда, и тем самым способствовать более эффективной (чем мономерные FAS-рецепторы) нейтрализации активности FAS-лиганда. FAS-лиганд, а следовательно, и активация FAS-рецептора, играет значительную роль в возникновении ряда патологических состояний, а в частности, состояний, связанных с повреждением печени (например, апоптоз гепатоцитов), включая повреждения печени, связанные с гепатитом, а также аутоиммунных состояний, включая разрушение (апоптоз) лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных пациентов [см., например, Ogasawara и др., 1993; Cheng, и др., 1994]. Поэтому, растворимые олигомерные FAS-peцепторы настоящего изобретения предназначены для блокирования активности FASлиганда, и могут быть использованы в качестве активного ингредиента в фармацевтических композициях для лечения таких FAS-лигандассоциированных патологических состояний. Аналогичным образом, настоящее изобретение также относится к растворимым олигомерным рецепторам, обладающих аффинностью связывания обоих TNF и РАS-R-лиганда, и представляющих собой так называемые "смешанные" олигомерные рецепторы TNF-R/FAS-R. Эти смешанные олигомерные рецепторы содержат, по крайней мере, один внеклеточный домен TNF-R, и по крайней мере, один внеклеточный домен FAS-R, которые объединяются в олигомерном рецепторе благодаря тому, что каждый из них присоединен к одному из вышеупомянутых самоассоциирующихся р551С, р55DD, FAS1C или FASDD. Эти смешанные олигомерные рецепторы могут быть получены путем: а) продуцирования любого из вышеуказанных гибридных продуктов, которые содержат внеклеточный домен рецептора TNF-R (p75-TNF-R, или предпочтительно p55-TNFR), сшитый с любым одним из самоассоциирующихся доменов р55-1С и FAS-1C или любым одним из самоассоциирующихся "доменов смерти" р55DD и FASDD, или любой его самоассоциирующейся частью, аналогом или производным; b) продуцирования любого из вышеуказанных гибридных продуктов, которые содержат внеклеточный домен FAS-R, сшитый с любым одним из са 47 моассоциирующихся р551С: FAS-1C, р55DD и FASDD, либо с любыми его частями, аналогами или производными; и с) смешивания любого из TNF-специфических гибридных продуктов а) с любым из FAS-R-лиганд -специфических гибридных продуктов b) и получения (после стандартных процедур отбора и очистки) олигомерных (димеров или олигомеров более высокого порядка) рецепторов, содержащих, по крайней мере оба внеклеточных домена TNF-R и FAS-R, которые связаны между собой благодаря способности к самоассоциации сшитых с ними областей 1С или DD. Для получения вышеуказанных смешанных олигомерных рецепторов можно использовать и другой метод, который заключается в котрансформации подходящих клеток-хозяев вышеупомянутыми экспрессирующими векторами, один из которых кодирует TNF-специфические FAS-Rгибридные продукты, а другой кодирует FAS-Rлиганд-специфические FAS-R-гибридные продукты. После экспрессии этих разных гибридных продуктов в клетках-хозяевах, смешанные олигомерные (TNF-R/FAS-R) рецепторы могут быть получены посредством стандартных процедур очистки и отбора. Ценность этих смешанных по своей аффиности олигомерных рецепторов заключается, в первую очередь, в том, что они нейтрализуют оба TNF и FAS-R-лиганда. в том случае, если наблюдается их чрезмерная эндогенная экспрессия, либо в том случае, если после их экзогенного введения, они присутствуют в слишком больших количествах. Недавно проведенные наблюдения указывают на вероятность того, что между функциями FAS-R-лиганда (обычно ассоциированного с клеточной поверхностью) и TNF- (который также может быть ассоциирован с клеточной поверхностью) существует синергизм. Поэтому, в некоторых случаях желательно нейтрализовать оба эти лиганда в одном и том же месте клеточной поверхности, т.е., так, чтобы рецептор со смешанной аффинностью мог блокировать связывание TNF со своим рецептором и связывание FAS-Rлиганда со своим рецептором одновременно. В соответствии с этим, рецепторы со смешанной аффиностью могут быть использованы в качестве активного ингредиента в композициях, предназначенных для лечения таких состояний (см. выше), при которых активность TNF и FAS-Rлиганда является нежелательной. Аналогично, в соответствии с приведенным выше описанием, относящимся к растворимым олигомерным TNF-R, и FAS-R, и смешанным TNFR/FAS-R - олигомерам настоящего изобретения, можно также продуцировать растворимые олигомерные рецепторы других видов или смешанные рецепторы, происходящие от других видов рецепторов, а в частности, от любых других членов суперсемейства TNF/NGF. В этом случае, любые внеклеточные домены различных рецепторов могут быть присоединены к вышеупомянутым самоассоциирующимся внутриклеточным доменам или их фрагментам, либо к любым другим внеклеточ 76933 