Спосіб отримання двонульових ліній-відновників фертильності brassica napus, що мають хорошу агрономічну властивість

1. Спосіб одержання двонульових ліній - відновників фертильності Brassica napus для чоловічої цитоплазматичної стерильності (ЦЧС) Ogura, що являє собою інтрогресію редьки, яка несе генвідновник фертильності Rfo, вирізаний з алеля Pgi-2 редьки і рекомбінований з геном Pgi-2 з Brassica oleracea, що мають агрономічну властивість, що характеризується жіночою фертильністю, здатністю до перенесення Rfo і вегетаційною потужністю, де згаданий спосіб включає наступні стадії: a) схрещування двонульових ЦЧС-ліній ярового Brassica napus, що містять вирізану вставку геному редьки, з двонульовою яровою лінією Drakkar для формування гетерозиготних рослин з відновленою фертильністю Brassica napus, b) опромінення перед мейозом гетерозиготних рослин з відновленою фертильністю, одержаних на стадії а) гамма-променями, c) перехресне запилення пилком з квіток, одержаних на стадії b), з двонульовою яровою ЦЧС-лінією Wesroona, UA (21) a200601037 (22) 05.07.2004 (24) 25.11.2010 (86) PCT/IB2004/002491, 05.07.2004 (31) 03291677.7 (32) 04.07.2003 (33) EP (31) 03293057.0 (32) 08.12.2003 (33) EP (46) 25.11.2010, Бюл.№ 22, 2010 р. (72) ПРІМАР-БРІССЕ КАТРІН, FR, ДЕЛУРМ РЕЖІН, FR, ПУПАР ЖАН-П'ЄР, FR, ОРВЕ РАЙМОНД, FR, БЮДАР ФРАНСУАЗ, FR, ПЕЛЛЕТЬЄ ЖОРЖ, FR, РЕНАР МІШЕЛЬ, FR (73) ЕНСТІТЮ НАСЬОНАЛЬ ДЕ ЛЯ РЕШЕРШ АГРОНОМІК, FR (56) DESLOIRE SOPHIE ET AL: "Identification of the fertility restoration locus, Rfo, in radish, as a member of the pentatricopeptide-repeat protein family." EMBO REPORTS, vol. 4, no. 6, June 2003 (2003-06), pages 588-594 DELOURME R ET AL: "Characterisation of the radish introgression carrying the Rfo restorer gene for the Ogu-INRA cytoplasmic male sterility in rapeseed (Brassica napus L.)" THEORETICAL AND APPLIED GENETICS, vol. 97, no. 1-2, July 1998 (1998-07), pages 129-134 DELOURME R ET AL: "LINKAGE BETWEEN AN ISOZYME MARKER AND A RESTORER GENE IN RADISH CYTOPLASMIC MALE STERILITY OF RAPESEED (BRASSICA NAPUS L.)" THEORETICAL AND APPLIED GENETICS, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 85, 1992, pages 222-228 DELOURME R ET AL: "IDENTIFICATION OF RAPD MARKERS LINKED TO A FERTILITY RESTORER GENE FOR THE OGURA RADISH CYTOPLASMIC MALE STERILITY OF RAPESEED (BRASSICA NAPUS L.)" THEORETICAL AND APPLIED GENETICS, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 88, no. 6/7, 1994, pages 741-748 2 (19) 1 3 d) тестування потомства на наявність комбінації з п'яти маркерів, вибраних з PGIol, PGIUNT, PGIint, маркер PGIol: маркер PGIUNT: маркер PGIint: маркер BolJon: маркер CP418: 92581 4 BolJon і CP418, де вказані маркери мають наступні послідовності: 5 і e) селекція ліній потомства, що демонструють наявність вказаної комбінації п'яти маркерів. 2. Спосіб за п. 1, де доза опромінення на стадії b) становить 65 Грей протягом 6 хвилин. 3. Двонульова лінія-відновник фертильності Brassica napus для чоловічої цитоплазматичної стерильності (ЦЧС) Ogura, що являє собою вставку Rfo, вирізану з алеля Pgi-2 редьки і рекомбіновану з геном Pgi-2 Brassica oleracea, і яка має агрономічну властивість, що характеризується жіномаркер PGIol: маркер PGIUNT: маркер PGIint: маркер BolJon: 92581 6 жіночою фертильністю, здатністю до перенесення Rfo і вегетаційною потужністю, що відрізняється тим, що вказана двонульова лінія-відновник фертильності Brassica napus для ЦЧС Ogura характеризується наявністю комбінації п'яти маркерів, вибраних з PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon и CP418, де маркер BolJon забезпечує присутність смуги редьки, смуги Brassica oleracea і смуги Brassica rapa в гомозиготах вказаних ліній-відновників; і де вказані маркери мають наступні послідовності 7 92581 8 маркер CP418: . 4. Гібридні рослини Brassica napus і їх потомство, одержане шляхом виконання наступних стадій: a) одержання лінії-відновника фертильності за п. 1 і її схрещування для одержання гомозигот, b) використання вказаної лінії-відновника фертильності в польовому одержанні гібриду як запилювача, c) використання стерильних ЦЧС-рослин у польовому отриманні гібриду як рослини, що продукує насіння, і d) збирання гібридного насіння з чоловічої стерильної рослини. маркер PGIol: маркер PGIUNT: маркер PGIint: 5. Насіння рослини Brassica, розвинене в лінії Brassica, одержаній за п. 1. 