Штам бактерій bacillus thuringiensis var. israelensis – продуцент позаклітинної фібринолітичної пептидази

Реферат: Штам Bacillus thuringiensis var. israelensis - продуцент позаклітинної фібринолітичної пептидази, що зареєстрований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України під номером IMB В-7465. UA 103136 U (54) ШТАМ БАКТЕРІЙ BACILLUS THURINGIENSIS VAR. ISRAELENSIS - ПРОДУЦЕНТ ПОЗАКЛІТИННОЇ ФІБРИНОЛІТИЧНОЇ ПЕПТИДАЗИ UA 103136 U UA 103136 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід (корисна модель) належить до біотехнології, а саме до одержання нового штамупродуцента фібринолітичної пептидази. Фібринолітична пептидаза - ензим, який використовується в промисловості та медицині для гідролізу фібрину, природного нерозчинного білка крові, який утворюється з фібриногену за допомогою тромбіну. Накопичення фібрину в кров'яних судинах зазвичай приводить до утворення тромбозів, які, в свою чергу, є причиною виникнення інфаркту міокарда, хвороб судин головного мозку, хвороб периферичних артерій та інших серцево-судинних захворювань. Впливаючи на фібринові волокна, фібринолітичні пептидази сприяють розчиненню кров'яних згустків. Тому найбільш перспективним напрямком їх застосування може бути розробка нових лікарських препаратів, спрямованих на гідроліз фібрину, а також застосування в складі мийних засобів для видалення нерозчинних білкових забруднень. Запропонований штам Bacillus thuringiensis var. israelensis IMB B-7465 знаходиться в колекції живих культур Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України. Штам виділений з акваторії о. Зміїний та знаходиться в колекції живих культур кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова. На сьогодні, фібринолітичні ензими були виявлені в зміїній отруті [1], комахах [2], морських істотах [3], а також ферментованій їжі, такої, як японське Natto, Tofuyo, корейський соєвий соус Chungkook-Jang, традиційна китайська їжа Douchi [4]. Фібринолітичні ензими виділено та ідентифіковано з різних мікроорганізмів: бактерій (Streptococcus, Aeromonas hydrophila, Vibrio vulnificus, Serratia, Bacillus natto, B. amyloliquefaciens, Arthrobacter, Actinomycetes) [5, 6, 7, 8] і грибів (Aspergillus, Fusarium sp., Armillaria mellea) [9, 10]. Але найбільш розповсюдженими продуцентами фібринолітичних пептидаз є бацили, які виділяють з ґрунту, прісної та морської води, а також з рослин. Знайдено [11], що у представників роду Bacillus позаклітинні пептидази синтезуються в цитоплазмі як препроензими і перетворюються в зрілий ензим вже ззовні клітини завдяки автопроцесингу, обумовленому обмеженим протеолізом. Фібринолітичні пептидази включають дві великі групи: серинові та металопротеази. Найбільш вивченими серед мікробних продуцентів є фібринолітичний ензим - серапептаза (Е.С. 3.4.24.40), виділена з непатогенної кишкової бактерії Serratia sp. E-15, яка мешкає в кишковому тракті тутового шовкопряду. Серапептаза належить до позаклітинних металопротеаз, активний 2+ центр якої містить іон Zn [12]. Найбільш близьким до корисної моделі по технічній суті та результату, який досягається, є штам В. thuringiensis IMB В-7324, при глибинному культивуванні якого в певних умовах за 48 год. інкубування можна одержати комплексний ензимний препарат, фібринолітична активність якого складає 4,17 од/мг білка (субстрат - фібрин) [13]. Культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні особливості продуцента. Грампозитивна паличка, яка утворює спори еліпсоподібної форми, що розташовуються по центру, спорангій не роздутий. Факультативний анаероб, каталазо- та оксидазопозитивний. На МПА росте щільно, утворюючи колонії (6-10 мм) сірувато-білого кольору, округлої форми, матові, профіль колоній вигнутий, мають