48 ным доменам членов суперсемейства, которые также обладают способностью к самоассоциации. Экспрессия любого из вышеупомянутых белков настоящего изобретения может быть осуществлена в эукариотических клетках (например, в клетках дрожжей, насекомых или млекопитающих) с использованием соответствующих экспрессирующих векторов. Для этих целей может быть применен любой из известных методов. Так, например, ДНК-молекулы, кодирующие белки, полученные вышеописанным способом, могут быть встроены в специально сконструированные экспрессирующие векторы в соответствии со стандартной техникой [см. Sambrook и др., 1989]. Двухцепочечную ДНК лигируют с плазмидными векторами путем гомополимерного наращивания цепи или путем рестрикционного сшивания с использованием синтетических ДНК-линкеров или техники лигирования по затупленным концам. Для лигирования ДНК-молекул используют ДНКлигазы, а нежелательные участки соединения устраняют путем обработки щелочной фосфатазой. Для осуществления экспрессии нужного белка, экспрессирующий вектор должен Также содержать специфические нуклеотидные последовательности, которые способны регулировать транскрипцию и трансляцию, и которые присоединяют к ДНК, кодирующей нужный белок, так, чтобы могла осуществляться экспрессия гена с последующим продуцированием нужного белка. Для того чтобы данный ген мог транскрибироваться, прежде всего, необходимо, чтобы этому гену предшествовал промотор, который распознается РНК-полимеразой, и с которым эта полимераза связывается, инициируя, таким образом, процесс транскрипции. Существуют различные промоторы, которые действуют с разной эффективностью (сильные и слабые промоторы). Для прокариоритических и эукариотических клеток используются разные промоторы. Промоторы, которые могут быть использованы в целях настоящего изобретения, являются либо конститутивными (нерегулируемыми) промоторами, например, промотор іnt бактериофага Γ, промотор b1a гена -лактамазы рВР322, и промотор CAT гена хлорамфениколацетилтрансферазы рРР325, и т.п., либо индуцируемыми промоторами, такими, как прокариоритические промоторы, включая главные правый и левый промоторы бактериофага Γ (PL, и PR) , промоторы trp, recA, lacZ, lacJ, ompF, и gal E.coli, или trp-lac-гибридный промотор, и т.п. [Gliсk В.P. (1987)]. Для достижения высоких уровней экспрессии гена в прокариотических клетках, помимо использования сильных промоторов, обеспечивающих продуцирование высоких количеств мРНК, необходимо также использовать сайты связывания с рибосомой для гарантии эффективной трансляции мРНК. В качестве примера может служить последовательность Шайна-Дальгарно (последовательность SD), предваряющая инициирующий кодон и комплементарная 3'-концу последовательности 16S-РНК. Для эукариотических хозяев могут быть использованы различные транскрипционные и 49 трансляционные регуляторные последовательности в зависимости от природы хозяина. Эти последовательности могут происходить от вирусных источников, таких, как аденовирус, вирус коровьей папилломы, обезьяний вирус, или т.п., где регуляторные сигналы ассоциируются с конкретным геном, который обладает высоким уровнем экспрессии. В качестве примеров могут служить промотор ТК вируса герпеса, ранний промотор вируса SV 40, промотор дрожжевого гена GAL4, и т.п. Регуляторные последовательности инициации транскрипции могут быть выбраны так, чтобы они позволяли осуществлять репрессию и активацию экспрессии генов в целях ее модуляции. ДНК-молекулу, имеющую нуклеотидную последовательность, кодирующую гибридные белки настоящего изобретения, вводят в вектор, имеющий соответствующим образом присоединенные транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности, способные интегрировать нужные генные последовательности в клеткихозяева. Клетки, которые были стабильно трансформированы введенной ДНК, могут быть отобраны путем введения одного или нескольких маркеров, позволяющих проводить отбор клеток-хозяев, содержащих данный экспрессирующий вектор. Маркер может обеспечивать фототрофию ауксотрофным хозяевам, резистентность к биоциду, например, к антибиотикам или к тяжелым металлам, таким, как медь, и т.п. Селектируемый генмаркер может быть либо непосредственно присоединен к экспрессируемой генной ДНКпоследовательности, либо введен в ту же самую клетку путем ко-трансфекции. Для оптимального синтеза белков настоящего изобретения могут быть также введены дополнительные элементы. Такими элементами являются транскрипционные промоторы, энхансеры, и сигнал терминации. Векторы экспрессии кДНК, вводящие указанные элементы, [описаны Оkауаma Н. (1983)]. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, введенную ДНКмолекулу встраивают в плазмиду или вирусный вектор, способный к автономной репликации в клетке-реципиенте. При отборе конкретной плазмиды или вирусного вектора, важными факторами являются: легкость распознавания и отбора клеток-реципиентов, содержащих данный вектор, из клеток, не содержащих этого вектора; число копий вектора, которое необходимо получить в данном конкретном хозяине; и тот факт, является ли желательным использовать "челночный" вектор, способный реплицироваться в клетках-хозяевах различных типов. Предпочтительными прокариотическими векторами являются плазмиды, например, плазмиды, способные реплицироваться в E.coli , такие, как рВР322, ColE1, pSC101, рАСУС 184, и т.п. [см. Maniatis и др., 1982; Sambrook и др., 1989]; плазмиды бацилл (Bacilluc), такие, как рС194, рС221, рТ127, и т.п. [Gryczan Т. 1982]; плазмиды Streptomyces,включая plJ101 [Kendall K.J. и др., 1987]; бактериофаги Streptomyces, такие, как ØС31 [Chater, K.F. и др., в: Sixth Іntеrnational Simpjsium on Actinomycetales Biokogy, (1986); и 76933 50 плазмиды Pseudcomonas (John, J.F. и др. 1986; и Izaki к., 1978)]. Предпочтительными эукариотическими плазмидами являются BPV, вирус коровьей оспы, Sv 40, 2-х микронное кольцо, и т.п., или их производные. Эти плазмиды хорошо известны специалистам [Botstein D. и др., 1982; Broach J.R., в: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces; Life Сесle and Inheritance (1981); Broach J.R. (1982); Bollon D.P. et al., (1980); Maniatis Т., в: Cell Biology; A Comprehensive Treatise. Vol.3; Gene Expression, (1980); и Sambrook et al., 1989]. После получения вектора или ДНКпоследовательности, содержащей конструкцию, предназначенную для экспрессии, эта ДНКконструкция может быть введена в соответствующую клетку-хозяина любым из подходящих способов, например, путем трансформации, трансфекции, конъюгации, слияния протопластов, электропорации, осаждения фосфатом кальция, непосредственной микроинъекции, и т.п. Клетки-хозяева, используемые в настоящем изобретении могут быть прокариотическими или эукариотическими. Предпочтительными прокариотическими хозяевами являются бактерии, такие, как Е.соlі., Стрептомицеты, Псевдомонады, Сальмонеллы, Serrata и т.п. Наиболее предпочтительными прокариотическими хозяевами являются E.coli. Из бактериальных хозяев, особый интерес представляют штамм E.coli K12 294 (АТСС 31446), E.coli Х1776 (АТСС 31537), E.coli W3110 (F-, лямбда , прототрофный (АТСС 27325)), и другие энтеробактерии, такие, как Salmonella typhimurium или Serratis marcescens и различные виды Pseudomonas в таких условиях, белок не будет гликозилирован. Прокариотические хозяева должны быть совместимыми с репликоном и регуляторными последовательностями в экспрессирующей плазмиде. Предпочтительными эукариотическими хозяевами являются клетки млекопитающих, например, клетки человека, обезьян, мышей, и клетки яичника китайского хомячка, поскольку они обеспечивают посттрансляционную модификацию белковых молекул, включая, правильную ее укладку или гликозилирование в нужных сайтах. Дрожжевые клетки также способны осуществлять посттрансляционную модификацию пептидов, включая гликозилирование. Для продуцирования нужных белков в дрожжевых клетках существует ряд методов с применением технологии рекомбинантных ДНК, где используются сильные промоторы и высококопийные плазмиды. Дрожжевые клетки распознают лидерные последовательности на клонированных генных продуктов млекопитающих, и секретируют пептиды, несущие лидерные последовательности (т.е., пре-пептиды). После введения вектора, клетки-хозяева культивируют в селективной среде, используемой для отбора на рост векторсодержащих клеток. Экспрессия клонированных генных последовательностей приводит к продуцированию нужных белков. Очистку рекомбинантных белков осуществляют любым из известных методов, обычно применяемых для этой цели, например, путем экстрак 51 ции, преципитации, хроматографии, электрофореза, или т.п. Предпочтительным способом очистки белков настоящего изобретения является · аффинная хроматография с использованием моноклональных антител против ΤΝF-рецептора, иммобилизованных на гелевом матриксе, содержащемся в колонке. Для этого, неочищенные препараты, содержащие рекомбинантный белок, пропускают через колонку. Белок связывается с колонкой с помощью специфических антител, тогда, как неочищенные белки будут проходить через колонку. После промывки, белок элюируют из геля путем изменения рН или ионной силы. Как указывалось выше, термин "соли" относится к солям, образованным карбоксильными группами, и к кислым солям присоединения аминогрупп белковой молекулы, которые получают известными методами. Солями карбоксильной группы являются неорганические соли, например, натриевые и кальциевые соли, а также соли, образованные органическими основаниями, например, аминами, такими, как триэтаноламин, аргинин, или лизин. Кислыми солями присоединения являются, например, соли минеральных кислот и соли органических кислот. Термин "функциональные производные", используемый в настоящем описании, относится к производным, которые могут быть получены путем модификации функциональных групп, присутствующих в качестве боковых цепей на аминокислотных остатках, или N-или С-концевых групп методами, хорошо известными специалистам, при этом, все такие производные входят в объем настоящего изобретения при условии, что они являются фармацевтически приемлемыми, т.