6. Насіння Brassica napus, одержаного за п. 4. 7. Застосування комбінації щонайменше п'яти маркерів PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon і СР418 для селекції рекомбінованої лінії-відновника фертильності Brassіca napus для ЦЧС Ogura, що містить вставку Rfo, вирізану з алеля Pgi-2 редьки, рекомбіновану з геном Pgi-2 Brassica oleracea, і яка має агрономічну властивість, що характеризується жіночою фертильністю, наявністю перенесення Rfo і вегетаційною потужністю, де вказані маркери мають наступні послідовності: 9 92581 10 маркер BolJon: маркер CP418: . 8. Застосування за п. 7, де: - маркер PGIol ампліфікується з використанням праймерів: PGIol U і PGIol L, що мають наступні послідовності: PGIol U: 5'TCATTTGATTGTTGCGCCTG3'; PGIol L: 5'TGTACATCAGACCCGGTAGAAAA3'; - маркер PGIint ампліфікується з використанням праймерів: PGIint U і PGIint L, що мають наступні послідовності: PGIint U: 5'CAGCACTAATCTTGCGGTATG3'; PGIint L: 5'CAATAACCCTAAAAGCACCTG3'; - маркер PGIUNT ампліфікується з використанням праймерів: PGIol U і PGIint L, що мають наступні послідовності: PGIol U: 5'TCATTTGATTGTTGCGCCTG3'; PGIint L: 5'CAATAACCCTAAAAGCACCTG3'; - маркер BolJon ампліфікується з використанням праймерів: BolJon U і BolJon L, що мають наступні послідовності: BolJon U: 5'ATCCGATTCTTCTCCTGTTG5'; BolJon L: 5'GCCTACTCCTCAAATCACTCT3'; - маркер СР418 ампліфікується з використанням праймерів; SG129 U і рСР418 L, що мають наступні послідовності: SG129 U: згідно з Giancola et al (5); pCP418 L: 5'AATTTCTCCATCACAAGGACC3'. Винахід відноситься до способу отримання двонульових ліній-відновників фертильності рапсу Brassica napus з цитоплазматичною чоловічою стерильністю (ЦЧС) Ogura, що являє собою інтрогресію редьки, що несе ген-відновник фертильності Rfo, вирізаний з алеля Pgi-2 редьки і рекомбінований з геном Pgi-2 Brassica oleracea, які мають хорошу агрономічну властивість, що відрізняється жіночою фертильністю, хорошим рівнем перенесення Rfo і високою вегетаційною потужністю. Винахід також відноситься до способу отримання гібридного насіння Brassica napus і його потомства, а також використання маркерів для селекції. Лінії-відновники фертильності для розмноження системи чоловічої цитоплазматичної стерильності (ЦЧС) Ogu-INRA рапсу (Brassica napus L.) були основою метою досліджень протягом останніх декількох років. Широке зворотне схрещування і селекція були необхідні для поліпшення їх жіно чої фертильності та отримання двонульових лінійвідновників фертильності. Так звані «double low двонульові» різновиди - це ті, які містять низький рівень ерукової кислоти, а також низький рівень глюкозинолатів у шроті після екстракції олії. Однак, у розмноженні цих ліній все ще можуть зустрічатися труднощі (перебудови інтрогресії, ймовірний зв'язок з негативними особливостями) внаслідок великої величини інтрогресії редьки. Тому, автори винаходу поставили собі на меті отримання нової поліпшеної двонульової лінії відновника фертильності з хорошою агрономічною властивістю. Ця мета була досягнута новим способом отримання рекомбінантної двонульової лінії - відновника фертильності для ЦЧС Ogu-INRA рапсу. Перше завдання даного винаходу відноситься до способу отримання двонульових ліній-відновників фертильності Brassica napus для чоловічої цито 11 плазматичної стерильності (ЦЧС) Ogura, що являє собою інтрогресію редьки, яка несе ген-відновник фертильності Rfo, позбавлений алеля Pgi-2 редьки і рекомбінований з геном Pgi-2 з Brassica oleracea; які мають хорошу агрономічну властивість, що відрізняється жіночою фертильністю, хорошим рівнем перенесення Rfo і високою вегетаційною потужністю, згаданий спосіб включає в себе наступні стадії: a) схрещування двонульових ліній ЦЧС ярового рапсу Brassica napus з вирізаною вставкою геному редьки з двонульовою лінією ярового рапсу сорту Drakkar для формування гетерозиготної рослини Brassica napus з відновленою фертильністю, b) опромінення перед мейозом гетерозиготних рослин з відновленою фертильністю, отриманих на