Днк, що кодує рослинну ліпазу, трансгенні рослини та спосіб контролю старіння у рослин
Номер патенту: 85528
Опубліковано: 10.02.2009
Автори: Худак Каталіна, Вонг Тзанн-Уей, Томпсон Джон Е., Хонг Ювен
Формула / Реферат
1. Виділена молекула ДНК, що кодує старіння-індуковану ліпазу, у якій молекула ДНК гібридизується за умов високої жорсткості з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:18 чи обома.
2. Виділена молекула ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що молекула ДНК має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1.
3. Виділена молекула ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що виділена молекула ДНК кодує інформацію про амінокислотну послідовність SEQ ID NO:4.
4. Виділена молекула ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що молекула ДНК має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:18.
5. Виділена старіння-індукована ліпаза, кодована нуклеотидною послідовністю, яка гібридизується за умов високої жорсткості з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:18 чи обома.
6. Старіння-індукована ліпаза за п. 5, яка відрізняється тим, що ліпаза має амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2.
7. Вектор для трансформації рослинних клітин, який включає
(а) антисмислові нуклеотидні послідовності, по суті комплементарні до відповідної частини одного ланцюга молекули ДНК, що кодує старіння-індуковану ліпазу, причому молекула ДНК, що кодує старіння-індуковану ліпазу, гібридизується за умов високої жорсткості з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:18 чи обома, і
(б) регуляторні послідовності, функціонально зв’язані з антисмисловими нуклеотидними послідовностями таким чином, що антисмислові нуклеотидні послідовності експресуються у рослинній клітині, до якої він трансформується.
8. Вектор за п. 7, який відрізняється тим, що регуляторні послідовності включають промотор та ділянку термінації транскрипції.
9. Вектор за п. 7, який відрізняється тим, що регуляторні послідовності включають конститутивний промотор.
10. Вектор за п. 7, який відрізняється тим, що регуляторні послідовності включають рослинний тканиноспецифічний промотор.
11. Вектор за п. 7, який відрізняється тим, що регуляторні послідовності включають старіння-індукований рослинний промотор.
12. Вектор за п. 7, який відрізняється тим, що регуляторні послідовності включають вірусний промотор.
13. Вектор за п. 7, який відрізняється тим, що регуляторні послідовності включають конститутивний промотор.
14. Антисмисловий олігонуклеотид чи полінуклеотид, що кодує молекулу РНК, яка є по суті комплементарною до відповідної частини РНК-транскрипта рослинного гена старіння-індукованої ліпази, у якому зазначений рослинний ген гібридизується за умов високої жорсткості з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:18 чи обома.
15. Антисмисловий олігонуклеотид чи полінуклеотид за п. 14, де олігонуклеотид чи полінуклеотид включає від приблизно шести до приблизно 100 нуклеотидів.
16. Антисмисловий олігонуклеотид чи полінуклеотид за п. 14, де кодуюча ділянка рослинного гена має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1.
17. Антисмисловий олігонуклеотид чи полінуклеотид за п. 14, де кодуюча ділянка рослинного гена має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:18.
18. Антисмисловий олігонуклеотид чи полінуклеотид за п. 14, де рослинний ген є геном гвоздики.
19. Антисмисловий олігонуклеотид чи полінуклеотид за п. 14, де рослинний ген є геном Arabidopsis.
20. Антисмисловий олігонуклеотид чи полінуклеотид за п. 14, де рослинний ген є геном томата.
21. Антисмисловий олігонуклеотид чи полінуклеотид за п. 14, де рослинний ген є геном овочевої квасолі.
22. Антисмисловий олігонуклеотид чи полінуклеотид за п. 14, де антисмисловий олігонуклеотид чи полінуклеотид є по суті комплементарним до відповідної частини 5’-некодуючої ділянки РНК-транскрипта.
23. Вектор, який включає:
(а) молекулу ДНК, що кодує старіння-індуковану ліпазу, у якій молекула ДНК гібридизується за умов високої жорсткості з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:18 чи обома, і
(б) регуляторні послідовності, функціонально зв’язані з молекулою ДНК таким чином, що молекула ДНК експресується у рослинній клітині, до якої він трансформується.
24. Бактеріальна клітина, трансформована вектором за п. 23, де вектор міститься всередині клітини.
25. Рослинна клітина, трансформована вектором за п. 7, де вектор міститься всередині клітини.
26. Рослина або її потомство, одержані з рослинної клітини, трансформованої вектором за п. 7, де вектор міститься всередині клітини.
27. Рослина, частина рослини або її потомство за п. 26.
28. Спосіб інгібування експресії ендогенної старіння-індукованої ліпази у рослині, який включає:
(1) введення до геному рослини вектора, який включає:
(А) антисмислові нуклеотидні послідовності, по суті комплементарні до відповідної частини одного ланцюга молекули ДНК, що кодує ендогенну старіння-індуковану ліпазу, причому молекула ДНК, що кодує ендогенну старіння-індуковану ліпазу, гібридизується за умов високої жорсткості з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:18 чи обома, або відповідної частини РНК-послідовності, кодованої геном вказаної ендогенної старіння-індукованої ліпази, і
(Б) регуляторні послідовності, функціонально зв’язані з антисмисловими нуклеотидними послідовностями таким чином, щоб відбувалася експресія антисмислових нуклеотидних послідовностей , і
(2) вирощування вказаної рослини, причому вказані антисмислові нуклеотидні послідовності транскрибуються та зв’язуються з вказаною РНК-послідовністю, інгібуючи цим експресію вказаного гена старіння-індукованої ліпази.
29. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що відповідна частина ДНК чи відповідна частина РНК, до якої антисмисловий оліго- чи полінуклеотид є по суті комплементарним, включає 5’-некодуючі послідовності.
30. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що вказане інгібування спричинює зміну процесу старіння рослини.
31. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що вказане інгібування спричинює підвищену стійкість вказаної рослини до старіння, індукованого середовищним стресом.
32. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що вказане інгібування спричинює збільшення біомаси вказаної рослини.
33. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що вказане інгібування спричинює збільшення врожаю насіння у вказаної рослини.
34. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що регуляторні послідовності включають конститутивний промотор, що виявляє активність у рослині.
35. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що регуляторні послідовності включають подвійний промотор 35S.
36. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що регуляторні послідовності включають тканиноспецифічний промотор, що виявляє активність у рослині.
37. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що регуляторні послідовності включають старіння-індукований промотор, що виявляє активність у рослині.
38. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що вказану рослину вибирають з групи, що складається з плодоносних рослин, квіткових рослин, овочів, сільськогосподарських культур та лісових видів.
39. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що рослина є томатом.
40. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що рослина є гвоздикою.
41. Спосіб інгібування експресії ендогенного гена чи генів старіння-індукованої ліпази у рослинній клітині, який включає:
(1) введення до геному рослини вектора, який включає:
(А) виділену молекулу ДНК, що кодує екзогенну старіння-індуковану ліпазу, причому молекула ДНК гібридизується за умов високої жорсткості з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:18 чи обома, і
(Б) регуляторні послідовності, функціонально зв’язані з молекулою ДНК таким чином, щоб забезпечити експресію кодованої нею екзогенної старіння-індукованої ліпази, і
(2) вирощування вказаної рослини, причому відбувається надекспресія вказаної молекули ДНК, і ген чи гени ендогенної старіння-індукованої ліпази інгібуються екзогенною старіння-індукованою ліпазою.
42. Спосіб за п. 41, який відрізняється тим, що регуляторні послідовності включають конститутивний промотор.
43. Спосіб зміни вікового старіння та старіння, зв’язаного із середовищним стресом, у рослини, який включає:
(1) введення до геному рослини вектора, який включає:
(А) антисмислові нуклеотидні послідовності, по суті комплементарні до відповідної частини одного ланцюга молекули ДНК, що кодує ендогенну старіння-індуковану ліпазу, причому молекула ДНК, що кодує ендогенну старіння-індуковану ліпазу, гібридизується за умов високої жорсткості з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:18 чи обома, або щонайменше частини РНК-послідовності, кодованої геном вказаної ендогенної старіння-індукованої ліпази, і
(Б) регуляторні послідовності, функціонально зв’язані з антисмисловими нуклеотидними послідовностями таким чином, щоб відбувалася експресія антисмислових нуклеотидних послідовностей , і
(2) вирощування вказаної рослини, причому вказані антисмислові нуклеотидні послідовності транскрибуються та зв’язуються зі вказаною РНК-послідовністю, інгібуючи цим експресію вказаного гена старіння-індукованої ліпази.
44. Трансгенна рослинна клітина, яка включає вектор за п. 7.
45. Трансгенна рослинна клітина, яка включає вектор за п. 23.
46. Плазміда, яка включає систему реплікації, функціональну у прокаріотному хазяїні, та антисмисловий олігонуклеотид чи полінуклеотид за п. 14.
47. Плазміда, яка включає систему реплікації, функціональну у Agrobacterium, та антисмисловий олігонуклеотид чи полінуклеотид за п. 14.
48. Рослина або її потомство, які відрізняються тим, що вказана рослина походить з клітини, що має інгібовану чи знижену експресію старіння-індукованої ліпази, причому зазначена клітина включає вектор за п.7.
49. Рослина або її потомство, у якій рослина походить з клітини, що має інгібовану чи знижену експресію старіння-індукованої ліпази, причому зазначену клітину одержують шляхом
(1) введення до геному клітини вектора, який включає:
(А) антисмислові нуклеотидні послідовності, по суті комплементарні до відповідної частини однієї нитки молекули ДНК, що кодує ендогенну старіння-індуковану ліпазу, причому молекула ДНК, що кодує ендогенну старіння-індуковану ліпазу, гібридизується за умов високої жорсткості з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:18 чи обома, вказаної ендогенної старіння-індукованої ліпази, і
(Б) регуляторні послідовності, функціонально зв’язані з антисмисловими нуклеотидними послідовностями таким чином, щоб забезпечити експресію антисмислових нуклеотидних послідовностей, і
(2) вирощування вказаної клітини, причому вказані антисмислові нуклеотидні послідовності транскрибуються та зв’язуються з вказаною РНК-послідовністю, інгібуючи цим експресію вказаного гена старіння-індукованої ліпази.
50. Рослина або її потомство за п. 49, де рослина є томатом.
51. Рослина або її потомство за п. 49, де рослина є гвоздикою.
52. Спосіб інгібування старіння насіння, який включає:
(1) введення до геному рослини вектора, який включає:
(А) антисмислові нуклеотидні послідовності, по суті комплементарні до відповідної частини одного ланцюга молекули ДНК, що кодує ендогенну старіння-індуковану ліпазу, причому ДНК, що кодує вказану ендогенну старіння-індуковану ліпазу, гібридизується за умов високої жорсткості з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:18 чи обома, або відповідної частини РНК-послідовності, транскрибованої з молекули ДНК, що кодує вказану ендогенну старіння-індуковану ліпазу, і
(Б) регуляторні послідовності, функціонально зв’язані з антисмисловими нуклеотидними послідовностями, і
(2) вирощування вказаної рослини та одержання з неї насіння, причому вказані антисмислові нуклеотидні послідовності транскрибуються та зв’язуються з вказаною РНК-послідовністю, а експресія вказаного гена старіння-індукованої ліпази інгібується.
53. Спосіб підвищення врожаю насіння у рослини, який включає:
(1) введення до геному рослини вектора, який включає:
(А) антисмислові нуклеотидні послідовності, по суті комплементарні до відповідної частини одного ланцюга молекули ДНК, що кодує ендогенну старіння-індуковану ліпазу, причому ДНК, що кодує вказану ендогенну старіння-індуковану ліпазу, гібридизується за умов високої жорсткості з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:18 чи обома, або комплементарні до відповідної частини РНК-послідовності, транскрибованої з молекули ДНК, що кодує вказану ендогенну старіння-індуковану ліпазу, і
(Б) регуляторні послідовності, функціонально зв’язані з антисмисловими нуклеотидними послідовностями, і
(2) вирощування вказаної рослини та одержання з неї насіння, причому вказані антисмислові нуклеотидні послідовності транскрибуються та зв’язуються з вказаною РНК-послідовністю, а експресія вказаного гена старіння-індукованої ліпази інгібується.