е., они сохраняют активность исходного белка, и не наделяют токсическими свойствами содержащие их композиции. Такими производными являются алифатические сложные эфиры или амиды карбоксильных групп, и N-ацильные производные свободных аминогрупп, или О-ацильные производные свободных гидроксильных групп, образованные ацильными группами (например, алканоильной или карбоциклической ароильной группами). Термин "фракции", используемый в настоящем описании, относится к любой части или фрагменту рецептора (его внутриклеточному или внеклеточному доменам), или белка, связывающегося внутриклеточным доменом рецептора, где указанные части или фрагменты сохраняют биологическую активность данного рецептора или белка. Как указывалось выше, настоящее изобретение также относится к различным фармацевтическим композициям, содержащим фармацевтически приемлемый носитель и различные вышеописанные активные ингредиенты настоящего изобретения или их соли, функциональные производные, или любые их смеси. Эти композиции могут быть использованы в любых из условий, описанных в настоящей заявке, например, в условиях сверхпродуцирования эндогенных ΤΝF, например, при септическом шоке, кахексии, реакции отторжения 76933 52 по типу "трансплантат против хозяина", аутоиммунных заболеваниях, таких, как ревматоидный артрит, и т.п. Способ введения композиций настоящего изобретения может быть любым способом, приемлемым для введения подобных агентов, и зависит от цели и условий введения, так, например, если используемая композиция предназначена для ингибирования действия ΤΝF, то она может быть введена внутривенно, например, в случае септического шока, или путем местной инъекции, например, в случае ревматоидного артрита (например, в колено), или непрерывно, путем вливания, и т.п. Композиции настоящего изобретения могут быть также использованы в случае ΤΝF-интоксикации, вызванной экзогенным введением слишком высоких количеств (передозировкой) ΤΝF, например, при противораковой или противовирусной терапии. Фармацевтические композиции настоящего изобретения получают путем смешивания белка или его производных с физиологически приемлемыми носителями, стабилизаторами и наполнителями, и изготавливают в виде лекарственной формы, например, путем лиофилизации в фармацевтических флаконах. Количество активного соединения, необходимое для введения, зависит от способа введения, конкретного заболевания, и состояния пациента. Так, например, местная инъекция при воспалении в случае ревматоидного артрита потребует меньшего количества активного ингредиента на массу тела, чем внутривенное вливание в случае септического шока. Другие аспекты настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующих примеров. Более подробно, настоящее изобретение изложено в нижеследующих примерах, не ограничивающих, однако, объема настоящего изобретения, и проиллюстрировано сопровождающими его рисунками. Пример 1 Клонирование и выделение белков, связывающихся с внутриклеточными доменами рецепторов р55- и p75-ΤΝF Для выделения белков, взаимодействующих с внутриклеточными доменами р55- и р75-ΤΝFрецепторов (р551С и р751С), была использована дрожжевая двухгибридная система (Fields & Song, 1989). Эта двухгибридная система представляет собой генетический анализ с использованием дрожжевых клеток, проводимый для детекции специфических взаимодействий "белок-белок" in vivo путем восстановления эукариотического транскрипционного активатора, такого, как GAL4, имеющего два отдельных домена: "ДНКсвязывающий домен" и "домен активации"; причем, при экспрессии этих доменов и их связывания друг с другом образуется репарированный белок GAL4, обладающий способностью связываться с вышерасположенной активирующей последовательностью, которая, в свою очередь, активирует промотор, контролирующий экспрессию "репортерного" гена, такого, как lacZ или HIS3, и эту экспрессию репортерного гена можно легко наблюдать в культивируемых клетках. В этом анализе, гены для кандидатов взаимодействующих 53 белков клонировали в отдельных экспрессирующих векторах. В одном экспрессирующем векторе, последовательность одного белка-кандидата клонировали в соответствующей