стадії а), гамма-променями, c) перехресне запилення квіток, отриманих на стадії b), з двонульовою яровою лінією ЦЧС Wesroona, d) тестування потомства на потужність, жіночу фертильність і рівень переносу гена ЦЧС, e) селекція ліній потомства. У даному винаході термін «лінія(ії)» означає рослину, яка в основному гомозиготна і відтворюється самозапиленням. Спосіб за п. 1, в якому доза опромінення на стадії b) становить 65 Грей протягом 6хв. Відповідно до однієї з переважних форм реалізації способу за даним винаходом двонульова лінія ЦЧС ярового Brassica napus на стадії а) є лінією R211. R211 являє собою ярову лінію-відновник фертильності INRA. Drakkar - це зареєстрований яровий французький різновид. Wesroona - це зареєстрований яровий австралійський різновид. Відповідно до однієї з переважних форм реалізації способу за даним винаходом тестування виконується з комбінацією з п'яти маркерів, вибраних з PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon і СР418. Інше завдання даного винаходу відноситься до двонульових ліній-відновників фертильності Brassica napus для ЦЧС Ogura, що являють собою делецію вставки Rfo в алелі Pgi-2 редьки, рекомбінованої з геном Pgi-2 Brassica oleracea, і мають хороші агрономічні властивості, які відрізняються жіночою фертильністю, хорошим рівнем перенесення Rfo і високою вегетаційною потужністю. Відповідно до однієї з переважних форм реалізації двонульові лінії-відновники фертильності являють собою унікальну комбінацію п'яти маркерів, вибраних з PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon і СР418. Інше завдання даного винаходу відноситься до способу формування гібридних рослин Brassica napus та їх потомства, отриманих наступними стадіями: a) отримання ліній-відновників фертильності, продукованих за пунктом 1, і схрещування їх для отримання гомозигот, b) використання згаданої лінії-відновника фертильності на ділянці для отримання гібриду як запилювача, 92581 12 c) використання ЦЧС стерильних рослин для отримання гібридів на ділянці як рослин, що продукують гібридне насіння і d) збір гібридного насіння з чоловічих стерильних рослин. Інше завдання даного винаходу відноситься до насіння рослин Brassica, отриманих способом за даним винаходом. Ще одне завдання винаходу відноситься до насіння Brassica napus, депонованого в NCIMB Limited (Національні Колекції індустріальних харчових і морських бактерій), 23 St Machar Drive, Aberdeen, Scotland, AB24 3RY, UK, 4 липня, 2003 під номером NCIMB41183. Інше завдання даного винаходу відноситься до використання щонайменше чотирьох маркерів PGIol, PGIint, BolJon і СР418 або якої-небудь їх частини, що утворює щонайменше один поліморфний сайт, для характеризації рекомбінованих ліній-відновників фертильності Brassica napus для ЦЧС Ogura, які мають делецію вставки Rio в алеля Pgi-2 редьки і рекомбінованих з геном Pgi-2 Brassica oleracea, і таких, що мають хорошу агрономічну властивість, яка відрізняється жіночою фертильністю, хорошим рівнем перенесення Rfo і високою вегетаційною потужністю. У переважному варіанті реалізації комбінація утворена п'ятьма маркерами PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon і СР418. У даному винаході вираз "яка-небудь частина їх, що утворює щонайменше один поліморфний сайт" означає яку-небудь частину послідовності, яка демонструє щонайменше відмінність між послідовністю типу В.oleracea і послідовністю типу В.rара. Такі маркери представлені у нижченаведених фігурах і списках послідовностей лінії R2000. Відповідно до однієї із переважних форм реалізації даний винахід відноситься до: - маркера PGIol, який ампліфікований з використанням праймерів PGIol U і PGIol L (PGIol U: 5TCATTTGATTGTTGCGCCTG31; PGIol L: 5TGTACATCAGACCCGGTAGAAAA3'). - маркера PGIint, який ампліфікований з використанням праймерів PGIint U і PGIint L (PGIint U: 5'CAGCACTAATCTTGCGGTATG3'; PGIint L: 5'CAATAACCCTAAAAGCACCTG3') - маркера PGIUNT, який ампліфікований з використанням праймерів PGIol U і PGIint L: (PGIol U: 5TCATTTGATTGTTGCGCCTG3'; PGIint L: 5'CAATAACCCTAAAAGCACCTG3') - маркера BolJon, який ампліфікований з використанням праймерів BolJon U і BolJon L: (BolJon U: 5'GATCCGATTCTTCTCCTGTTG3'; BolJon L: 