Текст
1. Виділена молекула ДНК, що кодує старінняіндуковану ліпазу, у якій молекула ДНК гібридизу UA (21) 2003010421 (22) 19.06.2001 (24) 10.02.2009 (86) PCT/US01/19385, 19.06.2001 (31) 09/597,774 (32) 19.06.2000 (33) US (31) 09/610,104 (32) 05.07.2000 (33) US (46) 10.02.2009, Бюл.№ 3, 2009 р. (72) ТОМПСОН ДЖОН Е., ВОНГ ТЗАНН-УЕЙ, ХУДАК КАТАЛІН А, ХОНГ ЮВЕН (73) СЕНЕСКО ТЕКНОЛОДЖІЗ, ІНК. (56) WO0049164, 24.08.2000 DATABASE EMBL [Online] 6 January 1999 (1999-0106) " Dianthus caryophyllus lipase mRNA, partial cds." Database accession no. AF026480 XP002143322 -& DATABASE SWISSPROT [Online] 1 May 1999 (1999-05-01) "Lipase (Fragment)." Database accession no. Q9ZTW1 XP002211628 -& HONG, Y., ET AL.: "An ethylene-induced cDNA encoding a lipase expressed at the onset of senescence" PROCEEDINGS OF THE N ATION AL AC ADEMY OD SCIENCES (USA), vol. 97, no. 15, 18 July 2000 (2000-07-18), pages 8717-8722, EP1033405, 06.09.2000 DATABASE GENESEQ [Online] 17 October 2000 (2000-10-17) "Arabidopsis thaliana DNA fragment SEQ ID NO: 25113." Database accession no. AAC39568 XP002211629 -& DATABASE GENESEQ [Online] 17 October 2000 (2000-10-17) "Arabidopsis thaliana protein fragment SEQ ID NO: 25115." Database accession no. AAG22257 DATABASE GENESEQ [Online] 18 October 2000 (2000-10-18) "Arabidopsis thaliana DNA fragment SEQ ID NO: 57315." Database accession no. AAC48392 XP002211631 -& DATABASE GENSEQ [Online] 18 October 2000 (2000-10-18) "Arabidopsis thaliana protein fragment SEQ ID NO: 57317." Database accession no. AAG45635 DATABASE EMBL [Online] 3 June 1997 (1997-06-03) "Arabidopsis thaliana chromosome 2 BAC T6B20 2 (19) 1 3 85528 4 ється за умов високої жорсткості з SEQ ID NO:1, 17. Антисмисловий олігонуклеотид чи полінуклеоSEQ ID NO:18 чи обома. тид за п. 14, де кодуюча ділянка рослинного гена 2. Виділена молекула ДНК за п. 1, яка відрізнямає нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:18. ється тим, що молекула ДНК має нуклеотидну 18. Антисмисловий олігонуклеотид чи полінуклеопослідовність SEQ ID NO:1. тид за п. 14, де рослинний ген є геном гвоздики. 3. Виділена молекула ДНК за п. 1, яка відрізня19. Антисмисловий олігонуклеотид чи полінуклеоється тим, що виділена молекула ДНК кодує інтид за п. 14, де рослинний ген є геном Arab idopsis. формацію про амінокислотну послідовність SEQ ID 20. Антисмисловий олігонуклеотид чи полінуклеоNO:4. тид за п. 14, де рослинний ген є геном томата. 4. Виділена молекула ДНК за п. 1, яка відрізня21. Антисмисловий олігонуклеотид чи полінуклеоється тим, що молекула ДНК має нуклеотидну тид за п. 14, де рослинний ген є геном овочевої послідовність SEQ ID NO:18. квасолі. 5. Виділена старіння-індукована ліпаза, кодована 22. Антисмисловий олігонуклеотид чи полінуклеонуклеотидною послідовністю, яка гібридизується тид за п. 14, де антисмисловий олігонуклеотид чи за умов високої жорсткості з SEQ ID NO:1, SEQ ID полінуклеотид є по суті комплементарним до відNO:18 чи обома. повідної частини 5’-некодуючої ділянки РНК6. Старіння-індукована ліпаза за п. 5, яка відрізтранскрипта. няється тим, що ліпаза має амінокислотну послі23. Вектор, який включає: довність SEQ ID NO:2. (а) молекулу ДНК, що кодує старіння-індуковану 7. Вектор для трансформації рослинних клітин, ліпазу, у якій молекула ДНК гібридизується за який включає умов високої жорсткості з SEQ ID NO:1, SEQ ID (а) антисмислові нуклеотидні послідовності, по суті NO:18 чи обома, і комплементарні до відповідної частини одного (б) регуляторні послідовності, функціонально ланцюга молекули ДНК, що кодує старіннязв’язані з молекулою ДНК таким чином, що молеіндуковану ліпазу, причому молекула ДНК, що кокула ДНК експресується у рослинній клітині, до дує старіння-індуковану ліпазу, гібридизується за якої він трансформується. умов високої жорсткості з SEQ ID NO:1, SEQ ID 24. Бактеріальна клітина, трансформована вектоNO:18 чи обома, і ром за п. 23, де вектор міститься всередині кліти(б)регуляторні послідовності, функціонально ни. зв’язані з антисмисловими нуклеотидними послі25. Рослинна клітина, трансформована вектором довностями таким чином, що антисмислові нуклеза п. 7, де вектор міститься всередині клітини. отидні послідовності експресуються у рослинній 26. Рослина або її потомство, одержані з рослинклітині, до якої він трансформується. ної клітини, трансформованої вектором за п. 7, де 8. Вектор за п. 7, який відрізняється тим, що ревектор міститься всередині клітини. гуляторні послідовності включають промотор та 27. Рослина, частина рослини або її потомство за ділянку термінації транскрипції. п. 26. 9. Вектор за п. 7, який відрізняється тим, що ре28. Спосіб інгібування експресії ендогенної старінгуляторні послідовності включають конститутивний ня-індукованої ліпази у рослині, який включає: промотор. (1) введення до геному рослини вектора, який 10. Вектор за п. 7, який відрізняється тим, що включає: регуляторні послідовності включають рослинний (А) антисмислові нуклеотидні послідовності, по тканиноспецифічний промотор. суті комплементарні до відповідної частини одного 11. Вектор за п. 7, який відрізняється тим, що ланцюга молекули ДНК, що кодує ендогенну старегуляторні послідовності включають старінняріння-індуковану ліпазу, причому молекула ДНК, індукований рослинний промотор. що кодує ендогенну старіння-індуковану ліпазу, 12. Вектор за п. 7, який відрізняється тим, що гібридизується за умов високої жорсткості з SEQ регуляторні послідовності включають вірусний ID NO:1, SEQ ID NO:18 чи обома, або відповідної промотор. частини РНК-послідовності, кодованої геном вка13. Вектор за п. 7, який відрізняється тим, що заної ендогенної старіння-індукованої ліпази, і регуляторні послідовності включають конститутив(Б) регуляторні послідовності, функціонально ний промотор. зв’язані з антисмисловими нуклеотидними послі14. Антисмисловий олігонуклеотид чи полінуклеодовностями таким чином, щоб відбувалася екстид, що кодує молекулу РНК, яка є по суті комплепресія антисмислових нуклеотидних послідовносментарною до відповідної частини РНКтей , і транскрипта рослинного гена старіння-індукованої (2) вирощування вказаної рослини, причому вкаліпази, у якому зазначений рослинний ген гібридизані антисмислові нуклеотидні послідовності зується за умов високої жорсткості з SEQ ID NO:1, транскрибуються та зв’язуються з вказаною РНКSEQ ID NO:18 чи обома. послідовністю, інгібуючи цим експресію вказаного 15. Антисмисловий олігонуклеотид чи полінуклеогена старіння-індукованої ліпази. тид за п. 14, де олігонуклеотид чи полінуклеотид 29. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що включає від приблизно шести до приблизно 100 відповідна частина ДНК чи відповідна частина нуклеотидів. РНК, до якої антисмисловий оліго- чи полінуклео16. Антисмисловий олігонуклеотид чи полінуклеотид є по суті комплементарним, включає 5’тид за п. 14, де кодуюча ділянка рослинного гена некодуючі послідовності. має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1. 5 85528 6 30. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що що кодує ендогенну старіння-індуковану ліпазу, вказане інгібування спричинює зміну процесу стагібридизується за умов високої жорсткості з SEQ ріння рослини. ID NO:1, SEQ ID NO:18 чи обома, або щонаймен31. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що ше частини РНК-послідовності, кодованої геном вказане інгібування спричинює підвищену стійкість вказаної ендогенної старіння-індукованої ліпази, і вказаної рослини до старіння, індукованого сере(Б) регуляторні послідовності, функціонально довищним стресом. зв’язані з антисмисловими нуклеотидними послі32. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що довностями таким чином, щоб відбувалася ексвказане інгібування спричинює збільшення біомапресія антисмислових нуклеотидних послідовносси вказаної рослини. тей , і 33. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що (2) вирощування вказаної рослини, причому вкавказане інгібування спричинює збільшення врозані антисмислові нуклеотидні послідовності жаю насіння у вказаної рослини. транскрибуються та зв’язуються зі вказаною РНК34. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що послідовністю, інгібуючи цим експресію вказаного регуляторні послідовності включають конститутивгена старіння-індукованої ліпази. ний промотор, що виявляє активність у рослині. 44. Трансгенна рослинна клітина, яка включає век35. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що тор за п. 7. регуляторні послідовності включають подвійний 45. Трансгенна рослинна клітина, яка включає векпромотор 35S. тор за п. 23. 36. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що 46. Плазміда, яка включає систему реплікації, фурегуляторні послідовності включають тканиноспенкціональну у прокаріотному хазяїні, та антисмисцифічний промотор, що виявляє активність у рословий олігонуклеотид чи полінуклеотид за п. 14. лині. 47. Плазміда, яка включає систему реплікації, фу37. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що нкціональну у Agrobacterium, та антисмисловий регуляторні послідовності включають старінняолігонуклеотид чи полінуклеотид за п. 14. індукований промотор, що виявляє активність у 48. Рослина або її потомство, які відрізняються рослині. тим, що вказана рослина походить з клітини, що 38. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що має інгібовану чи знижену експресію старіннявказану рослину вибирають з групи, що складаіндукованої ліпази, причому зазначена клітина ється з плодоносних рослин, квіткових рослин, включає вектор за п.7. овочів, сільськогосподарських культур та лісових 49. Рослина або її потомство, у якій рослина поховидів. дить з клітини, що має інгібовану чи знижену екс39. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що пресію старіння-індукованої ліпази, причому зарослина є томатом. значену клітину одержують шляхом 40. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що (1) введення до геному клітини вектора, який рослина є гвоздикою. включає: 41. Спосіб інгібування експресії ендогенного гена (А) антисмислові нуклеотидні послідовності, по чи генів старіння-індукованої ліпази у рослинній суті комплементарні до відповідної частини однієї клітині, який включає: нитки молекули ДНК, що кодує ендогенну старін(1) введення до геному рослини вектора, який ня-індуковану ліпазу, причому молекула ДНК, що включає: кодує ендогенну старіння-індуковану ліпазу, гібри(А) виділену молекулу ДНК, що кодує екзогенну дизується за умов високої жорсткості з SEQ ID старіння-індуковану ліпазу, причому молекула ДНК NO:1, SEQ ID NO:18 чи обома, вказаної ендогенної гібридизується за умов високої жорсткості з SEQ старіння-індукованої ліпази, і ID NO:1, SEQ ID NO:18 чи обома, і (Б) регуляторні послідовності, функціонально (Б) регуляторні послідовності, функціонально зв’язані з антисмисловими нуклеотидними послізв’язані з молекулою ДНК таким чином, щоб задовностями таким чином, щоб забезпечити ексбезпечити експресію кодованої нею екзогенної пресію антисмислових нуклеотидних послідовносстаріння-індукованої ліпази, і тей, і (2) вирощування вказаної рослини, причому відбу(2) вирощування вказаної клітини, причому вказані вається надекспресія вказаної молекули ДНК, і ген антисмислові нуклеотидні послідовності транскричи гени ендогенної старіння-індукованої ліпази буються та зв’язуються з вказаною РНКінгібуються екзогенною старіння-індукованою ліпапослідовністю, інгібуючи цим експресію вказаного зою. гена старіння-індукованої ліпази. 42. Спосіб за п. 41, який відрізняється тим, що 50. Рослина або її потомство за п. 49, де рослина регуляторні послідовності включають конститутивє томатом. ний промотор. 51. Рослина або її потомство за п. 49, де рослина 43. Спосіб зміни вікового старіння та старіння, є гвоздикою. зв’язаного із середовищним стресом, у рослини, 52. Спосіб інгібування старіння насіння, який який включає: включає: (1) введення до геному рослини вектора, який (1) введення до геному рослини вектора, який включає: включає: (А) антисмислові нуклеотидні послідовності, по (А) антисмислові нуклеотидні послідовності, по суті комплементарні до відповідної частини одного суті комплементарні до відповідної частини одного ланцюга молекули ДНК, що кодує ендогенну сталанцюга молекули ДНК, що кодує ендогенну старіння-індуковану ліпазу, причому молекула ДНК, ріння-індуковану ліпазу, причому ДНК, що кодує 7 85528 8 вказану ендогенну старіння-індуковану ліпазу, гіб(А) антисмислові нуклеотидні послідовності, по ридизується за умов високої жорсткості з SEQ ID суті комплементарні до відповідної частини одного NO:1, SEQ ID NO:18 чи обома, або відповідної ланцюга молекули ДНК, що кодує ендогенну стачастини РНК-послідовності, транскрибованої з ріння-індуковану ліпазу, причому ДНК, що кодує молекули ДНК, що кодує вказану ендогенну ставказану ендогенну старіння-індуковану ліпазу, гібріння-індуковану ліпазу, і ридизується за умов високої жорсткості з SEQ ID (Б) регуляторні послідовності, функціонально NO:1, SEQ ID NO:18 чи обома, або комплементарзв’язані з антисмисловими нуклеотидними посліні до відповідної частини РНК-послідовності, довностями, і транскрибованої з молекули ДНК, що кодує вказа(2) вирощування вказаної рослини та одержання з ну ендогенну старіння-індуковану ліпазу, і неї насіння, причому вказані антисмислові нуклео(Б) регуляторні послідовності, функціонально тидні послідовності транскрибуються та зв’язані з антисмисловими нуклеотидними послізв’язуються з вказаною РНК-послідовністю, а ексдовностями, і пресія вказаного гена старіння-індукованої ліпази (2) вирощування вказаної рослини та одержання з інгібується. неї насіння, причому вказані антисмислові нуклео53. Спосіб підвищення врожаю насіння у рослини, тидні послідовності транскрибуються та який включає: зв’язуються з вказаною РНК-послідовністю, а екс(1) введення до геному рослини вектора, який пресія вказаного гена старіння-індукованої ліпази включає: інгібується. Ця заявка часткове продовженням заявки реєстр. №09/597774, яка частково доповнює заявку реєстр. №09/250280, яка є частковим продовженням заявки реєстр. №09/105812, поданої 26 червня 1998p., повністю включених до цього документу як посилання. Даний винахід стосується полінуклеотидів, що кодують, рослинні поліпептиди і здійснюють старіння-індуковану експресію, трансгенних рослин, що містять полінуклеотиди у антисмисловій орієнтації, та способів за контролем старіння у рослин. Конкретніше, даний винахід стосується генів рослинної ліпази, експресія яких індукується початком старіння, та застосування гена ліпази для контролю старіння у рослин. Старіння є кінцевою фазою біологічного розвитку у житті рослини. Воно призводить до смерті і відбувається на різних рівнях біологічної організації, включаючи рослину у цілому, органи, квітки та плоди, тканини та окремі клітини. Ранньою і фундаментальною ознакою старіння є погіршення стану клітинної мембрани. Метаболізм ліпідів, зокрема мембранних ліпідів, є одним з декількох біохімічних виявів