фазе с последовательностью ДНК-связывающего домена GAL4, в результате чего получали гибридный белок с ДНКсвязывающим доменом GAL4, а в другом векторе, последовательность второго белка-кандидата клонировали в той же фазе с последовательностью домена активации GAL4, в результате чего получали гибридный белок с доменом активации GAL4. Затем эти двухгибридные векторы котрансформировали в дрожжевой штамм, имеющий "репортер-ный" ген lacΕ или HIS3, регулируемый вышерасположенными сайтами связывания GAL4. В результате этого, лишь трансформированные клетки-хозяева (котрансформанты), в которых экспрессируются два гибридных белка, способные связываться друг с другом, будут экспрессировать репортерный ген. В случае использования репортерного гена lacΕ, клеткихозяева, экспрессирующие этот ген, будут окрашиваться в синий цвет при добавлении в культуру Х-gal. Поэтому синий цвет колоний будет указывать на то, что два клонированных белкакандидата способны взаимодействовать друг с другом. Используя указанную двухгибридную систему, внутриклеточные домены р551С и р751С клонировали отдельно в вектор рGВТ9 (несущий ДНКсвязывающую последовательность GAL4; поставляется фирмой CLONTECH, USА, см. ниже), в результате чего получали гибридные белки с ДНКсвязывающим доменом GAL4 (аналогичным образом, внутриклеточный домен, FAS-1С и часть р551С, а именно 55DD были клонированы также в рGBT9 и использованы для выделения других 1Ссвязывающих белков, см. ниже Пример 3). Для клонирования р551С и р751С в рGBT9, были использованы клоны, кодирующие полноразмерные кДНК-последоaтельности p55-TNF-R, [Schall и др., 1990] и p75-TNF-R [Smith и др., 1990], из которых были вырезаны внутриклеточные домены следующим образом: с помощью ферментов ЕсоRl и Sall вырезали р551С, после чего ЕсоRl-Sallфрагмент, содержащий последовательность р551С, выделяли стандартным способом, и вставляли в вектор, рестриктирован-ный, в области сайта множественного клонирования (MCS), ферментами ЕсоRІ и Sall. р751С вырезали с использованием ферментов BspHl и Sall, после чего, BSpHl-Sall-фрагмент, содержащий р751Споследовательность, выделяли стандартным способами, и застраивали фрагментом Кленова, в результате чего получали фрагмент, который вставляли в вектор pGBT9, ресктриктированный ферментом Smol и Sall. Затем вышеописанные гибридные (химерные) векторы ко-трансфецировали (отдельно, одну котрансфекцию осуществляли с использованием р551С-гибридного вектора, и одну с использованием р75-гибридного вектора) вместе кДНКбиблиотекой от клеток HeLa человека, клонированной в вектор pGAD GH, несущий домен активации GAL4, в дрожжевой штамм HF7c (все вы 76933 54 шеуказанные векторы, рGВТ9 и pGAD GH, несущий кДНК-библиотеку клеток НеLа, а также дрожжевой штамм получали из Сlоntech Laboratories, Inc., USA, как часть МАТСННМАKЕR Тwo-Hуbrid System, # PT1265-1). Ко-трансфецированные дрожжи отбирали на их способность к росту в среде, не содержащей гистидин (His--среда), при этом,растущие колонии указывали на положительные трансформанты. Затем отобранные дрожжевые клоны анализировали на их способность экспрессировать ген lасZ, т.е., на их LАСZактивность, путем добавления Х-gаl в культуральную среду, которая подвергается катаболизму с образованием окрашенного синим цветом продукта при участии -галактозидазы, фермента, кодируемого геном lасZ. Таким образом, появление голубых колоний указывает на присутствие активного гена lacZ. Для того, чтобы ген lacZ был активен, необходимо, чтобы в трансформированных клонах активатор транскрипции GAL4 присутствовал в активной форме, а именно, чтобы ДНКсвязывающий домен GAL4, кодируемый одним из вышеуказанных гибридных векторов, был правильно присоединен к домену активации GAL4, кодируемому другим гибридным вектором. Такая комбинация возможна лишь в том случае, когда два белка соединенные с каждым из доменов GAL4, способны к стабильному взаимодействию (связыванию) друг с другом. Таким образом, His+ и голубые (LASZ+) колонии, которые были выделены, являются колониями, котрансфецированными вектором, кодирующим р551С, и вектором, кодирующим белковый продукт, происходящий от клеток HeLa человека, и способный стабильно связываться с p551C; или колониями, трансфецированными вектором, кодирующим Р751С, и вектором, кодирующим белковый продукт клеток HeLa, способный стабильно связываться с р751С. Из вышеуказанных дрожжевых His+, LАСZ+ колоний выделяли плазмидную ДНК, и вводили путем электропорации в штамм НВ101 E.coli в соответствии со стандартной техникой, после чего осуществляли отбор Leu+- и ампициллинустойчивых трансформантов, т.