5'GCCTACTCCTCAAATCACTCT3') - маркера СР418, який ампліфікований з використанням праймерів SG129 U і pCP418L: (SG129 U: cf Giancola et al, 2003 TheorAppl. Genet (inpress); pCP418 L: 5'AATTTCTCCATCACAAGGACC3'). Інше завдання даного винаходу відноситься до маркерів PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon і СР418, з наступними послідовностями: 13 Маркер PGIol R2000: Маркер PGIUNT R2000: Маркер PGIint R2000: Маркер BolJon R2000: Маркер CP418L R2000: 92581 14 15 У нижченаведених кресленнях, що додаються, використані наступні скорочення: Dra Drakkar Rel-15-1, E38, R15 R2000 Hete, Неl, R211 Drakkar гетерозиготний R211 *Drakkar, Darm Darmor Bol: Brassica oleracea Bra, B.rap: Brassica rapa GCP A18-А 19, Wes, Aust: Wesroona Sam, SamlPGIolSunt5 Samourai RRH1, ba2c RRH1 rav, N.WR гібрид Brassica napus*дика редька Фіг.1 ілюструє опромінення гамма-променями і продукцію F2. Фіг.2 ілюструє результати сіяння насіння "R211" і "R2000". Фіг.3 ілюструє кількість насіння на стручок у різних лініях. Фіг.4 ілюструє локалізацію праймера PGIol у сегменті послідовності PGI з бази даних. На цій фігурі: PGIol: - праймер PGIolU (що іменується в SGAP (Society for Growing Australian Plants - Товариство австралійських рослин): BnPGIch 1 U) - праймер PGIol L (що іменується в SGAP: Bn PGIch 1 L) PGIint: - праймер PGIint U - праймер PGIint L (за межами наведеної послідовності). Фіг.5 ілюструє гель-електрофорез гена PGI-2 (PGIol), маркера ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція) і SG34, маркера ПЛР, близького до Rfo. Фіг.6 ілюструє сегмент ДНК Pgi-2, ампліфікований за допомогою ПЛР з праймерами PGIol. Фіг.7 ілюструє переварювання продукту ПЛР PGIol за допомогою Msel. На цій фігурі: Sam і Darm представлені смугою 75 bр (пар основ). Drak, R21 1.Dk і R2000 представлені смугою 70 bр (Акриламід 15%). 8 - схоже з Samourai (75 bр); суміш з Drakkar (70 bр) дозволяє візуалізацію двох смуг. Фіг.8 ілюструє електрофорез маркера PGIUNT в агарозному гелі. На цій фігурі: смуга PGIUNT (близько 980bр) представлена в B.oleracea, B.rapa cv Asko, що підтримує і відновлює фертильність у лініях за винятком "R211". Ампліфікація у редьці та Arabidopsis відсутня. У різних генотипах Brassica ампліфікувалася тільки одна смуга. Розмір смуги схожий, але послідовності різні. Фіг.9 ілюструє гель-електрофорез маркера ПЛР PGIint. На цій фігурі PGIint лінії 7 редьки має близько 950 bр. Це така сама смуга, як у відновлених RRH1 і R113. Вона не виявлена в R211. Її також немає в R2000. Однак, смуга PGIint має схожий розмір близько 870 bр у різних видах роду Brassica, але послідовності відрізняються. Фіг.10 ілюструє електрофорез маркера ПЛР BolJon в агарозному гелі. 92581 16 Фіг.11 ілюструє електрофорез маркера СР418 в агарозному гелі. На цій фігурі смуга СР418 (близько 670 bр) специфічна для геному B.oleracea. Вона представлена у В.оі*, В.napus (Samourai, Drakkar, Pactol і гетерозиготного R2111*Dk). Вона відсутня у ріпаку з відновленою фертильністю (RRH, R113 і R211). Вона присутня у гомозиготної R2000. Фіг.12 ілюструє сумарну таблицю маркерів. Фіг.13 (13(а), 13(b)) ілюструють порівняльний аналіз первинної структури маркера PGIol з Arabidopsis, редькою, B.rapa, B.oleracea і R2000. Фіг.14 (14(а), 14(b), 14(c), 14(d)) ілюструють порівняльнийаналіз первинної структури маркера PGlint-UNT з Arabidopsis, редькою, B.rapa, B.oleracea і R2000. Фіг.15 (15(а), 15 (b), 15(с)) ілюструють порівняльний аналіз первинної структури маркера СР418L з Arabidopsis, редькою, B.rapa, B.oleracea і R2000. Фіг.16 (16 і 16bis) ілюструє маркери BolJon у Arabidopsis, редьки і B.rapa. Їх первинна структура порівнюється з послідовностями DB Arabidopsis (AC007190 кінцева ділянка - АС011000 початкова ділянка), кінцевою ділянкою ЕМВН959102 і початковою ділянкою ЕМВН448336 B.oleracea і репрезентативною консенсусною послідовністю смуг 1 і 2 маркерів SG129 у B.napus (в лініях Drakkar і Samourai, відповідно). Починаючи з 836-ї bр, послідовності ACG7190 - АСІ 1000 і GCPATpBOJ не виявляють близької гомології з послідовностями Brassica. Послідовності редьки і B.rapa (GCPconsen RsRf BOJ і BR) все ще близько гомологічні таким B.napus з 858-ї bр до 900-ї bр і 981-ї