клітинного старіння. Наприклад, у пелюстках рози по мірі прогресування старіння відбувається збільшення активності ацилгідролази, яке супроводжується втратою мембранної функції [Borochov et al., Plant Physiol., 1982, 69, 296-299]. Погіршення стану клітинних мембран є ранньою та характерною ознакою старіння, яка призводить до підвищення проникності, втрати іонних градієнтів та зниження функції ключових мембранних протеїнів, таких як іонні помпи [Brown et al., Plant Physiol.: A Treatise, Vol.X, Academic Press, 1991, pp.227-275]. Переважно таке погіршення структурної та функціональної цілісності мембрани може бути віднесено на рахунок ліпаза-медійованого метаболізму фосфоліпідів. Для старіючих квіткових пелюстків, листів, сім'ядоль та достигаючих плодів було продемонстровано втрату ліпідного фосфату [Thompson J.E., Senescence and Aging in Plants, Academic Press, San Diego, 1988, pp.51-83], яка, можливо, спричинює значні зміни молекулярної організації мем бранного бішару з розвитком старіння, які приводять до порушення клітинної функції. Зокрема, дослідження певних старіючих рослинних тканин дали свідчення про розділення ліпідної фази у мембранах, які, здається, можна пояснити накопиченням ліпідних метаболітів у мембранному бішарі [McKersie and Thompson, 1979, Biochim. Biophys. Acta, 508: 197-212; Chia, et al., 1981, Plant Physiol., 67:415-420]. Зростає кількість свідчень на користь того, що метаболізм ліпідів у старіючій тканині значною мірою відбувається шляхом старінняспецифічних змін генної експресії [BuchananWolaston, V., J. Exp. Bot., 1997, 307:181-199]. Початок старіння може бути індукований різними факторами як внутрішніми, так і зовнішніми. Наприклад, етилен у багатьох рослин відіграє певну роль у різноманітних рослинних процесах, таких як проростання насіння, розвиток ростків, достигання плодів та старіння квіток. Продукування етилену у рослин може бути також асоційоване з травмами, індукованими механічними ранами, хімікатами, стресом (таким як спричинені змінами температури та кількості води) та хворобами. Вважається, що етилен бере участь у регуляції старіння листя у багатьох рослин, але дані, одержані для трансгенних рослин та мутантів зі зміненою етиленовою реакцією вказують на те, що хоч етилен і має вплив на старіння, він не є суттєвим регулятором цього процесу. У багатьох рослин етилен, здається, не відіграє ніякої ролі у достиганні плодів чи старінні. Наприклад, під час достигання плодів неклімактеричних рослин, таких як суниця, під час старіння деяких квіток, таких як гемерокаліс та під час старіння листя деяких рослин, таких як Arabidopsis, і зокрема, у однодольних рослин немає потреби у етиленовій сигналізації [Smart, СМ., 1994, New Phytology, 126:419-448; Valpuestra et al., 1995, Plant Mol. Biol., 28:575-582]. Зовнішні фактори, що індукують передчасну ініціацію старіння, включають в себе середовищні стреси, такі як температура, посуха, погане освітлення чи надходження живильних речовин, а також ураження патогенами. Як і у випадку природного (вік-спорідненого) старіння, старіння, 9 85528 10 індуковане середовищним стресом, характеризуамінокислотні послідовності генів старінняється втратою цілісності клітинної мембрани. Зокіндукованої ліпази розкриті в цьому описі. Нуклеорема, дія середовищного стресу індукує витік елетидна послідовність гена старіння-індукованої ліктроліту, спричинений пошкодженням мембрани пази гвоздики успішно використовувалася як гете[Sharon et al., 1994, Plant Physiol., 105:305-308; рологічний зонд для детектування відповідних Wright and Simon, 1973, J. Exp. Botany, 24:400-411; генів чи транскриптів РНК у кількох рослин з анаWright, M., 1974, Planta, 120:63-69; та Ezeetal., логічними механізмами регуляції. 1986, Physiologia Plantarum, 68:323-328], зниження У винаході пропонується спосіб генетичної рівнів мембранних фосфоліпідів [Wright, M., 1974, модифікації рослин з метою контролю за початком Planta, 120:63-69] та фазові переходи ліпідів як вік-спорідненого старіння, так і старіння, індуко[Sharom et al., 1994, Plant Physiol., 105:305-308], ваного середовищним стресом. Нуклеотидні попричому всі ці ефекти можуть бути віднесені на слідовності старіння-індукованої ліпази за винахорахунок дії ліпази. Рослинні тканини, піддані дії дом, їхні фрагменти чи комбінації таких середовищного стресу, також продукують етилен, фрагментів вводять у рослинну клітину у зворотній загальновідомий як стресовий етилен [Buchananорієнтації для інгібування експресії ендогенного Wollaston, V., 1997, J. Exp. Botan y, 48:181-199; гена старіння-індукованої ліпази, тим самим зниWright, Μ., 1974, Planta, 120:63-69]. Як відзначаложуючи рівень ендогенної старіння-індукованої ліся вище, відомо, що етилен спричинює старіння у пази та змінюючи процес старіння у трансформодеяких рослин. Погіршення стану мембрани, яке ваній рослині. приводить до витікання, є також первинною ознаВикористовуючи способи за винаходом, одеркою старіння насіння, і існують свідчення того, що жують трансгенні рослини, за ростом та розвитком це також пов'язане з деетерифікацією жирних кисяких проводять спостереження. Рослини чи окремі лот з мембранних фосфоліпідів [McKersie, B.D., частини рослин (наприклад, живці, квітки, овочі, Senarata, Т., Walker, M.A., Kendall, E.J. and плоди, насіння чи листя), що виявляють збільшену Hetherington, P.R. In: Senescence and Aging in тривалість життя чи термін зберігання за показниPlants, Ed. L.D. Nooden and A.C. Leoopold, ками росту рослини, цвітіння, зменшене псування Academic Press, 1988, pp.441-464]. плодів, знижене старіння насіння та/або зменшене Сьогодні не існує широко застосовного спосопожовтіння листів внаслідок зниження рівня стабу контролю початку старіння, спричиненого внутріння-індукованої ліпази, відбирають як бажані рішніми чи зовнішніми, наприклад середовищним продукти, що мають поліпшені властивості, вклюстресом, факторами. Нинішня технологія контрочаючи знижене пожовтіння листів, знижене опалю за старінням та подовженням терміну зберігандання пелюстків, зменшене псування плодів під ня свіжої швидкопсувної рослинної продукції, такої час транспортування та зберігання. Ці кращі росяк фрукти, квіти та овочі, покладається переважно лини розмножують. Аналогічно, рослини, які виявна зниження біосинтезу етилену. Наприклад, у ляють підвищену стійкість до середовищного [патенті США №5824875] розкрито трансгенні росстресу, наприклад, знижену сприйнятливість до лини герані, які мають подовжений термін зберінизьких температур (заморозків), посухи, інфекції і гання завдяки зниженню рівнів етилену внаслідок т.п., відбирають як кращі продукти. експресії одного з трьох генів 1-аміноциклопропанВ одному з аспектів, даний винахід стосується 1-карбоксилатсинтази (АСС) в антисмисловій оріізольованої молекули ДНК, що кодує старінняєнтації. Отже, цю технологію застосовують лише індуковану ліпазу, у якій молекула ДНК гібридизодля обмеженої групи рослин, які є етиленчутлививана із SEQ ID NO:1, або функціонального похідми. ного ізольованої молекули ДНК, що гібридизується Термін зберігання деяких плодів також подовіз SEQ ID NO:1. В одному з варіантів втілення, ізожується шляхом зниження біосинтезу етилену яке льована молекула ДНК має нуклеотидну послідовприводить до уповільнення достигання. Оскільки ність SEQ ID NO:1, тобто 100% комплементарність старіння цих плодів індукується після достигання, (ідентичність послідовності) до SEQ ID NO:1. В ефект зниження біосинтезу етилену на термін збеіншому варіанті втілення цього аспекту винаходу, рігання є непрямим. Іншим підходом; що викорисізольована молекула ДНК містить нуклеотидну товується для уповільнення достигання плодів, є послідовність SEQ ID NO:4.. зміна клітинних рівнів полігалактуронази, ферменВинахід також стосується ізольованої молекуту пом'якшення клітинної стінки, яка синтезується ли ДНК, яка кодує старіння-індуковану ліпазу, де на ранніх стадіях достигання. Цей підхід є аналогімолекула ДНК гібридизується з SEQ ID NO:18, або чним до контролю біосинтезу етилену в тому, що функціонального похідного ізольованої молекули він також лише опосередковано впливає на стаДНК, яка гібридизується з SEQ ID NO:18. В одному ріння і застосовується до незначної групи рослин. варіанті втілення цього аспекту винаходу, ізольоОтже, існує потреба у способі, контролю за вана молекула ДНК має нуклеотидну послідовстарінням рослин, застосовному до різноманітних ність SEQ ID NO:18, тобто 100% комплементаррослин. Тому було б цікаво розробити технології ність (ідентичність послідовності) з SEQ ID NO:18. модуляції старіння, застосовні до усіх типів росВ іншому варіанті втілення цього аспекту винахолин, незалежно від чутливості до етилену. ду, ізольована молекула ДНК містить нуклеотидну Цей винахід оснований на відкритті та клонупослідовність SEQ ID NO:19. ванні повного клону кДНК, що кодує старiнняВ іншому варіанті втілення винаходу, пропонундуковану ліпазу гвоздики та повного клону кДНК, ється ізольований протеїн, що кодується молекущо кодує старіння-індуковану ліпазу Arabidopsis лою ДНК, як описано вище, або його функціональthaliana. Нуклеотидні послідовності та відповідні не похідне. Кращим протеїном є амінокислотна 11 85528 12 послідовність SEQ ID NO:2 або її функціональне Даний спосіб далі стосується способу одерпохідне. жання рослини, що має знижений рівень старінняТакож пропонується антисмисловий олігонукіндукованої ліпази у порівнянні з немодифікованою леотид чи полінуклеотид, що кодує молекулу РНК, рослиною, який включає: комплементарну до принаймні частини РНК(1) трансформування рослини за допомогою транскрипту описаної вище молекули ДНК, причовектора, описаного вище; му молекула РНК гібридизується з РНК(2) надання змоги рослині до росту принаймні транскриптом таким чином, щоб змінювалася ексдо стадії паростка; пресія ендогенної старіння-індукованої ліпази. Ан(3) оцінку трансформованої рослини чи патисмисловий олігонуклеотид чи полінуклеотид ростка за показниками зміни старіння-індукованої може бути повним або переважно може містити ліпазної активності та/або зміни процесу старіння від шести до приблизно 100 нуклеотидів. та/або зміни старіння, індукованого середовищним Антисмисловий олігонуклеотид чи полінуклеостресом та/або етилен-індукованого старіння; і тид є по суті комплементарним до відповідної ді(4) відбору та вирощування рослини, що має лянки однієї нитки молекули ДНК, що кодує стазмінену старіння-індуковану ліпазну активність ріння-індуковану ліпазу, причому молекула ДНК, та/або змінений процес старіння та/або змінене що кодує старіння-індуковану ліпазу, гібридизуєтьстаріння, індуковане середовищним стресом, чи ся з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:18 чи з ними обома, етилен-індуковане старіння у порівнянні з нетранабо є по суті комплементарною до відповідної дісформованою рослиною. лянки РНК-послідовності, кодованої молекулою Рослина, одержана, як описано вище, або поДНК, що кодує старіння-індуковану ліпазу. В однотомство, гібриди, клони чи частини рослини краще му з варіантів втілення винаходу, антисмисловий виявляють знижену експресію старіння-індукованої олігонуклеотид чи полінукпеотид по суті є комплеліпази і уповільнене старіння та/або уповільнене ментарним до відповідної ділянки однієї нитки нустрес-індуковане старіння чи етилен-індуковане клеотидної послідовності SEQ ID NO:1, SEQ ID старіння. NO:18 чи обох, або до РНК-транскрипта, кодованоЦей винахід далі стосується способу інгібуго SEQ ID NO:1. В іншому варіанті втілення, антивання експресії ендогенної старіння-індукованої смисловий олігонуклеотид по суті є комплементаліпази у рослинній клітині, який включає: рним до відповідного фрагмента з від приблизно (1) введення до геному рослину вектора, який 100 до приблизно 200 нуклеотидів 5'-некодуючої включає ділянки чи 3'-кінцевої ділянки однієї нитки молеку(А) антисмислові нуклеотидні послідовності, ли ДНК, що кодує старіння-індуковану ліпазу, прикомплементарні до (і) відповідної ділянки однієї чому молекула ДНК гібридизується з SEQ ID NO:1, нитки молекули ДНК, що кодує ендогенну старінSEQ ID NO:18 чи обома. В іншому варіанті втілення-індуковану ліпазу, причому молекула ДНК, що ня, антисмисловий оліго- чи полінуклеотид є по кодує ендогенну старіння-індуковану ліпазу, гібрисуті комплементарним до відповідної ділянки віддизується з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:18 чи обома, критої рамки зчитування однієї нитки нуклеотидної або (іі) відповідної ділянки РНК-послідовності, копослідовності SEQ ID NO:4 чи РНК-транскрипта, дованої ендогенним геном старіння-індукованої кодованого SEQ ID NO:4. ліпази; і Винахід далі стосується вектора для трансфо(Б) регуляторні послідовності, функціонально рмації рослинних клітин, який включає в себе зв'язані з антисмисловими нуклеотидними послі(а) антисмислові нуклеотидні послідовності, по довностями таким чином, щоб експресувалися суті комплементарні до (1) відповідної ділянки одантисмислові нуклеотидні послідовності; і нієї нитки молекули ДНК, що кодує старіння(2) вирощування вказаної рослини, причому індуковану ліпазу, причому молекула ДНК, що ковказані антисмислові нуклеотидні послідовності дує старіння-індуковану ліпазу, гібридизується з транскрибуються і транскрипти зв'язуються з вкаSEQ ID NO:1, SEQ ID NO:18 чи обома, або (2) відзаною ендогенною РНК, тим самим інгібуючи експовідної ділянки РНК-послідовності, кодованої пресію вказаного гена старіння-індукованої ліпази. молекулою ДНК, що кодує старіння-індуковану На Фігурі 1 зображено похідну амінокислотну ліпазу; і послідовність (SEQ ID NO:2), кодовану клоном (б) регуляторні послідовності, функціонально кДНК старіння-індукованої ліпази (SEQ ID NO:1), зв'язані з антисмисловими нуклеотидними посліодержану з бібліотеки кДНК квітки гвоздики. Кондовностями таким чином, що антисмислові нуклесенсусні мотиви в амінокислотній послідовності отидні послідовності експресуються у трансфорпозначені таким чином: підкреслення однією лінімованій рослинній клітині, до якої вони були єю - сайт амідації; підкреслення пунктирною лінією введені. - сайт фосфорилювання протеїнкінази С; підкресРегуляторні послідовності включають промолення подвійною лінією - сайт N-міристоїлювання; тор, функціональний у трансформованій рослинній у рамці - сайт фосфорилювання цАМФ (сАМР); у клітині, який може бути індукованим чи конститузатіненій рамці - сайт фосфорилювання казеїнкітивним. Необов'язково, регуляторні послідовності нази II; у заштрихованій рамці - консенсусна повключають сигнал поліаденілювання. слідовність сімейства ліпаз; і у пунктирній рамці Винахід також пропонує рослинну клітину, сайт N-глікозилювання. трансформовану описаним вище вектором, пароНа Фігурі 2 показано порівняльний аналіз персток чи дорослу рослину, одержану з такої клітини, винної структури похідної повної амінокислотної або частину такого паростка чи рослини. послідовності старіння-індукованої ліпази пелюстки гвоздики (SEQ ID NO:2) та часткових послідов 