е., трансформантов, несущих гибридный вектор pGADGH, который содержит AmpR- и Leu2 -кодирующие последовательности. Поэтому, указанные трансформанты представляют собой клоны, несущие последовательности, кодирующие новые идентифицированные белки, способные связываться с р551С и р751С. Затем из этих трансформированных E.coli выделяли плазмидную ДНК и проводили повторное тестирование путем: а) повторной трансформации этих клеток исходными гибридными плазмидами, содержащими внутриклеточный домен, (гибридной плазмидой рGТВ9, несущей последовательность р551С или р75-1С) путем встраивания в дрожжевой штамм HF7, как описано выше. В качестве контроля для ко-трансформации плазмидами, кодирующими р551С-связывающий белок или р751Ссвязывающий белок, использовали векторы, несущие последовательности, несущие нерелевантный белок, например, рАСТ-ламин или один 55 76933 pGBT9. Затем ко-трансформированные дрожжи тестировали на рост на одной Нis--среде, или на среде с различными уровнями 3-аминотриазола; и b) повторной трансформации плазмидой ДНК или исходных гибридных плазмид, и контрольных плазмид, описанных в (а), в дрожжевые клеткихозяева штамма SFУ526, и последующего определения LACZ+ -активности (эффективности образования -gal, т.е., развития голубой окраски). Результаты вышеописанных тестов показали, что характер роста колоний в His- -среде идентичен характеру LACG активности, о чем свидетельствовала окраска колоний, т.е., His+ -колонии были также LACZ+. Кроме того, LACZ-активность в жидкой культуре (предпочтительные культуральные условия) оценивали после трансфекции гибридов, содержащих ДНК-связывающий домен и домен активации GAL4, в дрожжевые клетки SFУ526, которые обладают лучшей LACZ индуцибельностью активатором транскрипции GAL4, чем клеткихозяева дрожжевого штамма HF-7. Результаты осуществления вышеуказанных ко-трансфекций представлены ниже в Таблице 1, из которой видно, что обнаруженные белки способны связываться с р551С или p751C, а именно, белки, обозначенные 55.11, которые связываются с р551С; и 75.3 и 75.16, которые связываются с р751С. Все указанные р551С - и р751Ссвязывающие белки являются аутентичными белками человека, кодируемыми кДНКпоследовательностями, происходящими из кДНКбиблиотеки клеток НеLа, и сшитыми с последовательностью домена активации GAL4 в плазмиде pGAD GH в вышеописанной дрожжевой двухгибридной системе анализа. Интересно отметить, что было также обнаружено, что сами фрагменты р551С, а именно, белки, обозначенные 55.1 и 55.3, способны связываться c р551С. Этот факт обсуждается также ниже, в Примере 2. Таблица 1 Суммарные характеристики некоторых кДНК-клонов (см. также Пример 3), выделенных методом с использованием двухгибридной системы Гибрид, содержащий ДНКсвязывающий домен рGВТ9-1С55 рGВТ9-1С55 pGBT9-1C55 рАСТ-ламин рАСТ-ламин pGBT9 pGBT9 pGBT9-1С55 рАСТ-ламин pGBT9 pGBT9-1С75 pGBT9-1C75 рАСТ-ламин pGBT9 pGBT9-1С75 Гибрид, содержащий домен активации 55,1 55,3 55,1 55,3 55,1 55,3 55,1 55,3 55,11 55,11 55,11 55,11 75,3 75,3 75,3 75,3 75,16 75,16 Окраска колоний белая голубая голубая белая белая белая белая белая белая голубая белая белая белая голубая белая белая белая белая голубая белая Lac Z –активность в анализе с использованием жидкой культуры 0,00 0,65 0,04 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 не опр. не опр. не опр. не опр. не опр. не опр. не опр. не опр. не опр. не опр. не опр. 56 рАСТ-ламин pGBT9 75,16 75,16 белая белая не опр. не опр. В вышеприведенной Таблице, представлены следующие плазмиды и гибрид, кодирующий ДНКсвязывающий домен GAL4 и домен активации GAL4: Гибриды, содержащие ДНК-связывающий домен: pGBT9-1C55: полноразмерный внутриклеточный домен р55-TNF-R (р551С) рАСТ-ламин: нерелевантный белок - ламин pGBT9: один вектор pGBT9-1С75: полноразмерный внутриклеточный домен р75-TNF-R (р751С) Гибрид, содержащий домен активации: 55.1 и 55.3 соответствуют фрагментам внутриклеточного домена P55-TNF-R. 55.11: новый белок, ассоциирующийся с p55TNF-R 75.3 и 75.16: новые белки, ассоциирующиеся с p75-TNF-R Вышеуказанные клонированные кДНК, кодирующие новые р551С и р751С-связывающие белки, а именно 55.11, 75.3 и 75.16, были затем секвенированы с использованием стандартных методом секвенирования ДНК. Частичные последовательности всех указанных последовательностей, кодирующих белок, показаны на Рис.1a-с, где на Pис.1(а) показана последовательность кДНК, кодирующая белок 55.11; на Pис.1(b) показана частичная кДНК-последовательность, кодирующая белок 75.3; а на Pис.