bр, відповідно. Крім того, у редьці виявлена тільки часткова гомологія з послідовністю Brassica. У виду B.rapa cv Asko, залишок послідовності BolJon може бути після делеції 78 bр знову порівняний за структурою з такими B.oleracea і B.rapa у B.napus, починаючи з 1057 bр до праймера BolJon L. Фіг.17 (17 і 17bis) ілюструють локалізацію праймерів Pgi-2 у послідовності th MJB21.12 Arabidopsis. Фіг.18 ілюструє локалізацію праймерів BolJon у гені mipsAtl62850 і ділянки клонів, які перекриваються, th AC007190 і АС011000 Arabidopsis. Представлено порівняння його первинної структури з продуктом ПЛР BolJon в Arabidopsis (740bp). Потрібно розуміти, однак, що приклади наводяться як спосіб ілюстрації завдання винаходу, але які ніяким чином не утворюють обмежень винаходу. Приклад І: Спосіб отримання двонульової лінії – відновника фертильності Brassica napus з цитоплазматичною чоловічою стерильністю (ЦЧС) Ogura, що являє собою інтрогресію редьки, яка несе ген-відновник фертильності Rfo, вирізаний з алеля Pgi-2 редьки, рекомбінований з геном Pgi-2 Brassica oleracea, що має хорошу агрономічну властивість, яка відрізняється жіночою фертильністю, хорошим рівнем перенесення Rfo і високою вегетаційною потужністю. Матеріали і методи: Генотипи: лінію «R211» з вирізаною вставкою редьки схрещували з яровим низькоглюкозинолят 17 ним (GLS) ріпаком «Drakkar» для отримання потомства F1 ('R211*Dk'). Ярова низькоглюкозинолятна ЦЧС лінія «Wesroona» (австралійського походження) використовувалася для подальших схрещувань. Як контроль у молекулярному аналізі використовувалися: озима лінія з відновленою фертильністю, що походить від лінії «Samourai» і несе повну («RRH1») або неповну («R113») інтрогресію, а також європейська лінія 7 редьки, азіатська редька з відновленою фертильністю D81, гібрид Brassica napus*дика редька, Brassica oleracea і В.г ара cv Asko, Arabidopsis thaliana. Гамма-опромінення: квітучі рослини цілком були оброблені гамма-променями від джерела 60 Со на контрольованій ділянці. Сублетальна доза в 65 Грей надавалася перед мейозами. Схрещування і отримання [покоління] F2: опромінені рослини переносили в захищену від комах оранжерею після видалення квіткових бруньок, розмір яких перевищує 2мм. Опромінене потомство F1 використали для запилення лінії ЦЧС «Wesroona» вручну. Відновленим рослинам F1 дозволяли дати урожай сімейств рослин F2, який збирали індивідуально і ретельно висівали на польові випробування паралельно з неопроміненим контролем (Фіг.1). Фенотипічна селекція: При польових дослідженнях оцінювали три візуальних критерії (за шкалою від 1 до 5) протягом 2 років, на 1200 рослинах потомства F2 плюс 44 контрольних (82 330 оцінених рослин): 1 - вегетаційна потужність, 2 - нормальність співвідношення фертильних/стерильних рослин у розщепленні F2 і 3 - жіноча фертильність (розвиток стручка і висівання насіння). Наступні самозапилені покоління вибраних сімейств отримували як на ділянці, так і в оранжереї і продукували гомозиготні лінії (F4) для подальшого аналізу. Ізозимний аналіз виконували як описано в Delourme R. and Eber F. 1992. Theor Appl Genet 85: 222-228), розвиток маркера (Fourmann M et al 2002. Theor Appl Genet 105:1196-1206.): ПЛРпродукти оцінені за секвенуванням. Перевірка первинної структури виконана з використанням програми Blast NCBI (Національний Центр Біотехнологічної інформації США) і Uk Crop Net Brassica DB, а також програмного забезпечення Multialin INRA Toulouse. Спосіб: Була вибрана одна низькоглюкозинолятна ярова гомозиготна лінія з відновленою фертильністю «R211», для якої вже показані делеції в інтрогресії (Delourme R. and Eber F. 1992. Tlieor Appl Genet 85: 222-228. Delourme R et al 1998. Theor Appl Genet 97: 129-134. Delourme R. et al 1999.10 Int. Rapeseed Congress, Canberra.). Декілька молекулярних маркерів втрачені на обох боках Rfo, такі як spATCHIA (Fourmann M et al 2002. Theor Appl. Genet 105:1196-1206), spSG91 (Giancola S et al 2003 Theor Appl Genet (in press)). "R211" втратила ізозимну експресію алеля Pgi-2 гена редьки, але також і один з алелів Pgi-2 геному В.