13 85528 14 ностей ліпазоподібних протеїнів. Саrlір - повна єю - некодуюча послідовність старіння-індукованої послідовність старіння-індукованої ліпази пелюсліпазної кДНК; непідкреслена послідовність познаток гвоздики (SEQ ID NO:11); arlipl - часткова почає відкриту рамку зчитування. слідовність ліпазоподібного протеїну Arabidopsis На Фігурі 8 зображено амінокислотну послідоthaliana (Gen Bank Accession No.AL021710) (SEQ вність кДНК старіння-індукованої ліпази гвоздики ID NO:12); ipolip - часткова послідовність ліпазопо(SEQ ID NO:2). дібної полідовності Іротеа (Gen Bank Accession На Фігурі 9А представлено результати аналізу No.U55867) (SEQ ID NO:13); arlipi - часткова посліспособом нозерн-блотингу, що показують експредовність ліпазоподібного протеїну Arabidopsis сію ліпази гвоздики у пелюстках стадії II, які експоthaliana (Gen Bank Accession No.U93215) (SEQ ID нували 0,05млн-1 етилену протягом 15 годин. На NO:14). Ідентичні амінокислоти у трьох чи чотиФігурі 9А зображено забарвлений етидійбромідом рьох з цих послідовностей узяті в рамку. гель, у якому кожна ланка містить постійну кільНа Фігурі 3 зображено результати аналізу спокість РНК гвоздики (пелюстки: ланки 1 та 2; листя: собом вестерн-блотингу продукту експресії злитоланки 3 та 4; + - після обробки етиленом; - - необго протеїну, одержаного з кДНК ліпази гвоздики, роблені). На Фігурі 9Б представлено авторадіоекспресованого у Е.coli. Як зонди для вестернграму нозерн-блоту гелю за Фігурою 9А, з викориблотування використовували антитіла до протеїну станням як зонда міченої повної кДНК старіннястаріння-індукованої ліпази. Ланка 1 - мальтозаіндукованої ліпази пелюстків гвоздики. зв'язувальний протеїн, ланка 2 - злитий протеїн, На Фігурі 10 представлено часткову нуклеотищо складається з ліпази гвоздики, злитої з викоридну послідовність геномної старіння-індукованої станням сайта протеолітичного розщеплення (Фаліпази листів томата (SEQ ID NO:6) та відповідної ктор Ха) з кДНК мальтоза-зв'язувального протеїну, розшифрованої амінокислотної послідовності ланка 3 - злитий протеїн, частково розщеплений за (SEQ ID NO:17). Консервативний консенсусний допомогою Фактора Ха на вільний протеїн ліпази мотив ліпази затінений; усі послідовності прайме(50,2кДа) та вільний мальтоза-зв'язувальний прорів, використаних для одержання геномного фрагтеїн. мента, підкреслені. На Фігурі 4 зображено результати аналізу споНа Фігурі 11 представлено стовпчикову діагсобом нозерн-блотингу РНК, ізольованої з пелюстраму, яка показує вплив заморозків на здатність ків квіток гвоздики на різних стадіях розвитку. На просочування мембран. Рослини томата охолоФігурі 4 А показано забарвлення етидійбромідом джували до 8°С протягом 48 годин, а потім знов гелем з цільною РНК. Кожна ланка містить 10мкг зігрівали до кімнатної температури. Витік дифузату РНК. На Фігурі 4Б зображено авторадіографію но(мкСм) з листяних дисків вимірювали для контрозерн-блоту, одержаного з використанням як зонда льних рослин, які не піддавали охолодженню, та 32 Р-dСТР-міченої повної кДНК старіння-індукованої для рослин, які піддавали охолодженню, через 6 ліпази гвоздики. та 24 години. На Фігурі 5 продемонстровано in situ ліполітиНа Фігурі 12 зображено результати аналізу чну ацилгідролазу, тобто ліпазну активність протеспособом нозерн-блотингу РНК листя томата, ізоїнового продукту, одержаного надекспресією кДНК льованої з рослин, які піддавали охолодженню при старіння-індукованої ліпази гвоздики у Е.coli. mal 8°С протягом 48 годин і знов зігрівали до темпераклітини Е.coli, які містять лише мальтозатури навколишнього середовища протягом 24 гозв'зувлаьний протеїн у базальному сольовому седин. На Фігурі 12А зображено гель цільної РНК редовищі; mLip - клітини Е.coli, що містять злитий листя. На Фігурі 12Б представлено авторадіограпротеїн, який складається зі старіння-індукованої фію нозерн-блоту з використанням як зонда 32Рліпази гвоздики, злитої з мальтоза-зв'язувальним dCTP-міченої повної кДНК старіння-індукованої протеїном, у базальному сольовому середовищі; ліпази гвоздики. 40 mal/40 mLip - клітини Е.coli, що містять тільки На Фігурі 13 представлено часткову нуклеотимальтоза-зв'язувальний протеїн [mal] або продукти дну послідовність (SEQ ID NO:15) та відповідну злиття мальтоза-зв'язувального протеїну [mLip] у розшифровану амінокислотну послідовність базальному сольовому середовищі з домішкою Arabidopsis EST (GenBank Ace. No: N38227) (SEQ твін-40; 60 mal/60 mLip - клітини Е.coli, що містять ID NO:16), яка є на 55,5% ідентичною на ділянці з тільки мальтоза-зв'язувальний протеїн [mal] або 64 амінокислот зі старіння-індукованою ліпазою продукт злиття ліпазо-мальтоза-зв'язувального гвоздики. Консервативний консенсусний мотив протеїну [mLip] у базальному сольовому розчині з ліпази затінений. домішкою твін-60. На Фігурі 14 зображено нуклеотидну (зверху) На Фігурі 6А проілюстровано карту рестрикцій(SEQ ID NO:18) та розшифровану амінокислотну ного ферменту відкритої рамки зчитування старін(знизу) послідовності (SEQ ID NO:19) повного гена ня-індукованої ліпази гвоздики. Цифри позначають старіння-індукованої ліпази Arabidopsis. нуклеотиди у відкритій рамці зчитування. На Фігурі 15 представлено нозерн-блот цільної На Фігурі 6Б зображено результати аналізу РНК, ізольованої з листя рослин Arabidopsis на способом саузерн-блотингу геномної ДНК гвоздирізних стадіях (ланка 1 - рослини у віці двох тижки, гідролізованої різними рестрикційними ферменів; ланка 2 - рослини у віці трьох тижнів; ланка 3 нтами, з використанням як зонда кДНК старіннярослини у віці чотирьох тижнів; ланка 4 - рослини у індукованої ліпази гвоздики. віці п'яти тижнів; ланка 5 - рослини у віці шести На Фігурі 7 зображено нуклеотидну послідовтижнів), з використанням як зонда 32Р-сіСТРністю клону кДНК старіння-індукованої ліпази гвозміченої повної старіння-індукованої ліпази дики (SEQ ID NO:1). Підкреслення суцільною лініArabidopsis. Зверху показано авторадіографію 15 85528 16 (15А), а унизу - гель, забарвлений етидійбромідом ному стресу (заморозкам). Праймери, сконструйо(15В). вані з кДНК ліпази гвоздики, були використані для На Фігурі 16 представлено нозерн-блот цільної одержання продукту полімеразної ланцюгової реаРНК, ізольованої з листя рослин Arabidopsis у віці кції (PCR) з використанням як матриці геномної трьох тижнів, оброблених 50мМ етефоном (джеДНК листя томата. Продукт PCR містить часткову рело етилену), з використанням як зонда 32Рвідкриту рамку зчитування, яка кодує часткову dCTP-міченої повної старіння-індукованої ліпази послідовність протеїну, включаючи консервативArabidopsis. Зверху - авторадіографія (16А), а униний консенсусний мотив ліпази ITFTGHSLGA (SEQ зу - гель, забарвлений етидійбромідом (16В). ID NO:3). Нуклеотидна послідовність томата має На Фігурі 17 представлено фотографію рослин ступінь ідентичності послідовності 53,4% з полідодикого типу Arabidopsis у віці 4,6 тижня (ліворуч) та вністю старіння-індукованої ліпази гвоздики і трансгенних рослин (праворуч), що експресують 43,5% з послідовністю ліпази Arabidopsis. Послідоповний ген старіння-індукованої ліпази Arabidopsis вність ліпази Arabidopsis має ступінь ідентичності у антисмисловій орієнтації, яка показує збільше44,3% з нуклеотидною послідовністю гвоздики. ний розмір листів трансгенних рослин. Ген старіння-індукованої ліпази гвоздики за На Фігурі 18 представлено фотографію рослин даним винаходом був ізольований шляхом скринідикого типу Arabidopsis у віці 6,3 тижня (ліворуч) та нгу бібліотеки експресії кДНК, виготовленої зі статрансгенних рослин (праворуч), що експресують ріючих пелюстків гвоздики з використанням антиповний ген старіння-індукованої ліпази Arabidopsis тіл, одержаних проти цитозольних ліпідноу антисмисловій орієнтації, яка показує збільшепротеїнових частинок, які є джерелом ліпази гвозний розмір листів та уповільнене старіння листів дики. Був одержаний та секвенований позитивний трансгенних рослин. повний клон кДНК, який відповідає гену старінняНа Фігурі 19 представлено фотографію рослин індукованої ліпази гвоздики. Нуклеотидна послідодикого типу Arabidopsis у віці 7 тижнів (ліворуч) та вність клону кДНК старіння-індукованої ліпази натрансгенних рослин (праворуч), що експресують ведена у SEQ ID NO:1. Клон кДНК кодує поліпепповний ген старіння-індукованої ліпази Arabidopsis тид з 447 амінокислот (SEQ ID NO:2), який має у антисмисловій орієнтації, яка показує збільшерозрахункову молекулярну масу 50,2кДа. Експрений розмір листів трансгенних рослин. сія клону кДНК у Е.coli дала протеїн з очікуваною На Фігурі 20 представлено діаграму, яка покамолекулярною вагою, який виявляє ацилгідролаззує збільшення врожаю насіння у трьох Τ1ну активність, тобто експресований протеїн гідротрансгенних ліній рослин Arabidopsis, що експрелізує п-нітрофенілпальмітат, фосфоліпід та трисують ген старіння-індукованої ліпази у антисмисацилгліцерин. На основі характеру експресії ловій орієнтації. Врожай насіння виражений в об'ферменту у квітках гвоздики, що розвиваються, та ємі насіння. Для рослин дикого типу вказана активності протеїну можна зробити висновок про стандартна похибка (SE) для n=30. те, що він бере участь у процесах старіння. На Фігурі 21 зображено вестерн-блот цільного Ген старіння-індукованої ліпази Arabidopsis за протеїну, ізольованого з листя рослин Arabidopsis даним винаходом був також ізольований шляхом дикого типу у віці чотирьох тижнів, та відповідних PCR з використанням бібліотеки кДНК старіючого трансгенних рослин, що експресують повний ген листя Arabidopsis як матриці для проведення реастаріння-індукованої ліпази у антисмисловій орієнкції. Нуклеотид та розшифрована амінокислотна тації. (Ланки 1 та 2 містять 9мкг протеїну, а ланки 3 послідовність гена старіння-індукованої ліпази та 4 містять 18мкг протеїну). Як зонд для блоту Arabidopsis зображені на Фігурі 14 (SEQ ID NO:18). використовували антитіло, одержане проти протеСудячи з характеру експресії гена ліпази у рослиїну старіння-індукованої ліпази Arabidopsis. Екснах, що розвиваються, він бере участь у старінні. пресія старіння-індукованої ліпази знижувалася у Нозерн-блотинг загальної РНК пелюстків гвозвсіх трансгенних рослин. дики з використанням як зонда повної кДНК гвозЗапропоновані способи та композиції для змідики показує, що експресія гена старінняни експресії гена (генів) старіння-індукованої ліпаіндукованої ліпази у значному ступені індукується зи у рослинних клітинах. Зміна експресії гена (гебезпосередньо перед початком природного станів) старіння-індукованої ліпази у рослинах ріння (Фігура 4). Аналіз способом нозерн-блотингу приводить до затримки початку старіння та підвитакож демонструє, що ген старіння-індукованої щення стійкості до середовищного стресу, тим ліпази індукується умовами середовищного стресамим збільшуючи термін зберігання рослини су, наприклад, заморозками (Фігура 12) та етилета/або період росту. ном (Фігури 4 та 9), що, як відомо, продукується у Повна послідовність кДНК, що кодує ген ліпази відповідь на середовищний стрес. Аналізи спосогвоздики, який виявляє старіння-індуковану ексбом нозерн-блотингу показують, що присутність пресію, був ізольований з бібліотеки кДНК, виготомРНК старіння-індукованої ліпази гвоздики є значвленої з РНК старіючих пелюстків квіток гвоздики но вищою у старіючих (стадія розвитку IV) пелюст(Dianthus caryophyllus). Полінуклеотидні зонди, які ків гвоздики, ніж у молодих на стадіях І, II та III. відповідають обраним ділянкам ізольованої, поКрім того, етилен-стимульовані квітки на стадії II слідовності кДНК ліпази квітки гвоздики, а також також виявляють вищу експресію гена старінняповна кДНК ліпази гвоздики використовувалися індукованої ліпази. Аналогічно, рослини, які були для визначення присутності мРНК, що кодує ген експоновані температурою заморозку, а потім поліпази у старіючому листі гвоздики, достигаючих вернені до температури навколишнього середоплодах томата та старіючому листі овочевої квавища, також виявляють індуковану експресію гена солі, а також листі томата, підданому середовищстаріння-індукованої ліпази, яка співпадає з розви 17 85528 18 тком симптомів ушкоджень від заморозків (напр., Клонований ген(и) старіння-індукованої ліпази здатність просочування) (Фігури 11 та 12). чи його (їхні) фрагменти, самі чи у комбінаціях, при Експресія гена старіння-індукованої ліпази введенні у зворотній (антисмисловій) орієнтації під Arabidopsis регулюється аналогічно. Аналіз спосоконтролем конститутивного промотору, такого як бом нозерн-блотингу загальної РНК з листя роспромотор 35S вірусу бородавчастої мозаїки фікулин Arabidopsis на різних стадіях розвитку показусу, промотор CaMV 35S чи промотор MAS вірусу ють, що підвищувальна регуляція гена ліпази мозаїки цвітної капусти, може бути використаний співпадає з початком старіння листів (Фігура 15). для генетичної модифікації рослин та зміни процеТакож, аналогічно гену старіння-індукованої ліпази су старіння у модифікованих рослин. Обрані антигвоздики, ген старіння-індукованої ліпази смислові послідовності від інших рослин, які мають Arabidopsis зазнає підвищувальної регуляції при достатній ступінь ідентичності послідовностей з обробці етиленом, який є рослинним гормоном, геном старіння-індукованої ліпази гвоздики, мощо індукує старіння листів (Фігура 16). жуть бути використані для досягнення аналогічної Загальний характер експресії гена у різних рогенетичної модифікації. Одним з результатів генеслинах, наприклад, гвоздиці, овочевій квасолі, тичної модифікації є зниження кількості ендогенної томатах, Arabidopsis та різних рослинних тканинах, трансльованої старіння-індукованої ліпазанаприклад, листах, плодах та квітках, демонструє, кодуючої мРНК. Отже, знижується кількість старінщо гени ліпази за винаходом беруть участь у ініціня-індукованої ліпази, що продукується у рослинації старіння у ци х рослин та у рослинних тканиних клітинах, тим самим знижуючи ступінь ушконах. Отже, очікується, що шляхом істотного пригнідження клітинної мембрани та здатності чення чи зміни експресії генів старіння-індукованої просочування клітин, наприклад, зменшуючи сталіпази у рослинних тканинах можна затримати ріння та псування листів, плодів та/або квіток внастаріння, погіршення властивостей та псування, слідок старіння чи середовищного стресу. збільшуючи термін зберігання швидкопсувних Наприклад, рослини Arabidopsis, трансформоплодів, квіток та овочів. Це може бути досягнуто вані векторами, що експресують повний ген сташляхом створення трансгенних рослин, у яких ріння-індукованої ліпази Arabidopsis у антисмислоліпазна кДНК чи її олігонуклеотидний фрагмент вій орієнтації під контролем подвійного промотору експресується у антисмисловій конфігурації у пло35S, мають більший розмір листів та загалом видах, квітках, овоча х, сільськогосподарських кульявляють більший ріст рослин у порівнянні з рослитурах та лісових видах, переважно з використаннами дикого типу, як показано на Фігурах 17 та 18. ням конститутивного