(с) показана частичная последовательность кДНК, кодирующая белок 75.16. На Pис.1(d) показана аминокислотная последовательность белка 55.11, выведенная из нуклеотидной последовательности, изображенной на Pис.1(а). Однако, при этом, следует отметить, что о последовательности кДНК, кодирующей белок 55.11, также сообщалось [Khan. и др. (1992)] в их исследованиях, посвященных кДНКпоследовательностям головного мозга человека, и направленных на разработку нового быстрого и точного способа секвенирования и физического и генетического картирования кДНК головного мозга человека. Однако, Khan и др. ничего не сообщают о функциях или о каких-либо других свойствах белка, кодируемого 55.11-кДНКпоследовательностью, поскольку такой функциональный и другие анализы не были целью исследований Khan. и его сотрудников. Анализ и характеризация белка 55.11 а) Общая методика и материалы i) Клонирование кДНК 55.11 После анализа (например, Нозерн-анализа, см. ниже) кДНК белка 55.11 было выявлено, что вышеуказанная кДНК белка 55.11, клонированная двухгибридным методом скрининга, представляет собой лишь частичную кДНК белка 55.11, имеющую нуклеотиды 925-2863 (см. Pис.1(а)), которые кодируют аминокислоты 309-900 (см. Pис.1(d). Остальная часть 55.11-кДНК (нуклеотиды 1-924 (Pис.1(а), которые кодируют аминокислоты 1-308 (Pис.1(d)) была получена стандартными метода 57 ми, а именно, путем РСR-клонирования из кДНКбиблиотеки фетальной печени человека (более подробно см. ниже). Полную нуклеотидную последовательность 55.11 (Pис.(а)) определяли в обоих направлениях методом дидезокси-терминации цепи. ii) Двухгибридный метод анализа на экспрессию β-галактозидазы Тест на экспрессию -галактозидазы осуществляли, как описано выше, за исключением того, что вместо вектора рGAD-GН, содержащего домен активации GAL4, использовали вектор pVР16, который содержал домен активации VP16. Нумерация остатков в белках, кодируемых кДНКвставками, была такой же, как в банке данных pGAD- GH. Делеционные мутации продуцировали с помощью РСR, а точечные мутации продуцировали с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза [Kunkel, 1994]. iii) Нозерн-анализ Полную РНК выделяли с использованием ТR1 RЕАGENT (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, Oh., U.S.A.) затем денатурировали в формальдегид/формамидном буфере, подвергали электрофорезу на агарозном/формальдегидном геле, и блокировали на мембрану Gene SCREEN Plus (Duhont, Wilmington, De., USA) в 10х SS РЕбуфере с использованием стандартной техники. Блоты гибридизировали с частичной кДНК белка 55.11 (см. выше, нуклеотиды 925-2863), подвергали радиоактивному мечению с использованием набора для рандомизированного праймирования (bcehrsnger Mannheim biochemica, Mannheim, Germany), и промывали в жестких условиях. Авторадиографию осуществляли в течение 1 недели. iv) Экспрессия кДНК белка 55.11 в клетках НеLа и связывание белка 55.11 с белками, преставляющими собой гибрид глутатион- Sтрансферазы с р55-1С Получали гибриды глутатион-S-трансферазы (GST) с р55-1С (GST-p551C) и с р551С, усеченным ниже аминокислоты 345 (GST-p551C345), и адсорбировали на глутатион-агарозные шарики, как описано ниже в Примере 2 [см. также Smith & Corcoran, 1994; Frangioni & Neel, 1993]. кДНК белка 55.11 (нуклеотиды 1-2863, т.е., кДНК полноразмерного 55.11), PLAG-55.11 и люциферазы экспрессировали в клетках HeLa. FLAG-55.11 представляют собой фрагмент белка 55.11, простирающийся между аминокислотными остатками 309 и 900 (частичная кДНКпоследовательность белка 55.11 (нуклеотиды 9252863), первоначально клонированная методом двухгибридного скрининга), и N-сшитый с октапептидом FLAG (Fastman Kodak, New Haven, Ct. USΑ). Экспрессию гибридных белков осуществляли с использованием тетрациклин-регулируемого экспрессирующего вектора (ΖtTA-1) в клоне клеток НеLа, который экспрессирует тетрациклинрегулируемый трансактиватор (см. ниже, Пример 2, и [Gossen & Bujard, 1992]). Метаболическое мечение экспрессированных белков с помощью [35S] Met и [35S] Cys (Dupont, Wilmington, De USA; 76933 58 Amersham, bucking hamshire, England), лизис клеток HeLa, иммунопреципитацию, и связывание меченных белков с GST-гибридными белками осуществляли как описано ниже (Пример 2), за исключением того, что в буфере для лизиса клеток вместо 0,1% Nonidet Р-40 присутствовал 0,5% Nonidet Р-40. Иммунопреципитацию 55.11 и FLAG55.11 проводили с использованием кроличьей антисыворотки (разведенной 1:500), продуцированной против GSТ-гибридного белка, содержащего область 55.11, простирающуюся между аминокислотами 309 и 900, и мышиного моноклонального антитела против октапептида FLAG (M2; Eastman Kodak 5мкг/мл клеточного лизата). о) Связывание белка 55.11 с р55-1С в трансформированных дрожжах Это исследование было предпринято для выявления природы связывания между 55.11 и р551С, а в частности, для выявления областей этих белков, участвующих в связывании. Для этого была применена двухгибридная методика, описанная выше, где различные полноразмерные и делеционные мутанты р551С (см. также ниже, Пример 2) в конструкциях "ДНК-связывающего домена" были использованы