оlегасеа (1,2). Далі, гомозиготна "R211" демонструє зчеплені негативні риси, такі як низька вегетаційна потужність 92581 18 і дуже мала кількість насіння. Було передбачено, що ці рослини втратили хромосомний сегмент ріпаку. Співвідношення фертильності в поколінні F2, отриманому з цього матеріалу, нижче очікуваного (64% замість 75%). Була почата програма, в якій спробували досягти рекомбінації між Rfo, що несе інтрогресію з цієї вирізаної лінії, та гомологічною хромосомою з двонульової лінії B.napus. Відомо, що іонізуюча радіація індукує хромосомні перебудови в результаті двониткових розривів і подальших аберантних сполук кінців. Опромінення гамма-променями використовувалося на гетерозиготних рослинах F1, отриманих від лінії "R211", для індукування розривів хромосом безпосередньо перед мейозом, для того, щоб досягти рекомбінації вирізаної інтрогресії редьки в геномі ріпаку. Результати: Дуже мала кількість сімейств з 1200 тестованих сімейств F2 мали кращі оцінки за трьома критеріями. Тільки одна, «R2000», виявилася здатною продукувати нормальне співвідношення фертильних рослин у самозапиленого потомства зі стабільним відновленням хороших агрономічних характеристик, таких як хороша жіноча фертильність при нормальній кількості насіння у порівнянні з лінією «R211» (Фіг.2 і 3). Це сімейство було отримане в результаті 6хв. обробки опроміненням при дозі 65 Грей на годину. Аналіз глюкозинолятів підтвердив їх низький вміст. На Фіг.2 (рослини «R211» і «R2000») R2000 демонструє нормальне цвітіння з нормальною зовнішньою архітектурою. На Фіг.3 (кількість насіння на стручок), ми бачимо: - показники кращих сімейств F4 «R2000» при самозапиленні і при тестових схрещуваннях - показники ЦЧС-лінії "Pactol" ріпаку і контрольні "R211". Приклад II: селекція маркерів у гені Pgi-2 Ізозимний аналіз PGI: потомство від «R2000» експресує алель Pgi-2 ріпаку з геному В.оlеrасеа, початково втраченого в «R211». Були визначені три ПЛР-маркери для того, щоб охарактеризувати сімейство R2000 у порівнянні з відомими відновниками фертильності ріпаку RRH1 і R113. 1) Маркер PGIol отриманий з послідовностей BrassicaDB, специфічних для геному Brassica. Ампліфікація відсутня як у редьці, так і в Arabidopsis th., але присутня у Brassica у вигляді однієї смуги 248 bр. 2) Маркер PGIint ампліфікував довшу частину гена Pgi-2, дозволяючи чітке розрізнення між різними перевіреними видами Brassica, Raphanus і Arabidopsis. Види В.rара і В.оlеrасеа розрізнювалися не за розміром смуги в агарозному гелі, а за послідовністю їх смуги PGINT. 3) Маркер PGIUnt являє собою комбінацію праймерів PGI ol U та PGI int L. Цей маркер мав специфічністю маркера PGIol, але ампліфікував довшу ділянку, ніж маркер PGIint. 19 II. 1 Маркер PGIol З праймерами PGIol батьківська лінія «R211». демонструє відсутність ампліфікації, тоді як у протестованих озимих лініях присутня смуга 248 bр. Її послідовність ДНК гомологічна послідовності PGI-2 з Crop Net UK DB для виду Brassica і послідовності з попередньої роботи авторів (наіменованої послідовностями SGAP) (Локалізація праймерів SGPGI chou, Фіг.4). Це ортолог клону MJB21-12 на хромосомі V (34543 bр) у Arabidopsis (NCBI DB). PGIol плюс SG34 для проведення тесту на гомозиготність: комбіноване використання двох наборів праймерів у змішаній ПЛР: PGIol, що маркує ген Pgi-2, відсутнього у гомозиготній рослині з відновленою фертильністю, і SG34 (з S. Giancola et al, Giancola S et al 2003 Theor Appl. Genet, (in press)) - маркера, дуже близького до гена Rfo, було направлено на розрізнення гомозиготних і гетерозиготних рослин серед фертильних рослин у розщепленні потомства F2, отриманого з "R211". Замість використання SG34 можливе використання якого-небудь іншого маркера, близького до гена Rfo або такого, що входить до його складу. Тільки одне сімейство R2000 продемонструвало відсутність відмінностей між гомозиготним і гетерозиготним потомством: ген Pgi-2 присутній у гомозиготі R2000, при тому, що він відсутній у батьківській гомозиготній R211. На Фіг.5 (маркери ПЛР PGIol і SG34): гомозиготне сімейство "R2000" відновлює смугу PGIol. Послідовність ДНК смуги підтверджує гомологію з відомими послідовностями Pgi-2 в Arabidopsis і Brassica. Контрольні генотипи (Drakkar, Pactol, і Samourai, Darmor) мають такий самий патерн на гелі. Послідовність