промотору, такого як Ці рослини також демонструють затримку старіння промотор CaMV 35S, або з використанням тканилистів, як показано на Фігурі 19. на-специфічного чи старіння-індукованого промоЕфект зниженої експресії гена старіннятору. індукованої ліпази, спричиненої експресією повноГен старіння-індукованої ліпази гвоздики є одго гена ліпази в антисмисловій орієнтації у трансноколійним геном. Був проведений аналіз спосогенних рослин Arabidopsis виявляється також у бом саузерн-блотингу геномної ДНК гвоздики, збільшенні врожаю насіння трансформованих ророзщепленої різними рестрикційними ферментаслин. Лінії рослин Arabidopsis, що експресують ми, які не розпізнають послідовності у відкритій повний ген старіння-індукованої ліпази, продукурамці зчитування кДНК старіння-індукованої ліпають насіння приблизно у два-три рази більше, ніж зи. Гідролізовану рестрикційними ферментами рослини дикого типу (Фігура 20). геномну ДНК досліджували з використанням як Те що ефекти, які спостерігаються для трансзонда 32Р-dCTP-міченої повної кДНК (SEQ ID генних рослин у біомасі, старінні листів та врожаї NO:1). За дуже суворих умов гібридизації лише насіння, спричинені зниженням рівня старінняодин рестрикційний фрагмент гібридизується з індукованої ліпази в цих рослинах, показано на клоном кДНК (68°С як для гібридизації, так і для Фігурі 21. Трансгенні рослини за винаходом виявпромивання; буфер для промивання: 0,2% x SSC ляють істотно знижену експресію старіння(хлориду-цитрату натрію), 0,1% SDS (додецилсуіндукованої ліпази у порівнянні з рослинами дикого льфату натрію)). Таким чином, ген старіннятипу. індукованої ліпази гвоздики є одноколійним геном Таким чином, способи та послідовності за да(Фігура 6). Той факт, що цей ген не є членом мульним винаходом можуть бути використані для затигенного сімейства у гвоздик, є вагомим свідчентримки псування рослин, включаючи псування ням на користь того, що він є одноколійним геном листів чи плодів, а також збільшення біомаси росй у інши х рослин. лин та врожай насіння, і загалом змінюють процес Знання повної нуклеотидної послідовності гестаріння у рослин. на старіння-індукованої ліпази гвоздики чи гена Ізольовані нуклеотидні послідовності за даним старіння-індукованої ліпази Arabidopsis є достатвинаходом можуть бути використані для ізоляції нім для ізоляції гена (генів) старіння-індукованої по суті комплементарної нуклеотидної послідовноліпази з різних інших видів рослин. Дійсно, як прості старіння-індукованої ліпази від інших рослин чи демонстровано в цьому описі, олігонуклеотидні організмів. Ці послідовності можуть, у свою чергу, праймери, основані на послідовності кДНК гвоздибути використані для трансформування рослин і, ки, були успішно використані для одержання фратим самим, зміни процесу старіння трансформогментів гена старіння-індукованої ліпази листя ваних рослин у такий саме спосіб, як показано для томатів способом полімеразної ланцюгової реакції використання описаних тут ізольованих нуклеотиз використанням як матриці геномної ДНК листів дних послідовностей. томата. 19 85528 20 Генетичні модифікації, що спостерігаються при фа хівцям, залежно від природи послідовності зонтрансформуванні рослин старіння-індукованою да та послідовностей мішеней. Умови гібридизації ліпазою, її функціональними фрагментами чи їхніта промивання добре відомі фахівцям, а регулюми комбінаціями, можуть забезпечити постійну вання умов залежно від бажаної суворості легко зміну рівнів старіння-індукованої ліпази у рослині, і здійснюється шляхом варіювання часу інкубуванможуть розмножуватися у рослинному потомстві ня, температури та/або іонної сили розчину. ]Див., шляхом самозапилення чи за іншими схемами наприклад, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A розмноження. Генетично змінена рослина викориLaboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor стовується для продукування нової лінії рослин, у Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]. Вибір умов якій зміна стабільно передається від покоління до визначається довжиною послідовностей, що гібрипокоління. У даному винаході уперше пропонуєтьдизуються, зокрема довжиною послідовності зонся відповідні ДНК-послідовності, які можуть бути да, відносним G-C вмістом нуклеїнових кислот та використані для досягнення стабільної генетичної кількістю припустимих порушень комплементарномодифікації процесу старіння у широкого спектра сті. Умови з низькою суворістю є кращими, якщо різних рослин. бажаною є часткова гібридизація ниток, що мають Для ідентифікації та ізоляції гена старінняменші ступені комплементарності. Якщо бажана індукованої ліпази здійснювали приготування плаповна чи майже повна комплементарність, кращизмідної ДНК, гідроліз рестрикіційним ферментом, ми є умови високої суворості. Для типових умов електрофорез ДНК на агарозному гелі, електровисокої суворості, розчин для гібридизації містить форез протеїну на поліакриламідному гелі, сау6´ SSC, 0,01Μ ЕДТА, 1 ´ розчин Денхарта та 0,5% зерн-блотинг, нозерн-блотинг, лігування ДНК та ДСН. Гібридизацію проводять при приблизно 68°С бактеріальні трансформації з використанням звипротягом приблизно 3-4 годин для фрагментів чайних способів, добре відомих фахівцям в цій клонованої ДНК та від приблизно 12 до приблизно області техніки. [Див., наприклад, Sambrook, J. et 16 годин для цільної еукаріотичної ДНК. При менal., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., шій суворості, температуру гібридизації знижують Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, до приблизно 12°С нижче від температури плав1989]. Методики гібридизації нуклеїнових кислот лення (ТМ) дуплекса. Відомо, що ТМ є функцією розкриті у Sambrook (вище). вмісту G-C і довжини дуплекса, а також іонної сили У тому значенні, що використовується тут, терозчину. рмін "рослина" стосується рослини в цілому, часУ тому значенні, що використовується тут, тетини рослини чи групи рослинних клітин. Тип росрмін "суттєва ідентичність послідовності" чи "сутлини, який може бути використаний у способі за тєва гомологія" використовується для позначення винаходом, не обмежений і включає, наприклад, того, що н уклеотидна послідовність або амінокисетилен-чутливі та етилен-нечутливі рослини; плолотна послідовність виявляє суттєву стр уктурн у чи дові рослини, такі як абрикоси, яблуні, апельсини, функціональну еквівалентність з іншою нуклеотибанани, грейпфрути, груші, томати, полуниця, аводною чи амінокислотною послідовністю. Будь-яка кадо і т.д.; овочі, такі як морква, горошок, салат, структурна чи функціональна різниця між послідокапуста, турнепс, картопля, броколі, спаржа і т.д.; вностями, що мають суттєву ідентичність послідоквіти, такі як гвоздики, рози, мімози і т.д.; і загалом, вностей чи суттєву гомологію, має бути мінімальбудь-яку рослину, що може сприймати та експреною, тобто вона не повинна впливати на здатність сува ти молекули ДНК за даним винаходом. Він послідовності функціонувати, як це потрібно у заможе включати рослини будь-якого рівня плоїднозначеному застосуванні. Розбіжності можуть бути сті, включаючи гаплоїдні, диплоїдні, тетраплоїдні спричинені, наприклад, варіаціями використання та поліплоїдні. кодонів, властивими різним видам. Структурні Трансгенна рослина визначається тут як росрозбіжності вважаються мінімальними, якщо для лина, генетично модифікована у певний спосіб, двох чи більше різних послідовностей спостерігавключаючи, без обмеження, рослину, до геному ється значний ступінь перекривання чи подібності якої було введено гетерологічну чи гомологічну послідовностей, або якщо послідовності виявляДНК чи модифіковану ДНК старіння-індукованої ють аналогічні фізичні характеристики, навіть якщо ліпази чи певну частину ДНК гетерологічної стаці послідовності відрізняються довжиною чи струкріння-індукованої ліпази чи ДНК гомологічної статурою. Такі характеристики включають, наприклад, ріння-індукованої ліпази. Змінений генетичний маздатність гібридизуватися за певних умов або, у теріал може кодувати протеїн, включати випадку протеїнів, імунологічну кросреактивність, регуляторну чи контрольну послідовність, або моаналогічну ферментативну активність тощо. же бути антисмисловою послідовністю чи включаКрім того, дві нуклеотидні послідовності є "по ти антисмислову послідовність, або кодувати ансуті коплементарними", якщо ступінь подібності тисмислову РНК, що є антисмисловою до ДНК чи цих послідовностей становить щонайменше примРНК-послідовності ендогенної старінняблизно 40 процентів, краще, щонайменше приблиіндукованої ліпази рослини чи її частини. "Трансзно 60 процентів, і найкраще, приблизно 90 процеген" чи "трансгенна послідовність" визначається як нтів. Дві амінокислотні послідовності є по суті чужорідний ген чи часткова послідовність, які було гомологічними, якщо вони мають ступінь подібносвведено до трансгенної рослини. ті між активними ділянками поліпептидів щонайТермін "гібридизація" в тому значенні, що применше 40%, краще, 70%. йняте тут, загалом використовується для познаУ тому значенні, що використовується тут, чення гібридизації нуклеїнових кислот за умов відфраза "гібридизується з відповідною частиною" повідної суворості, як це має бути зрозуміло молекули ДНК чи РНК означає, що молекула, яка 21 85528 22 гібридизується, наприклад, олігонуклеотид, полівірогідніше відбувається за природних умов у ненуклеотид чи будь-яка нуклеотидна послідовність модифікованій рослині чи сорті рослини. Кращою (у смисловій чи антисмисловій орієнтації) розпізміною є така, що приводить до зниження продузнає та гібридизується з послідовністю в іншій мокування рослиною старіння-індукованої ліпази у лекулі нуклеїнової кислоти, що має приблизно тапорівнянні з продукуванням у немодифікованій кий саме розмір та достатній ступінь подібності рослині. послідовності для забезпечення можливості гібриПри одержанні генетично зміненої рослини дизації за відповідних умов. Наприклад, антисмисвідповідно до даного винаходу, краще обирають лова молекула довжиною 100 нуклеотидів з 3'індивідуальні паростки чи рослини за бажаною кодуючої чи некодуючої ділянки ліпази гвоздики ознакою, звичайно, зниженою експресією чи пророзпізнає та гібридизується з ділянкою довжиною дукуванням старіння-індукованої ліпази. Експресія близько 100 нуклеотидів нуклеотидної послідовностаріння-індукованої ліпази може бути визначена сті з 3'-кодуючої чи некодуючої ділянки, відповідно, кількісно, наприклад, звичайним способом імуногена старіння-індукованої ліпази Arabidopsis або аналізу з використанням специфічного антитіла, як будь-якого іншого рослинного гена старінняописано в цьому документі. Може бути також вимііндукованої ліпази, якщо дві послідовності мають ряна ферментативна активність старінняступінь подібності приблизно 70% чи більше. Слід індукованої ліпази за допомогою біохімічних спорозуміти, що розмір "відповідної частини" має дособів, описаних в цьому документі. зволяти деякі порушення комплементарності при Для забезпечення можливості експресії нового гібридизації, так що "відповідна частина" може вставленого гена чи послідовності ДНК, що привобути меншою чи більшою за молекулу, яка гібридить до продукування протеїну, який вони кодудизується з нею, наприклад, більшою чи меншою ють, або, у випадку антисмислової ДНК, що має на 20-30%, краще, більшою чи меншою не більш, бути транскрибована, до одержання антисмислоніж приблизно на 12-15%. вої молекули РНК, належні регуляторні елементи Термін "функціональне похідне" нуклеїнової мають бути присутніми у належних положеннях та кислоти (або полі- чи олігонуклеотиду) використоорієнтації по відношенню до гена чи ДНКвується в цьому описі для позначення фрагмента, послідовності. Регуляторні ділянки можуть вклюваріанта, гомолога чи аналога гена чи нуклеотидчати промотор, 5'-нетрансльовану лідерну посліної послідовності, що кодує старіння-індуковану довність та 3'-послідовність поліаденілювання, а ліпазу. Функціональне похідне може зберігати також енхансери та інші регуляторні послідовності. принаймні частину функції ДНК, яка кодує старінПромоторні регуляторні елементи, придатні ня-індуковану ліпазу, що дозволяє її використання для використання з геном старіння-індукованої відповідно до винаходу. Така функція може вклюліпази для одержання смислових чи антисмислочати здатність гібридизуватися з нативною старінвих транскриптів гена, включають загалом будьня-індукованою ліпазою гвоздики чи суттєво гомоякий рослинний промотор, а конкретніше, констилогічною ДНК від іншої рослини, що кодує тутивний промотор, такий як промотор 35S вірусу старіння-індуковану ліпазу чи з її мРНКбородавчастої мозаїки фікусу, подвійний промотор транскриптом, або, в антисмисловій орієнтації, 35S, промотор вірусу мозаїки цвітної капусти, проінгібувати транскрипцію та/або трансляцію росмотор CaMV 35S чи промотор MAS, або тканиналинної мРНК старіння-індукованої ліпази і тощо. специфічний чи старіння-індукований промотор, "Фрагмент" гена чи ДНК-послідовності стосутакий як промотор GST1 пелюстків гвоздики чи ється будь-якої частини молекули, наприклад, копромотор SAG12 Arabidopsis [див., наприклад, ротшого полінуклеотиду чи олігонуклеотиду. "ВаJ.C.Palaqui et al., Plant Physiol., 112:1447ріант" стосується молекули, по суті аналогічної 1456(1996); Morton et al., Molecular breeding, 1:123цілому гену чи його фрагменту, такого як варіант 132 (1995); Fobert et al., Plant Journal, 6:567-577 нуклеотидного заміщення, що має один чи кілька (1994); та Gan et al., Plant Physiol., 113:313 (1997), заміщених нуклеотидів, але який зберігає здатякі включені до цього опису як посилання]. Краще, ність гібридизуватися з конкретним геном або копромотор, що використовується в даному винаходува ти мРНК-транскрипт, що гібридизується з наді, є конститутивним промотором. тивною ДНК. "Гомолог" стосується послідовності Рівні експресії промотору, який є придатним фрагмента чи варіанта від різних рослинних родів для використання за даним винаходом, можуть чи видів. "Аналог" стосується неприродної молебути перевірені з використанням звичайних систем кули, по суті аналогічної за структурою чи функціекспресії, наприклад, шляхом вимірювання рівнів єю до цілої молекули, її варіанта чи фрагмента. продукту репортерного гена, наприклад, протеїну "Змінена експресія" чи "модифікована експречи мРНК у екстрактах листя, квіток, плодів чи інсія" гена, наприклад, гена старіння-індукованої ших тканин трансгенної рослини, до якої був ввеліпази, позначає будь-який процес чи результат, у дений промотор/репортер. якому нормальна експресія гена, наприклад, та Даний винахід пропонує антисмислові олігонуекспресія, що відбувається у немодифікованій клеотиди та полінуклеотиди, комплементарні до гвоздиці чи іншій рослині, є зміненою у певний гена, що кодує старіння-індуковану ліпазу гвоздиспосіб. У цілях даного опису, зміною експресії гена ки, комплементарні до гена, що кодує старіннявважається повне чи часткове зниження експресії індуковану ліпазу Arabidopsis, або комплементарні