в качестве "приманки" для связывания с "добычей", являющейся неполным белком 55.11, кодируемым в конструкциях, в которых эта неполная 55.11последовательность (остатки 309-900, первоначально выделенные) была присоединена к "домену активации" в векторах GАL4АD и VP16AD. Кроме того, были сконструированы различные делеционные мутанты 55.11, которые были лигированы с "доменом активации" в векторе GAL4AD (например, мутанты 55.11, имеющие лишь остатки 309-680 и 457-900). Связывание различных конструкций со "связывающим доменом" с различными конструкциями с "доменом активации" исследовали в трансфецированных дрожжевых клетках SFУ52б. Связывание оценивали с помощью анализа на экспрессию β-галактозидазы, проведенного двухгибридным методом с использованием мембранного фильтра. Нерелевантные белки SNF1 и SNF4 служили в качестве контроля для конструкций со "связывающим доменом" и "доменом активации", соответственно; "пустые" векторы (т.е., не содержащие Ga14 (pGAD-CH) и VP16 (РVР16) служили в качестве негативного контроля для конструкций с "доменом активации"; а "пустой" Gа14-вектор (рGВТ9) служил в качестве негативного контроля для конструкций со "связывающим доменом". Результаты анализа представлены ниже в Таблице 2, где символы "+++" и "++" указывают на развитие яркой окраски через 20-60 минут после начала анализа, соответственно (положительные результаты связывания); а символ "-" означает отсутствие окраски через 24 часа после начала анализа (отрицательные результаты). Пустое пространство в Таблице 2 означает, что анализ на связывание не проводили). 59 Из результатов, представленных в вышеприведенной Таблице 2, можно сделать вывод, что 55.11 связывается с р55-1С в сайте, который не относится к "домену смерти" (остатки 328-426) р55-1С. Белок 55.11 связывался с укороченным р551С, из которого был делетирован "домен смерти" (конструкция 206-328 в Таблице 2), более эффективно, чем с полным р55-1С. Кроме того, этот белок даже связывался с более укороченным по Сконцу р55-1С (конструкция 206-308), а также с конструкцией, из которой были удалены "домен смерти" и мембрано-проксимальная часть р55-10 (конструкция 243-328). Однако, белок 55.11 не связывался с конструкцией, которая была укорочена по N-концу до аминокислоты 266 (Таблица 2). Эти данные свидетельствуют о том, что сайт связывания для 55.11 расположен в области, простирающейся между остатками 243 и 308 р55-1С, и что N-конец этого сайта связывания находится между остатками 243 и 266. Перенос кДНК для белка 55.11 из первоначального клонированной конструкции "добычи", которая содержала домен активации GAL4, в конструкцию "добычу", содержащую домен активации Р16, не снижал эффективность связывания белка 55.11 с р55-1С (Таблица 2). Таким образом, структура (или структуры), участвующие в этом связывании, очевидно, находится в молекуле 55.11 и не включают в себя сайт слияния 55.11 с доменом активации. Однако, связывания 55.11 с р55-1С не происходит даже при ограниченном усечении белка 55.11 в его С (55.11-конструкция 309-680)-конце или N-конце (55.11-конструкция 457-900). (Остаток 309 является первым остатком в белке 55.11, ко 76933 60 дируемым частичным кДНК-клоном, первоначально выделенным при двухгибридном скрининге). Наблюдаемое связывание между 55.11 и р551С является, очевидно, специфическим, поскольку 55.11 не связывался с другими белками, включая три рецептора семейства рецепторов TNF/NGF (р75-R, FAS/ΑΡΟ1 и СD40), и с такими белками, как ламин и циклин D (данные не приводятся). При этом, следует отметить, что из других проанализированных TNF/NGF-рецепторах белков были также протестированы те их части, которые содержали внутриклеточные домены: FAS-R человека (остатки 175-319), CD40 (остатки 216-277) и р75-ТNF-R (остатки 287-461), и ни один из них не связывался с 55.11 (данные не приводятся). с) Нозерн-анализ РНК от нескольких клеточных линий с использованием 55.11-кДНК в качестве зонда, и клонирование полноразмерной 55.11кДНК. Исследуемыми клеточными линиями были клетки НеLа, СЕМ, Jurkat и НерG2, происходящие от эпителиальной карциномы человека, острого лимфобластного Т-клеточного лейкоза, острого Тклеточного лейкоза, и гепатоцеллюлярной карциномы, соответственно. Сначала выделенную 55.11-кДНК (нуклеотиды 925-2863) использовали в качестве зонда. Образцы состояли из 10мкг РНК на дорожку. Результаты Нозерн-анализа показаны на Pис.2, на котором воспроизведен Нозерн-блот. Таким образом, из Pис.2 видно, что в результате Нозерн-анализа, проведенном для нескольких клеточных линий с использованием 55.11кДНК в качестве зонда, был выявлен один гибридизирующийся транскрипт, примерно 3кb , который был крупнее чем кДНК (2кb) от первоначально выделенной 55.11-кДНК. Используя олигонуклео