цієї загальної смуги дозволяє підтвердити високу міру їх гомології, оскільки вони практично схожі за винятком заміни однієї основи. У гомозиготного сімейства «R2000» відновлюється смуга PGIol типу Brassica oleracea. Це відрізняє її від відомого відновника фертильності групи Samourai. Ця ампліфікована частина Pgi-2 дуже консервативна, і важко виявити які-небудь відмінності між різними генотипами. Довша частина гена Pgi-2 була досліджена. ІІ.2 Маркери PGIUNT і PGIint Патерн електрофорезу продуктів ПЛР: маркер PGIUNT: другий зворотний праймер PGIint L був сконструйований за більшою частиною послідовності Pgi-2, щоб ампліфікувати і консервативні, і варіабельні ділянки гена. При використанні праймера PGIol U ампліфікується смуга 980 bр тільки в геномі Brassica. У «R211» не спостерігається яких-небудь смуг, а у гомозиготній «R2000» спостерігається смуга PGIUNT, як і у батьківській лінії Drakkar. На Фіг.8 (маркер PGIUNT): Маркер PGIint ампліфікував сегмент PGIUNT. Верхній праймер PGIint дозволяє ампліфікацію у всіх видів, які тестуються, що дає можливість провести зрозумілу відмінність між Arabidopsis, редь 92581 20 кою і Brassica. В.rара і В.оlеrасеа не розрізнялися за величиною смуги в агарозному гелі, але розрізнялися за своїми послідовностях PGIint. Всі протестовані генотипи з відновленою фертильністю, за винятком лінії «R211», демонструють смугу європейської редьки і одну смугу Brassica, гомологічну такій В.rара. Гомозиготна «R2000» не демонструє смугу PGIint редьки, як у вирізаній батьківській лінії «R211», але демонструє смугу Brassica, гомологічну такій В.оіlеrасеа. Електрофорез маркера PGIint представлений на Фіг.9. Аналіз послідовності: порівняння послідовностей PGI з баз даних. Відомий сегмент PGI величиною близько 490 bр. Послідовності сегмента величиною близько 490 bр з різних генотипів (В.оlеrасеа, В.rара, B.napus) були вивчені в лабораторії авторів, і деякі послідовності передані в Brassica Crop Net DB: EMAF 25875 до 25788 (M.Fouramnn) (4). Ці послідовності дуже консервативні. Порівняння послідовностей PGI В.rара і В.оlеrасеа (Фіг.13 і 14): порівняння між послідовностями PGI ми отримали з протестованих генотипів видів В.оlеrасеа і В.rара, воно показало, що ці послідовності розрізнюються замінами 21 основи. Ці заміни дозволили розрізнити послідовності PGIint з кожного з інших протестованих генотипів ріпаку, гомологічних або В.rара cv Asko (RRH1 і R113) або В.оlеrасеа (Drakkar, R211*DK, але також R2000). Приклад III: відбір маркера в ділянці, близькій до Rfo Оточуючі ген Rfo у вставці редьки маркери визначені, щоб полегшити клонування гена (Desloires S et al 2003 EMBO reports 4, 6:588-594). Один з них, маркер ПЛР SGI 29, розташовується дуже близько до Rfo (Giancola S et al 2003 Theor Appl. Genet, (in press)): він коампліфікував смуги, що розрізнюються, геномів В.оlеrасеа і В.rара у B.napus, однак смугу редьки дуже важко роздивитися на агарозному гелі. Мішенню послідовності SG129 був ортолог клону (АС011000, в локусі F16P17) у Arabidopsis thaliana. Цей клон перекривається з сусіднім прилеглим (контиг) клоном Arabidopsis (AC07190). У базі даних Brassica Crop Net DB автори виявили один клон В.оlеrасеа (ЕМВН448336, 764 bр), близький за первинною структурою до початкової ділянки А011000, а другий клон В.оlеrасеа (ЕМВН53971), який на карті геному Arabidopsis віддалений на приблизно 300 bр, близький до кінцевої ділянки АС07190. Ми сконструювали новий ПЛР-маркер BolJon, що займає місце між двома клонами В.оlеrасеа. Ми пересвідчилися у тому, що цей маркер дозволяє ампліфікувати специфічні смуги ПЛР у різних генотипах, що порівнюються в даній заявці. На Фіг.16 (гель-електрофорез ПЛР-продуктів BolJon): - У Arabidopsis ампліфікувалася смуга BolJon 815 bр, гомологічна сегменту, що перекривається, примикаючих ділянок. 21 - У диплоїдних видах Brassiceae маркер BolJon демонструє смуги, що розрізнюються: одна - 950 bр у В.оlеrасеа і одна - 870 bр у В.rара. Це показує, що два клони В.