гена старіння-індукованої ліпази, але вона може до гена чи генного фрагмента від іншої рослини, також включати зміну часового графіка експресії який гібридизується з геном старіння-індукованої або інший стан, у якому експресія гена старінняліпази гвоздики чи Arabidopsis за умов від низької індукованої ліпази відрізняється від такої, що найдо високої суворості. Такі антисмислові олігонук 23 85528 24 леотиди повинні мати у довжину щонайменше зберігаючи при цьому здатність утворювати стабіприблизно шість нуклеотидів для забезпечення льний дуплекс. Фахівець в цій галузі може визнамінімальної специфічності гібридизації і можуть чити прийнятний рівень порушення комплементабути комплементарними до однієї нитки ДНК чи рності за допомогою стандартних методик, мРНК, що кодує старіння-індуковану ліпазу чи її наприклад, визначення температури плавлення частину, або до фланкуючих послідовностей геногібридизованого комплексу. мної ДНК, які беруть участь у регулюванні експреАнтисмислові олігонуклеодиди РНК можуть сії гена старіння-індукованої ліпази. Антисмислобути одержані внутрішньоклітинно шляхом трансвий олігонуклеотид може складатися з приблизно крипції з екзогенно введених послідовностей нукдо 100 нуклеотидів і за довжиною може сягати леїнових кислот. Антисмислова молекула може довжини повної кодуючої послідовності, до якої він бути введена у клітину шля хом трансформації чи є антисмисловим, чи перевищувати її. Антисмистрансфекції чи інфікування вектором, таким як лові олігонуклеотиди можуть бути ДНК чи РНК або плазміда чи вірус, у які було включено ДНК, що хімерними сумішами ДНК та РНК або їхніх по хідкодує антисмислову послідовність старінняних чи модифікованих варіантів, однониткових чи індукованої ліпази, функціонально зв'язану з віддвониткових. повідними регуляторними елементами, включаючи Дія антисмислових олігонуклеотидів може промотор. У клітині екзогенна ДНК-послідовність спричинити зміну, насамперед інгібування, експреекспресується, продукуючи антисмислову РНК сії гена старіння-індукованої ліпази у клітинах. Загена старіння-індукованої ліпази. гальне обговорення антисмислових послідовносПереважно векторами можуть бути плазмідатей див. у: [Alberts et al., Molecular Biology of the ми, або вони можуть бути вірусними чи іншими Cell, 2nd ed., Garland Publishing, Inc., New York, New векторами, відомими фахівцям, придатними для York (1989, зокрема, сторінки 195-196, що включереплікації та експресії кодованих ними генів у росні сюди як посилання)]. линних клітинах чи бактеріальних клітинах. Вектор Антисмисловий олігонуклеотид може бути інтегрується з хромосомами у такий спосіб, щоб комплементарним до будь-якої частини гена ставін міг транскрибуватися з продукуванням бажаної ріння-індукованої ліпази. В одному варіанті втіленантисмислової РНК старіння-індукованої ліпази. ня, антисмисловий олігонуклеотид може, наприТакі плазмідні чи вірусні вектори можуть бути скоклад, мати довжину від 6 до 100 нуклеотидів і нструйовані способами технології рекомбінантної може бути комплементарним до 5'-некодуючої ДНК, що є стандартними за сучасним рівнем техніпослідовності чи 3'-кінця послідовності старінняки. Наприклад, вектор може бути плазмідним векіндукованої ліпази. Відомо, що антисмислові олітором, що містить систему реплікації, функціонагонуклеотиди, насамперед комплементарні до 5'льну у прокаріотичному хазяїні, та антисмисловий некодуючих послідовностей, є ефективними інгібіолігонуклеотид чи полінуклеотид за винаходом. За торами експресії генів, що кодують фактори трансіншим варіантом, вектор може бути плазмідою, що крипції [Branch, MA, Molec. Cell Biol., 13:4284-4290 містить систему реплікації, функціональну у (1993)]. Agrobacterium, та антисмисловий олігонуклеотид Кращі антисмислові олігонуклеотиди є по суті чи полінуклеотид за винаходом. Плазміди, здатні комплементарними до відповідної частини мРНК, реплікуватися у Agrobacterium, добре відомі фахіщо кодує старіння-індуковану ліпазу. Наприклад, вцям. [Див. Miki et al., Procedures for Introducing очікується, що введення до рослини повного клону Foreign DNA into Plants, Methods in Plant Molecular кДНК, що кодує старіння-індуковану ліпазу, в антиBiology and Biotechnology, Eds. B.R. Glick and J.E. смисловій орієнтації, приведе до успішної зміни Thompson, CRC Press (1993), pp.67-83]. експресії гена старіння-індукованої ліпази. Крім Ген ліпази гвоздики був клонований в антитого, введення часткових послідовностей, націлесмисловій орієнтації до плазмідного вектора у таних на специфічні ділянки гена старіннякий спосіб. Плазміда pCD, сконструйована з остоіндукованої ліпази, може бути таким саме ефектива pUC18, що містить промотор 35S вірусу мозаїки вним. цвітної капусти (CaMV), за яким розташований Мінімальний ступінь гомології, потрібний за сайт мультиклонування та термінаторна послідовданим винаходом, є таким, що достатня для оденість октапинсинтази, була використана для клоржання достатньої комплементарності з метою нування гена ліпази гвоздики. pCd-ліпазна (антизабезпечення розпізнавання специфічної РНК- чи смислова) плазміда була сконструйована шляхом ДНК-мішені та інгібування чи зниження її транслясубклонування повного гена ліпази гвоздики в анції чи функції, не впливаючи при цьому на функцію тисмисловій орієнтації до сайта EcoR1 та сайта інших молекул РНК чи ДНК та експресію інших pCd. Аналогічно, плазміда pCDD35S-GST1-ліпази генів. Хоч антисмислові олігонуклеотиди за вина(антисмислова) була сконструйована шляхом споходом включають послідовності, комплементарні чатку субклонування PCR-ампліфікованого фрагдо щонайменше частини РНК-транскрипта гена мента (від -703 до +19 п.н.) промотора глутатіон-S старіння-індукованої ліпази, абсолютна комплеметрансферази 1 (GST1) гвоздики до сайтів BamН1 нтарність є кращою, але не обов'язковою. Здатта Sal1 вектора pCd. Потім повний ген ліпази гвозність до гібридизації може залежати від довжини дики субклонували в антисмисловій орієнтації до антисмислового олігонуклеотиду та ступеня комсайтів Ніnd3 та EcoR1 конструкта. Інша плазміда плементарності. Загалом, чим довше нуклеїнова плазміда pGdD35S-GST1-GUS - була сконструйокислота, що гібридизується, тим більше порушень вана шляхом спочатку субклонування PCRкомплементарності основ у цільовій послідовності ампліфікованого фрагмента (від -703 до +19 п.н.) старіння-індукованої ліпази вона може містити, промотору глутатіон-S трансферази (GST1) гвоз 25 85528 26 дики до сайтів BamН1 та Sal1 вектора pCd. Потім з протопластів, калюсу, частин тканини чи експларепортерний ген бета-глюкуронідази (GUS) субнтатів і тощо. Частини тканини, одержані з регенеклонували до сайтів Sal1 та EcoRI конструкта. рованих рослин, у яких було змінено експресію pCd-35S2-ліпазна (антисмислова) плазміда була старіння-індукованої ліпази, такі як листя, квітки, сконструйована шляхом субклонування спочатку плоди, насіння і т.п., включені до визначення "росподвійного промотора 35S (який містить дві копії лини", що використовується в цьому описі. Потомпромотора CaMV 35S послідовно) до сайтів Sma1 ство, варіанти та мутанти регенерованих рослин та Hind3 вектора pCd. Потім повний ген ліпази також включені до визначення "рослини". гвоздики субклонували в антисмисловій орієнтації Даний винахід також пропонує протеїн старіндо сайтів Hind3 та EcoRI конструкта. ня-індукованої ліпази гвоздики чи Arabidopsis, коОлігонуклеотид, який переважно має в довжидований молекулами кДНК за винаходом, та прону від приблизно 6 до приблизно 100 нуклеотидів і теїни, які виявляють кросреактивність з антитілом є комплементарним до цільової послідовності стадо протеїну гвоздики чи Arabidopsis. Такі протеїни ріння-індукованої ліпази, може бути одержаний, мають амінокислотну послідовність, наведену у наприклад, з використанням технологій рекомбіSEQ ID NO:2, зображену на Фігурі 1, виявляють нації нуклеотидів або може бути синтезований з спільну кросреактивність з антитілами до протеїну, мононуклеотидів чи коротших олігонуклеотидів. представленого SEQ ID NO:2, мають амінокислотДля хімічного синтезу оліго- та полінуклеотидів за ну послідовність, представлену SEQ ID NO:19 (зовинаходом можуть бути використані автоматизображена на Фігурі 14), або виявляють спільну кровані синтезатори. Методики конструювання рекосреактивність з антитілами до протеїну, мбінантних нуклеотидних молекул відповідно до представленого SEQIDNO:19. даного винаходу розкриті у [Sambrook, J. et al., Протеїн старіння-індукованої ліпази гвоздики Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., чи Arabidopsis чи його функціональні похідні краще Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY продукуються за рекомбінантними технологіями, (1989), яку цілком включено до даного опису]. Олінеобов'язково у поєднанні зі способами хімічного гонуклеотиди, що кодують антисмислову РНК, синтезу. В одному варіанті втілення винаходу, комплементарну до послідовності старіннястаріння-індукована ліпаза експресується як злиіндукованої ліпази, можуть бути одержані з викотий протеїн, що складається зі старінняристанням процедур, добре відомих фахі вцям в індукованої ліпази, злитої з мальтозацій галузі. Детальний опис таких методик наведезв'язувальним протеїном. Експресія клону, що коний у [Maniatis, Т. et al., Molecular Mechanisms in дує рекомбінантний злитий протеїн, дає злитий the Control of Gene Expression, Eds. Nierlich et al., протеїн очікуваної молекулярної ваги, який гідроліAcad. Press, N.Y. (1976)]. зує п-нітрофенілпальмітат, фосфоліпід та триациВ іншому варіанті втілення винаходу, інгібулгліцерин, що є показником ліпазної активності. вання експресії ендогенної рослинної старінняРекомбінантний протеїн старіння-індукованої ліпаіндукованої ліпази є результатом співпригнічення зи виявляє за результатами аналізу способом весшляхом надекспресії екзогенного гена чи фрагметерн-блотингу велику смугу після імуноблотування нта гена старіння-індукованої ліпази, введеного до з антитілом до старіння-індукованої ліпази гвоздирослинної клітини. У цьому варіанті втілення винаки. Вільна старіння-індукована ліпаза (50,2кДа), ходу, до клітин вводять вектор, що кодує старіннящо вивільняється шляхом обробки злитого протеїіндуковану ліпазу в смисловій орієнтації, у такий ну протеазою фактор Ха, також реагує з антитілом саме спосіб, як було описано тут для антисмислостаріння-індукованої ліпази за результатами анавих молекул. Переважно старіння-індукована ліпалізу способом вестерн-блотингу (Фігура 3). Пошук за функціонально зв'язана із сильним конститутимотиву амінокислотної послідовності старіннявним промотором, таким як, наприклад, промотор індукованої ліпази показує присутність потенційновірусу бородавчастої мозаїки фікусу чи CaMV35S. го сайта N-міристоїлювання (Фігура 1) для ковалеТрансгенні рослини, виготовлені відповідно до нтного приєднання міристату за допомогою амідданого винаходу, можуть бути одержані шляхом ного зв'язка [див. Johnson et al., Ann. Rev. ДНК-трансформації з використанням будь-якого Biochem., 63:869-914 (1994); Towler et al., Ann. Rev. способу трансформації рослин, відомого фахівBiochem., 57:67-99 (1988); та R.J.A. Grand, цям. Способи трансформації рослин включають Biochem. J., 258:625-638 (1989)]. Пошук протеїнопряму співкультивацію рослин, тканин чи клітин з вого мотиву також показав, що старінняAgrobacterium tumerfaciens чи пряму інфекцію [Miki індукована ліпаза гвоздики містить послідовність et al., Meth. in Plant Mol. Biol. and Biotechnology ITFAGHSLGA (SEQ ID NO:4), яка є консерватив(1993), рр.67-88]; пряме перенесення генів у проною консенсусною послідовністю ліпази (Таблиця топластах чи поглинання протопластів [Paszkowski 1). Консервативна консенсусна послідовність ліпаet al., EMBO J., 12:2717 (1984)); електропорацію зи для різних рослин наведена у таблиці нижче. (Fromm et al., Nature 319:719 (1986)]; бомбардування частинками [Klein et al., BioTechnoogy, Таблиця 1 6:559-563 (1988); ін'єкцію до меристематичних тканин паростків та рослин (De LaPena et al., Nature, Вид рослин Консервативна ліпазна послідовність 325: 274-276 (1987)]; ін'єкцію до протопластів кульГвоздика I T F A G H S L G A (SEQ ID NO:4) тур клітин та тканин [Reich et al., BioTechnology, Томат I T F T G H S L G A (SEQ ID NO:3) 4:1001-1004 (1986)]. Arabidopsis I T T C G H S L G A (SEQ ID NO:9) Загалом в результаті процесу трансформації Ipomoea nil I T V T G H S L G S (SEQ ID NO:10) одержують цільну рослину. Рослини регенерують 27 85528 28 Було показано, що протеїн старіннятиду G38 або пептидного фрагмента. Модифікації індукованої ліпази за винаходом виявляє ліпазну пептиду старіння-індукованої ліпази чи його фрагактивність за результатами аналізів in vitro та in мента можуть бути здійснені шляхом проведення situ. Для проведення вимірів in vitro використовуреакції цільових амінокислотних залишків пептиду вали як субстрати п-нітрофенілпальмітат та соєз органічним дериватизуючим агентом, здатним до вий фосфоліпід (40% фосфатидилхоліну та 60% реакції з обраними бічними ланцюгами чи терміінших фосфоліпідів), а продукти реакції - пнальними залишками. нітрофенол та вільні жирні кислоти, відповідно, Протеїн чи пептид старіння-індукованої ліпази вимірювали спектрофотометрично [Pencreac'h and за винаходом може бути продукований шляхом, Baratti, 1996; Nixon and Chan, 1979; Lin et al., 1983]. культивування клітини, трансформованої нуклеоЛіпазну активність також вимірювали in vitro спотидною послідовністю за даним винаходом (у смисобом газової хроматографії з використанням мословій орієнтації), надання клітині можливості для дифікації способу, описаного Nixon and Chan синтезу протеїну, а потім виділення протеїну у (1979) та Lin et al. (1983). Реакційна суміш містила вигляді вільного протеїну чи злитого протеїну, за100мМ трис-НСІ (рН 8,0), 2,5мМ субстрату (трилілежно від використаного протоколу клонування, з нолеїн, соєвий фосфоліпід чи дилінолеїлфосфакультурального середовища чи з клітинних естрактидилхолін) та ферментний протеїн (100мкг) у кінтів. За іншим варіантом, протеїн може бути продуцевому об'ємі 100мкл. Субстрати емульгували у кований у безклітинній системі [Ranu et al., Meth. 5% гуміарабіку перед доданням до реакційної суEnzymol.; 60:459-484 (1979)]. міші. Для цього субстрати розчиняли у хлорофорПісля наведеного вище загального опису вимі, додавали до розчину гуміарабіку і емульгували находу, він буде більш детально пояснений з поозвучуванням протягом 30с. Після емульгування силанням на наведені далі приклади, які наведено хлороформ випаровували у потоці N2. Реакцію для ілюстрації і не повинні вважатися такими, що проводили при 25°С протягом змінних періодів обмежують даний винахід. часу тривалістю до 2 годин. Потім реакційну суміш Приклад 1 екстрагували ліпідами і вільні жирні кислоти очиРослинні матеріали, використані для виділенщали способом ТШХ, дериватизували та кількісно ня кДНК ліпази гвоздики визначали способом ГХ [McKegney et al., 1995]. Рослини гвоздики (Dianthus caryophyllus