оlеrасеа (ЕМВН53971 і ЕМВН448336) являють собою безперервність у геномі Brassica, як це має місце в ортологічній послідовності у Arabidopsis. - У B.napus ці дві смуги коампліфікуються у підтримуючих лініях Samourai або Drakkar. - У лінії 7 редьки ампліфікувалася одна смуга BolJon довжиною близько 630 bр. Смуга у редьки з відновленою фертильністю cmsRd81 була трохи менше. У всіх ліній з відновленою фертильністю одна зі смуг BolJon була такої самої величини, у як у лінії 7 редьки. BolJon - це маркер інтрогресії редьки. - Гомозиготні лінії ріпаку з відновленою фертильністю «RRH1», «R113», а також «R211» демонструють тільки смугу В.rара і смугу редьки 630 bр, яка передбачає, що ортолог В.оlеrасеа генамішені відсутній або він був модифікований, коли сегмент хромосоми редьки був вставлений у вихідний геном ріпаку В.оlеrасеа. Гомозиготні рослини «R2000» демонструють присутність маркера ПЛР редьки BolJon плюс дві смуги BolJon Brassica, які знов відновлюють смугу В.оlеrасеа, втрачену в «R211» та інших лініяхвідновниках фертильності. Ми сконструювали праймер pCP418L, специфічний для геному В.оlеrасеа у видів, що тестуються. З праймером SG129U він ампліфікує тільки одну смугу ПЛР (670 bр) у виду В.оlеrасеа species. (Фіг.17). Ампліфікації ні у В.rара, ні у редьки, ні у Arabidopsis не було, але була присутньою чітка смуга СР418 у підтримуючих ліній B.napus. Її послідовність суворо гомологічна послідовності ЕМВН448336. Цей маркер являє собою дуже консервативну послідовність ДНК, що не допускає поліморфізму між генотипами за винятком присутності або відсутності. У RRH1, R113 і у R211 була відсутньою смуга СР418, що показує, як у попередньому випадку, що ортолог гена-мішені В.оlеrасеа відсутній або був модифікований внаслідок вставки сегмента геному редьки. Гомозиготні рослини «R2000» демонструють смугу СР418, що відновлює таку, специфічну для В.оlеrасеа. 92581 22 У даному винаході нова рекомбінантна низькоглюкозинолятна лінія-відновник фертильності селекціонована з хорошою жіночою фертильністю. Низька властивість лінії «R211» дозволяє селекцію в колі рідких рекомбінантних подій і характеризації сімейства «R2000». Гомозиготна лінія «R2000» являє собою унікальну комбінацію маркерів PGIol, PGIUNT, PGIint і BolJon у порівнянні з досі аналізованими відновниками фертильності ріпаку: маркер PGIinT демонструє, що у гомозиготних ліній ріпаку з відновленою фертильністю RRH1 і R113 присутня смуга європейської редьки плюс одна смуга Brassica, гомологічна геному B.rapa. «R2000» демонструє відсутність смуги редьки, втраченої, як і у батьківській вирізаній лінії R211, але демонструє одну смугу Brassica, гомологічну В.оlеrасеа. Ортологічна послідовність PGIint у власному геномі B.rapa не ампліфікується з цим маркером у генетичному оточенні ліній R211 i Drakkar. Послідовності маркера PGIol і маркера PGIUNT у лініях з відновленою фертильністю RRH1 і R113 були гомологічні такій B.rapa cv Asko. У «R2000» послідовність PGIUNT гомологічна В.оlеrасеа. Ортологічна послідовність у її геномі B.rapa не ампліфікується з цим маркером у генетичному оточенні ліній R211 i Drakkar. Маркер BolJon показав, що гомозиготні лінії ріпаку з відновленою фертильністю, включаючи "R211", демонструють присутність смуги європейської редьки плюс тільки смугу B.rapa. 'R2000' демонструє дві смуги «R211» плюс відновлену смугу BolJon В.оlеrасеа. Маркер СР418 показав, що у «R2000» відновився консервативний сегмент В.оlеrасеа. Гіпотеза авторів полягає у тому, що подія рекомбінації мала місце в запиленій материнській клітині, яка дала рослини «R2000». Вирізана інтрогресія редьки потім інтегрувалася у нормальний гомологічний сегмент хромосоми, що несе ген Pgi2 типу В.оlеrасеа, а послідовність - мішень BolJon, охарактеризована цими маркерами, ймовірно, походить від двонульового геному Drakkar «00», який присутній в опроміненому гетерозиготному гібриді «R211*DK». Патерн, що спостерігався для BolJon, передбачає, що подія рекомбінації призвела в результаті до формування в сімействі «R2000» особливої здвоєної ділянки, одна частина якої походить від редьки, а інша - від В.оlеrасеа. 23 92581 24 25 92581 26 27 92581 28 29 92581 30 31 92581 32 33 92581 34 35 92581 36 37 92581 38 39 92581 40 41 92581 42 43 92581 44 45 92581 46 47 92581 48 49 92581 50 51 92581 52 53 Комп’ютерна верстка М. Ломалова 92581 Підписне 54 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601