L. cv. Ліполітична ацилгідролазна активність виміImproved white Sim), які вирощувалися та утримурювалась in situ, як описано Furukawa et al. (1983), валися у теплиці, були використані для виділення з модифікаціями Tsuboi et al. (1996). В цьому нуклеотидної послідовності, що відповідає гену останньому аналізі Е.coli, трансформовану повним старіння-індукованої ліпази. Квіткову тканину у клоном кДНК, що кодує старіння-індуковану ліпазу, формі старіючих пелюстків квіток (з різних стадій вирощували у мінімальному сольовому середовирозвитку) збирали у буфері або зберігали при щі з добавкою твін-40 чи твін-60, які обидва є 70°С до використання. складними ефірами довголанцюгових жирних кисЦитозольні ліпідні частинки виділяли з пелюслот, як єдиного джерела карбону. Таким чином, тків квіток гвоздики, зібраних безпосередньо перед карбон для бактеріального росту був доступний початком старіння. Пелюстки гвоздики (25г/150мл лише у тому випадку, якщо ефіри жирних кислот буфера) гомогенізували при 4°С у буфері для гогідролізувалися ліпазою. Результати, за якими могенізації (50мМ Epps - 0,25М сорбіту, рН 7,4, Е.coli, трансформовані кДНК старіння-індукованої 10мМ EDTA, 2мМ EGTA, 1мМ PMSF, 1мМ бензаліпази, росли у базальному середовищі з твін-40 мідину, 10мМ аміно-н-капронової кислоти та 4% чи твін-60 після початкової лаг-фази, у той час як полівінілполіпіролідону) протягом 45 секунд у приконтрольні культури нетрансформованої Е.coli не строї Omnimizer та ще хвилину у гомогенізаторі росли, підтверджує ліпазну активність кодованого Polytron. Гомогенат фільтрували крізь чотири шарекомбінантного протеїну (Фігура 5). Таким чином, ри сирної серветки і фільтрат центрифугували при старіння-індукована ліпаза вивільняє стеарат 10000´g протягом двадцяти хвилин при 4°С. На(твін-60) та пальмітат (твін-40) для одержання недосадну рідину центрифугували протягом однієї обхідного для росту карбону. години при 250000´g для ізоляції мікросомальних "Функціональні похідні" протеїну старіннямембран. Ліпідні частинки були одержані з постіндукованої ліпази, описані в цьому документі, є мікросомальної надосадної рідини шляхом збифрагментами, варіантами, аналогами чи хімічними рання частинок після флотаційного центрифугупохідними старіння-індукованої ліпази, які зберігавання за способом Hudak and Thompson (1997), ють принаймні частину активності старінняPhysiol. Plant., 114:705-713. Надосадну рідину доіндукованої ліпази або імунологічну кросреактивводили до 10% (мас/об.) сахарози і 23мл цієї наність з антитілом, специфічним до старіннядосадної рідини наливали до пробірок центрифуги індукованої ліпази. Фрагмент протеїну старіння60 Ті Beckman, заливали зверху 1,5мл буфера для індукованої ліпази стосується будь-якої складової ізоляції і центрифугували при 305000´g протягом частини молекули. Варіантні пептиди можуть бути 12 годин при 4°С. Частинки видаляли з верхнього одержані прямим хімічним синтезом, наприклад, з шару буфера для ізоляції за допомогою пастерки. використанням способів, добре відомих фахівцям. Три мл суспензії частинок завантажували у колонАналог старіння-індукованої ліпази стосується ку Sepharose G-25, урівноважену стерильним фонеприродного протеїну, по суті аналогічного цільсфатно-сольовим буфером (PBS) (10мМ натрійному протеїну або його фрагменту. Хімічні похідні фосфа тного буфера, рН 7,5, плюс 0,85% хлориду старіння-індукованої ліпази містять додаткові хімінатрію) і суспензію елюювали стерильним PBS. чні групи, які звичайно не входять до складу пепЕлюювали поровий об'єм, що містить частинки, і 29 85528 30 концентрували за допомогою фільтра Centricon-10 GAT G-3' (SEQ ID NO:21). Продукт PCR субклону(постачається фірмою Amicon) до концентрації вали до Bluescript для секвенування. Нуклеотидна протеїну 600мкг. Після цього ліпідні частинки вита амінокислотна послідовності використаного користовували для генерування антитіл у кролях, продукту PCR показані на Фігурі 14. інокульованих 300мкг частинок. Титр IgG крові Ізоляція плазмідної ДНК, секвенування ДНК визначали аналізом за способом вестернДля ізоляції плазмідної ДНК був використаний блотингу. спосіб лужного лізису, описаний Sambrook et al. Ізоляція матричної РНК (мРНК) (вище). Повний позитивний клон кДНК секвенуваЦільну РНК ізолювали з пелюстків квіток гвозли з використанням способу дидезоксисеквенудики стадії І, II, III чи IV, по суті як описано вання [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, [Czomczynski and Sachi, Anal. Biochem., 162:15674:5463-5467]. Відкриту рамку зчитування компо159 (1987)]. Стисло, 15г тканини пелюстків замонували та аналізували за допомогою пошукової рожували у рідкому азоті і гомогенізували протясистеми BLAST (GenBank, Bethesda, MD), а порівгом 30с в буфері, що містить 4М гуанідінійтіоціананяння первинної структури п'яти найбільш гомолоту, 25мМ цитрату натрію, рН 7,0, 0,5% саркозилу гічних протеїнів з розшифрованою амінокислотною послідовністю кодованого гена здійснювали за та 0,1М b-меркаптоетанолу. До гомогенізованого допомогою програми формування умов пошуку зразка додавали 150мл насиченого водою фенолу, 30мл хлороформу та 15мл 2М NaOAc, рН 4,0. ВСМ Search Launcher: Multiple Sequence Alignments Pattern-Induced Multiple Alignment Зразок центрифугували при 10000´g протягом Method (схема порівняння первинної структури десяти хвилин, водну фаз у видаляли і нуклеїнові численних послідовностей - спосіб індукування кислоти осаджували з неї за допомогою 150мл порівняння численних послідовностей) [див. F. ізопропанолу. Зразок центрифугували протягом Corpet, Nuc. Acids Res., 16:10881-10890, (1987)]. десяти хвилин при 5000´g і осад промивали одноФункціональні мотиви, присутні у розшифрованій кратно 30мл 4М LiCI, екстрагували 30мл хлорофоамінокислотній послідовності, були ідентифіковані рму і осаджували 30мл ізопропанолу, що містить за допомогою MultiFinder. 0,2М NaOAc, рН 5,0. РНК розчиняли у воді, обробЕкспресія ліпази як злитого протеїну леній діетилпірокарбонатом (DEPC), і зберігали Фагміда pBK-CMV, що містить повну старінняпри -70°С. індуковану ліпазу гвоздики, гідролізували за допоПоліА+ мРНК ізолювали із загальної РНК, вимогою EcoRI та Xbal, які вивільняли фрагмент лікористовуючи систему для ізоляції PolyA+ tract пази розміром 1,53 т.п.н., який субклонували у mRNA Isolation System фірми Promega. ПоліА+ гідролізований EcoRI та Xbal вектор злиття pMalc мРНК використовували як матрицю для синтезу (New England BioLabs). Вектор pMalc, що містить кДНК з використанням системи для синтезу кДНК старіння-індуковану ліпазу, позначений як pMLip, ZAP ExpressÒ фірми Stratagene (La Jolla, Calif.). використовували для трансформування клітин Скринінг бібліотеки кДНК пелюстків гвоздики E.coli BL-21 (DE3). Бібліотека кДНК була виготовлена з викорисЗлитий протеїн, кодований pMLip (продукт танням мРНК, ізольованої з пелюстків гвоздики 6 злиття старіння-індукованої ліпази та мальтозастадії IV, розведеної до приблизно 5´10 бляшкоузв'язувального протеїну) ізолювали і очищали, як творюючих одиниць (PFU)/wm та підданої імуноскописано у [Sambrook et al. (вище) та Ausubel et al., ринінгу антисироваткою до ліпідних частинок. ПоCurrent Protocols in Molecular Biology, Green зитивні клони кДНК виділяли за допомогою Publishing Associates and Wiley Interscience, New системи фільтрації ExAssistÒ Helper Phage/SOLR York (1987), 16.4.1-16.4.3]. Стисло, клітини E.coli Ò та рециркуляризували у фагміді pBluescript BL-21, трансформовані pMLip, ресуспендували у (Stratagene). Бібліотеу кДНК пелюстків гвоздики 3мл/г лізатному буфері (50мМ трис, рН 8,0, 100мМ стадії III також піддавали скринінгу з використан32 NaCI та 1мМ EDTA), який містить 8мкл 50мМ ням Р-міченого зонда з 19 пар основ (5'PMSF та 80мкл 20мг/мл лізозиму на грам клітин, ACCTACTAGGTTCCGCGTC-3') (SEQ ID NO:5). та інкубували протягом двадцяти хвилин при кімПозитивні клони кДНК вирізали з фагів та рецирнатній температурі зі струшуванням. Потім додаÒ куляризували у фагміді pBK-CMV (Stratagene) з вали 80мкл 5% дезоксихолінової кислоти та 40 використанням методики, описаної в інструкції одиниць ДНКази І і клітини струшували при кімнавиробника. Повну кДНК (фрагмент 1,53 т.п.н.) тній температурі до повного лізису клітин. Клітинні вставляли до вектора pBK-CMV. уламки осаджували центрифугуванням і ресуспеСкринінг бібліотеки кДНК листя Arabidopsis ндували у дво х об'ємах лізатного буфера плюс 8М Повний клон кДНК (1338 п.н.) гена старіннясечовина та 0,1мМ PMSF. Через одну годину доіндукованої ліпази Arabidopsis thaliana ізолювали давали сім об'ємів буфера (50мМ KН2РО4 , 1мМ шляхом скринінгу бібліотеки кДНК старіючого лисEDTA та 50мМ NaCI, рН 7,0) для нейтралізації сутя Arabidopsis. Зонд, що використовувався для спензії. рН клітинної суспензії доводили до 8,0 за скринінгу бібліотеки, одержували способом PCR з допомогою НСІ і клітинні уламки осаджували використанням як матриці бібліотеки старіючого центрифугуванням. Надосадну рідину діалізували листя. Праймери PCR були сконструйовані на оспроти буфера 20мМ трис, рН 8,0, 100мМ NaCI та нові геномної послідовності (U93215), що знахо1мМ EDTA при 4°С протягом ночі. Продукт злиття диться у GenBank. Прямий праймер мав послідовмальтоза-зв'язувального протеїну-ліпази (Маlір) ність 5'-ATG TCT AGA GAA GAT ATT GCG CGG очищали з використанням амілозної колонки (виCGA-3' (SEQ Ю NO:20), а зворотний - послідовробляється фірмою New England Biolab). Фракції, ність 5'-GAT GAG CTC GAC GGA GCT GAG AGA що містять злитий протеїн, розщеплювали протеа 31 85528 32 зою фактор Ха (1мкг/100мкг злитого протеїну) для Геномну ДНК гідролізували окремо узятими відокремлення ліпази від продукту злиття. Як злирестрикційними ендонуклеазами (BamHI, Xbal, тий протеїн, так і розщеплену ліпазу аналізували Xhol, EcoRI, Hindlll та Sall) і гідролізовану ДНК способами електрофорезу на поліакриламідному фракціонували на 1% агарозному гелі. Розділену гелі з добавкою ДСН (SDS PAGE) та вестернДНК переносили блотингом на найлонові мембраблотингу. Як контроль використовували мальтозани і здійснювали гібридизації з використанням 32Pзв'язувальний протеїн, кодований рМаlс. РезульdCTP-міченого 1,53 т.п.н. фрагмента ліпази. Гібтати представлені на Фігурі 3. ридизацію та промивку проводили за умов високої Гібридизація РНК гвоздики способом нозернсуворості (68°С, 6´ SSC, 2´ реагент Денхарта, блотингу 0,1% ДСН), а також за умов низької суворості Десять мкг загальної РНК, ізольованої з квіток (42°С для гібридизації та промивки) (6´ SSC, 5´ на стадіях І, II, III, IV, розділяли на 1% денатуруюреагент Денхарта, 0,1% ДСН). Результати зобрачих формальдегід-агарозних гелях та іммобілізужені на Фігурі 6. Як видно, зонд з ліпазної кДНК вали на найлонових мембранах. Як зонд для анадетектує лише один геномний фрагмент, вказуючи лізу фільтрів використовували 1,53 т.п.н. EcoRIна те, що ген ліпази гвоздики є одноколійним геXbal фрагмент ліпази, мічений 32P-dCTP за допоном. могою готового до застосування набору з випадФерментативні аналізи ліпази ковим праймером (Boehringer Mannheim) Ліполітичну ацилгідролазну активність очище(7´107імп/хв). Фільтри промивали один раз 1´ ного злитого протеїну ліпази оцінювали спектроSSC, 0,1% ДСН при кімнатній температурі і три фотометрично з використанням як екзогенних субрази 0,2´ SSC, 0,1% ДСН при 65°С. Фільтри висустратів п-нітрофенілпальмітату та соєвого шували і експонували на рентгенівській плівці профосфоліпіду. Для одного мальтоза-зв'язувального тягом ночі при -70 С. Результати показані на Фігурі протеїну, що використовувався як контроль, не 4. спостерігалося помітної ліпазної активності при Гібридизація РНК Arabidopsis способом новикористанні фофоліпіду як субстрату (Таблиця 2). зерн-блотингу Коли п-нітрофенілпальмітат використовувався як Десять мкг загальної РНК, ізольованої з листя субстрат тільки для мальтоза-зв'язувального проArabidopsis на 2, 3, 4, 5 та 6 тижні росту, розділяли теїну, то детектувалася невелика кількість пна 1% денатур уючих формальдегід-агарозних генітрофенолу, який є очікуваним продуктом ліпазлях та іммобілізували на найлонових мембранах. ної реакції, що відображає фонові рівні пЯк зонд для аналізу фільтрів використовували нітрофенолу у комерційному препараті пповний ген старіння-індукованої ліпази Arabidopsis, нітрофенілпальмітату (Таблиця 2). Однак, у присумічений 32P-dCTP за допомогою готового до застотності очищеного злитого протеїну ліпази виявлясування набору з випадковим праймером лася очевидна сильна ліпазна активність у формі вивільнення вільних жирних кислот з фосфоліпіду (Boehringer Mannheim) (7´107імп/хв). Фільтри прота п-нітрофенолу з п-нітрофенілпальмітату (Табмивали один раз 1´ SSC, 0,1% ДСН при кімнатній лиця 2). температурі і три рази 0,2´ SSC, 0,1% ДСН при Таблиця 2 65°С. Фільтри висушували і експонували на рентСпектрофотометричні виміри ліполітичної генівській плівці протягом ночі при -70°С. ацилгідролазної активності мальтозаІзоляція геномної ДНК і гібридизації способом зв'язувального протеїну та злитого протеїну ліпасаузерн-блотингу зи, експресованого у Е.coli та очищеного хроматоСвіжо зрізані пелюстки гвоздики заморожували графією на амілозній колонці у рідкому азоті, розтирали в порошок і гомогенізуБули використані два субстрати - пвали (2мл/г) з буфером для екстрагування (0,1Μ нітрофенілпальмітат та соєвий фосфоліпід. трис, рН 8,2, 50мМ EDTA, 0,1Μ NaCl, 2% ДСН та Активність виражали за показником утворено0,1мг/мл протеїнази К) для ізоляції геномної ДНК. го продукту (п-нітрофенол з пГомогенізований матеріал інкубували при 37°С нітрофенілпальмітату та вільна жирна кислота з протягом десяти хвилин та екстрагували сумішшю соєвого фосфоліпіду) фенол-хлороформ-ізоаміловий спирт (25:24:1). Наведені середні значення ± стандартна поДНК осаджували за допомогою NaOAc та ізопрохибка для n=3 паралельних дослідів. панолу. Осад ДНК розчиняли у 1´ ТЕ, рН 8,0, реекстрагували фенолом, повторно осаджували та ресуспендували у 1´ ТЕ, рН 8,0. Вид протеїну Мальтоза-зв'язувальний протеїн Злитий протеїн ліпази Продукт вільна жирна кислота (нмоль/мг pNPP п-нітрофенол (нмоль/мг/хв) протеїну/хв) 0,71±0,02 н.в.* 12,01±1,81 46,75±1,24 н.в. - не виявлено В інших експериментах, ферментативну активність злитого протеїну ліпази оцінювали способом газової хроматографії, яка є методикою, що дозволяє кількісне вимірювання та ідентифікацію вільних жирних кислот, вивільнених з субстрату. Як субстрати використовувалися трилінолеїн, соє 33 85528 34 вий фосфоліпід та дилінолеїлфосфатидилхолін, а зи, з екстракту соєвого фосфоліпіду були деестедеестерифіковані жирні кислоти очищали тонкорифіковані пальмітинова, стеаринова та лінолева шаровою хроматографією перед проведенням кислоти, і лінолева кислота була деестерифіковааналізу способом газової хроматографії. За рена з дилінолеїлфосфатидилхоліну (Таблиця 3). На зультатами спектрофотометричного аналізу (Табвідміну від фосфоліпідного субстрату, виявлені лиця 2), тільки для мальтоза-зв'язувального протерівні вільної лінолевої кислоти спостерігалися у їну не спостерігалося виявлюваної ліпазної трилінолеїні, але рівні вільної лінолевої кислоти активності з соєвим фосфоліпідом чи з дилінолеїістотно зростали у присутності злитого протеїну лфосфа тидилхоліном, що свідчить про те, що ці ліпази, вказуючи на те, що ліпаза є здатною також субстрати по суті не містять деестерифікованих деестерифікувати жирні кислоти з триацилгліцежирних кислот (Таблиця 3). Однак, при викорисрину (Таблиця 3). танні як джерела ферменту злитого протеїну ліпаТаблиця 3 Виміри способом ГХ ліполітичної ацилгідролазної активності мальтоза-зв'язувального протеїну та злитого протеїну ліпази, експресованого у Е.coli та очи щеного хроматографією на амілозній колонці Субстрат Трилінолеїн 2 Соєві фосфоліпіди3 Дилінолеїл-фосфатидилхолін 3 Лінолева кислота (18:2) Пальмітинова кислота (16:0) Стеаринова кислота (18:0) Лінолева кислота (18:2) Лінолева кислота (18:2) Продукти (мкг/мг протеїну)1 Мальтоза-зв'язувальний Злитий протеїн протеїн ліпази 15,9±0,75 33,4±1,58 н.в.4 4,80 н.в. 9,68 н.в. 5,80 н.в. 20,00 1 Реакцію проводили протягом 2 годин, i вона впродовж цього періоду не була безперервно лінійною. Наведено середнє ± стандартна похибка для n=3 паралельних дослідів. 3 Одиничний експеримент. 4 Не виявлено. 2 Ліпазна активність протеїну, одержаного шляхом експресії ліпазної кДНК у Е.coli, вимірювали in vi vo, як описано у [Tsuboi et al., Infect. Immunol., 64:2936-2940 (1996); Wang et al., Biotech., 9:741746 (1995); та G.Sierra, J. Microbiol. and Serol., 23:15-22 (1957)]. Окрему колонію клітин Е.coli BL21, трансформовану pMal, та іншу колонію Е.coli BL-21, трнсформовану pMLip, інокулювали у базальне сольове середовище (рН 7,0), яке містить (г/л): K2НРО 4 (4,3), KН2РО4 (3,4), (NH 4)SO 4 (2,0), MgCI2 (0,16), МnСІ2·4Н2 О (0,001), FeSO4·7H2O (0,0006), СаСІ2·2Н2О (0,026) та NaMoO4·2H2O (0,002). Субстрат - твін-40 (поліоксіетиленсорбітанмонопальмітат) чи твін-60 (поліоксіетиленсорбітанмоностеарат) - додавали в концентрації 1%. Ріст бактеріальних клітин при 37°С зі струшуванням контролювали шляхом вимірів оптичної густини на 600нм (Фігура 5). Як видно на Фігурі 5, клітини Е.coli, трансформовані pMLip, були здатні до росту у базальному середовищі з добавкою твін40/твін-60 після початкового лаг-періоду. Однак, клітини Е.coli, трансформовані pMal, не ростуть у середовищі з добавкою твіну. Приклад 2 Етиленова індукція гена старіння-індукованої ліпази гвоздики Квітки гвоздики стадії II та живці гвоздики обробляли 0,5млн -1 етилену у герметизованій камері протягом 15 годин. З пелюстків квіток стадії II та з листя оброблених живців екстрагували РНК, а також з пелюстків та листя квіток та живців необробленої гвоздики, як описано далі. Рослини Arabidopsis обробляли 50мкМ етефону у герметизованій камері протягом одного, двох чи трьох днів. РНК екстрагували з обробленого етефоном листя рослин таким чином. Квітки чи листя (1 квітка чи 5г листів) розмелювали у рідкому азоті. Розмелений порошок змішували з 30мл гуанідинієвого буфера (4М гуанідинійізотіоціанат, 2,5мМ NaOAc, рН 8,5, 0,8% bмеркаптоетанолу). С уміш фільтр ували крізь чотири шари сирної серветки і центрифугували при 10000´g протягом 30 хвилин при 4°С. Потім надосадну рідину піддавали центрифугуванню у градієнті густини хлориду цезію при 26000´g протягом 20 годин. Осад РНК промивали 75% етанолом, ресуспендували у 600мкл DEPC-обробленої води і осаджували РНК при -70°С за допомогою 0,75мл 95% етанолу та 30мкл 3М NaOAc. Десять мкг РНК гвоздики або Arabidopsis фракціонували на 1,2% денатуруючому формальдегід-агарозному гелі і переносили на найлонову мембрану. Як зонд для мембрани, що містить РНК гвоздики, використовували випадково праймовану 32Р-dCTP-мічену повну кДНК старіння-індукованої ліпази гвоздики (SEQ ID NO:1) при 42°С протягом ночі. Як зонд для мембрани, що містить РНК Arabidopsis, використовували випадково праймовану 32Р-dCTP-мічену повну кДНК ліпази Arabidopsis при 42°С протягом ночі. Потім мембрани промивали один раз у 1´ SSC, що містить 0,1% ДСН, при кімнатній температурі протягом 15 хвилин, а потім три рази у 0,2´ SSC, що містить 0,1% ДСН при 65°С по 15 хвилин кожний раз. Мембрани експонували на рентгенівській плівці протягом ночі при -70°С. 35 85528 36 Результати зображені на Фігурі 9 (гвоздика) та (мкСм), що відображають витікання електроліту, Фігурі 16 (Arabidopsis: ланка 1 - одноденна обробвизначали з інтервалами у 6 та 24 години для конка; ланка 2 - дводенна обробка; ланка 3 - триденна трольної та ушкодженої заморозками тканини лисобробка). Можна побачити, що транскрипція ліпази тів. З Фігури 11 зрозуміло, що витікання електролігвоздики та ліпази Arabidopsis індукується у квітках ту, яке відображає ушкодження мембран, та/або листі етиленом. відбувається під час періоду повторного нагріванПриклад 3 ня у тканині листів, ушкоджених заморозком. Одержання продукту PCR томата з викорисАналіз способом нозерн-блотингу РНК, одертанням праймерів ліпази гвоздики жаної з ушкоджених заморозком листів томата Неповну послідовність старіння-індукованої Ізолювали загальну РНК з 15г листів неушколіпази з геномної ДНК томата, одержаної з листя джених заморозком рослин томата (контроль) та томата, генерували способом "гніздового" (nested) ушкоджених заморозком рослин томата, які були PCR з використанням пари олігонуклеотидних повернені до кімнатної температури, в моменти праймерів, сконструйованих з послідовності стачасу 0, 6 та 24 години. Екстрагування РНК здійсріння-індукованої ліпази гвоздики. 5'-праймер є 19нювали, як описано у Прикладі 3. 10мкг РНК з кожмером, який має послідовність 5'ного зразка розділяли на 1,2% денатуруючому CTCTAGACTATGAGTGGGT (SEQ ID NO:7); 3'формальдегідвмісному гелі і переносили на найпраймер є 18-мером, що має послідовність лонову мембрану. Мембрану обробляли 32Р-dCTPCGACTGGCAC AACCTCCA-3' (SEQ ID NO:8). Поміченим зондом (SEQ ID NO:3), а потім промивали лімеразну ланцюгову реакцію з використанням за таких саме умов, як описано у Прикладі 3. Регеномної ДНК томата проводилась таким чином: зультати зображені на Фігурі 12. Компоненти реакції: Як можна побачити з авторадіограми (Фігура Геномна ДНК 100мкг 12Б), експресія гена ліпази томата індукується dNTP (10мΜ кожного) 1мкл заморозками, а характер індукування гена коре5мкл лює з підвищеним витіканням електроліту з ушкоMgCI2 (5мМ) + 10´ буфер джених заморозком листів (Фігура 11). Праймери 1 та 2 (20мкМ кожного) 0,5мкл Приклад 5 Taq ДНК-полімераза 1,25од. Реакційний об'єм 50мкл Одержання трансгенних рослин, що експресують ген старіння-індукованої ліпази в антисмислоПараметри реакції: вій орієнтації 94°С протягом 3хв. Agrobacteria були трансформовані за допомо94°С/1хв., 48°С/1хв., 72°С/2хв., 45 циклів гою бінарного вектора pKYLX71, який містить по72°С протягом 15хв. Неповна послідовність томата, одержана сповний ген старіння-індукованої ліпази Arabidopsis, що експресується в антисмисловій орієнтації під собом PCR, має нуклеотидну послідовність SEQ контролем подвійного промотору 35S. Рослини ID NO:6 (Фігура 10) і розшифровану амінокислотну Arabidopsis були трансформовані за допомогою послідовність, представлену на Фігурі 10. Неповна зазначених Agrobacteria шляхом вакуумної фільтпослідовність включає інтрон (Фігура 10, маленькі літери), розсіяний між двома кодуючими послідоврації, і трансформоване насіння одержаних рослин Т0 піддавали селекції ампіциліном. ностями. Послідовність томата містить консерваВирощували рослини Т1 в умовах теплиці, ративну консенсусну послідовність ліпази зом з рослинами Arabidopsis дикого типу. СпостеITFTGHSLGA (SEQ ID NO:3). рігали за різницею у розмірі листів, загальному Послідовність томата має ступінь ідентичності послідовності 53,4% з послідовністю старіннярозмірі рослин, врожаї насіння та старінням листя між трансгенними рослинами і рослинами дикого індукованої ліпази гвоздики та ступінь ідентичності типу у часі. Відмінності проілюстровані Фігурами послідовності 43,5% з ліпазою Arabidopsis, остання 17, 18, 19 та 20. з яких має ступінь ідентичності послідовності Приклад 6 44,3% з послідовністю гвоздики. Приклад 4 Знижене продукування старіння-індукованої ліпази у трансгенних рослин Загальний протеїн, Вплив заморозків на цілісність клітинної мемізольований з листя Arabidopsis дикого типу у віці брани рослин томата чотирьох тижнів та відповідних трансгенних росРослини томата піддавали дії заморозку пролин, одержаних, як описано у Прикладі 5, перенотягом 48 годин при температурі від 7°С до 8°С, а потім повертали до кімнатної температури протясили на нейлонову мембрану і обробляли як зондом антитілом, що виробляється проти протеїну гом 24 годин. Вплив заморозків на листя оцінювастаріння-індукованої ліпази Arabidopsis. На Фігурі ли шляхом вимірювання кількості витеклого елект21 показані результати аналізу способом вестернроліту (мкСм). блотингу (на ланки 1 та 2 було внесено по 9 мкг Конкретно, 1г тканини листів нарізали у пробірку на 50мл, споліскували дистильованою водою, і протеїну, а на ланки 3 та 4 - по 18мкг протеїну). Експресія старіння-індукованої ліпази у трансгендодавали 40мл деіонізованої води. Пробірки заних рослин була зниженою. кривали пробками і обертали при кімнатній температурі протягом 24 годин. Показники провідності 37 85528 38 39 85528 40 41 85528 42 43 85528 44 45 85528 46 47 85528 48 49 85528 50 51 85528 52 53 85528 54 55 85528 56 57 85528 58 59 85528 60
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюDna coding a plant lipase, transgenic plants and method to control ageing in plants
Автори англійськоюThompson John E., Wang Tsann-Wei, Hudak Katalin, Hong Yuwen
Назва патенту російськоюДнк, кодирующая растительную липазу, трансгенные растения и способ контроля старения у растений
Автори російськоюТомпсон Джон Е., Вонг Тзанн-Уэй, Худак Каталина, Хонг Ювен
МПК / Мітки
МПК: C12N 15/82, C12N 15/09, C12N 15/55, A01H 5/00
Мітки: днк, рослини, кодує, ліпазу, спосіб, контролю, трансгенні, рослинну, рослин, старіння
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/49-85528-dnk-shho-kodueh-roslinnu-lipazu-transgenni-roslini-ta-sposib-kontrolyu-starinnya-u-roslin.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Днк, що кодує рослинну ліпазу, трансгенні рослини та спосіб контролю старіння у рослин</a>
Молекула днк, яка кодує стійку до дії інгібітора рослинну протопорфіриногеноксидазу, спосіб одержання стійких до гербіциду рослин, спосіб боротьби з ростом небажаних рослин
Номер патенту: 70912
Опубліковано: 15.11.2004
Автори: Поттер Шерон Л., Волрат Сандра Л., Уорд Ерік Р., Джонсон Марі А., Хейфетц Пітер Б.
МПК: C12N 15/53, C12N 9/02, C12Q 1/68, G01N 33/15, C12N 5/10, C12N 15/82, A01H 5/00, C12Q 1/26, C12N 9/99, C12N 15/09
Мітки: рослинну, одержання, яка, протопорфіриногеноксидазу, стійку, молекула, інгібітора, дії, днк, гербіциду, боротьби, небажаних, кодує, ростом, спосіб, рослин, стійких
Формула / Реферат:
1. Виділена молекула ДНК, яка включає ділянку, яка кодує модифіковану протопорфіриногеноксидазу (протокс), причому немодифікований протокс являє собою протокс рослини, вибраний із групи, яка включає: SEQ ID NO: 2; 4; 6; 8; 10; 12; 16; 18; 20; 22 і 24, і має модифікацію, яка включає першу амінокислотну заміну, яка відбувається в положенні, вибраному з групи, яка включає:(а) положення, яке відповідає аланіну в положенні 164...
Виділена молекула днк, що кодує біологічно функціональні стимульовану солями жовчних кислот ліпазу / карбоксил-складноефірну ліпазу (ссжл/ксл), реплікований експресуючий вектор, спосіб одержання ссжл/ксл людини
Номер патенту: 41322
Опубліковано: 17.09.2001
Автори: Бьюрселль Карл Гуннар, Лідберг Ульф Фредрік Понтус, Енербекк Курт Свен Магнус, Ханссон Стіг Леннарт, Карлссон Петер Нільс Івар, Тьорнелл Ян Біргер Фредрік, Нільссон Жанетт Анніка
МПК: C12N 5/10, A23C 9/20, A01K 67/027, C12N 15/09, C12N 9/18, C12N 15/85
Мітки: людини, реплікований, виділена, біологічно, стимульовану, вектор, експресуючий, спосіб, молекула, одержання, ліпазу, кислот, кодує, солями, жовчних, функціональні, днк, карбоксил-складноефірну
Формула / Реферат:
1. Выделенная молекула ДНК, кодирующая биологически функциональные стимулируемую солями желчных кислот липазу/карбоксил-сложноэфирную липазу (ССЖЛ/КСЛ) , причем указанная молекула ДНК включает (а) нуклеотидную последовательностьобозначенную как SEQ ID NO: 1, или (б) нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях гибридизации с комплементом...
Молекула днк, що кодує ліпазу людини, що стимулюється солями жовчних кислот, клонована молекула кднк
Номер патенту: 39165
Опубліковано: 15.06.2001
Автори: Бьюрселл Гуннар, Олівекрона Томас, Блукберг Ларс, Енербук Свен, Нілссон Женетт, Карлссон Петер, Хернелл Олле
МПК: A61K 38/00, C07K 14/00, A61P 3/06, A23L 1/30, A61P 1/00, C12N 15/55, C12N 9/18, C12N 15/09, A61K 38/46
Мітки: кислот, клонована, жовчних, молекула, ліпазу, кднк, стимулюється, днк, солями, людини, кодує
Формула / Реферат:
1. Молекула ДНК, кодирующая липазу человека, стимулируемую солями желчных кислот, имеющую следующую аминокислотную последовательность: Met Leu Thr Met Gly Arg Leu Gln Leu Val ...
Спосіб одержання трансгенної рослини, послідовність днк, яка кодує поліфруктан (леван) сахаразу, рослинна клітина
Номер патенту: 40598
Опубліковано: 15.08.2001
Автори: Гайєр Гебхардт, Рьобер Мануела, Гайдер Клаус, Вілльмітцер Лотар
МПК: C12N 9/10, C12N 15/82
Мітки: кодує, трансгенної, рослини, одержання, поліфруктан, спосіб, днк, сахаразу, послідовність, яка, рослинна, леван, клітина
Формула / Реферат:
1. Способ получения трансгенного растения, характеризующегося модифицированным образованием полифруктана в хлоропластах, амилопластах, митохондриях, цитозоле и/или вакуолях, который включает следующие стадии:а) введение выделенной молекулы ДНК в растительную клетку таким образом, что она способна встраиваться в геном указанной клетки, причем указанная молекула ДНК включает(I) промотор, способный регулировать транскрипцию гена...
Ізольована послідовність днк, що кодує epsps фермент, ізольована послідовність днк, що кодує білок, який виявляє epsps активність, рекомбінантна двониткова молекула днк, спосіб одержання генетично трансформованих рослин
Номер патенту: 32548
Опубліковано: 15.02.2001
Автори: Кішор Ганеш Мерті, Беррі Джерард Френсіс, Педжетт Стефен Роджерс
МПК: C12N 15/62, C12N 15/54, C12N 15/82, C12N 9/10, A01H 5/00
Мітки: рослин, одержання, активність, генетично, фермент, білок, молекула, трансформованих, днк, спосіб, двониткова, послідовність, рекомбінантна, виявляє, кодує, epsps, ізольована
Текст:
...к необработанным растениям, полученным из одного и того же Ro-растения О означает полное уничтожение растения, а 10 указывает на видимое отсутствие каких-либо отличий от необработанного растения Более высокий балл в пределах указанной шкалы 0-10 означает меньшие повреждения растения по сравнению с необработанным растением Растения оценивали на 7, 14 и 28-й день после обработки (DTA) или до стрелкования, и давали среднюю оценку...