шорстку поверхню. Для культури характерний окиснювально-бродильний тип метаболізму. Гідролізує желатину і крохмаль, не гідролізує казеїн, не має лецитинази та фенілаланіндезамінази. Ферментація джерел вуглецю: При окисненні глюкози утворює кислоту та ацетоїн, не утворює газ, з L-арабінози, D-ксилози і D-маніту не утворює кислоту. Асиміляція джерел вуглецю: як джерела вуглецю та енергії бактерії використовують пептон, глюкозу, дріжджовий автолізат, ростуть на м'ясо-пептонному агарі, у м'ясо-пептонному бульйоні. Штам відновлює нітрати до нітритів, не продукує газ з нітритів. Фізіолого-біохімічні властивості Відношення до вуглецевого живлення: культура синтезує фібринолітичну пептидазу на середовищах, що містять мальтозу, глюкозу та дріжджовий екстракт. Відношення до азотного живлення: із органічних джерел азоту асимілює желатин, а з неорганічних - NH4Cl і (NH4)2SO4. Найбільшу фібринолітичну активність забезпечує желатина як єдине джерело азоту в середовищі. Штам зберігається на середовищах МПА під шаром стерильного вазелінового масла. Пересів 2 рази на рік. Жирно-кислотний аналіз та ідентифікацію штаму проведено за допомогою методу газової хроматографії та автоматичної системи ідентифікації мікроорганізмів MIDI Sherlock (MIDI, USA). Штам визначили як Bacillus thuringiensis var. israelensis з індексом схожості 0,442. Штам авірулентний, належить до 4-го класу за ступенем небезпеки мікроорганізмів: "малонебезпечні, практично без алергенної та загальнотоксичної дії". 1 UA 103136 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Відношення до кисню: факультативний анаероб. Відношення до температури: мезофіл, оптимальна температура для росту та біосинтезу ензиму 28-30 °C. Відношення до кислотності поживного середовища: культура росте при рН 7,2-7,8. Оптимальне вихідне значення рН середовища для синтезу ферменту становить 6,5, в процесі росту та ферментації спостерігається зростання рН до 8,2. Оптимальні параметри культивування штаму: температура 28 С, рН 7,5, 24 год. на напівсинтетичному середовищі такого складу (в г/л): КH 2РО4-1,6; MgSO4·7H2O-0,75; ZnSO4·7H2O-0,25; (NH4)2SO4-0,5; мальтоза - 1,0; желатин - 10,0; дріжджовий автолізат - 0,15. Біомасу відділяють центрифугуванням, фібринолітичну активність визначають у надосадовій рідині. Для визначення активності ензиму як субстрат використовують нативний високомолекулярний білок фібрин, який був отриманий з плазми крові людини [14] і наданий нам співробітниками станції переливання крові м. Києва. При вивченні фібринолітичної активності в дослідну пробірку додають 1 мг фібрину, 1,8 мл 0,01 М Трис-НСl буфера (рН 7,5) і 0,2 мл розчину досліджуваного препарату. Реакційну суміш інкубують на водяній бані при 37 °C протягом 30-45 хв. Реакцію зупиняють додаванням 2 мл 10 % розчину трихлороцтрової кислоти (ТХО). В контрольну пробірку ТХО додають одразу. Зразки витримують при кімнатній температурі 20 хв, центрифугують при 10000g протягом 5 хв. В супернатанті вимірюють утворення продуктів розщеплення фібрину на спектрофотометрі СФ-26 при 275 нм. За одиницю фібринолітичної активності беруть таку кількість ензиму, яка підвищує оптичну густину реакційної суміші на 0,01 за 1 хв [15]. При глибинному культивуванні В. thuringiensis var. israelensis максимальне значення питомої фібринолітичної активності (4,4 од/мг білка) супернатанту культуральної рідини досягається вже за 24 год. інкубування, що дозволяє отримувати фібринолітичну пептидазу вдвічі швидше, ніж з В. thuringiensis IMB В-7324, взятого як стандарт порівняння, при вирощуванні на тому ж поживному середовищі. Перевагою запропонованого продуцента є його здатність незалежно від сезону синтезувати високоактивну, термостабільну, нетоксичну фібринолітичну пептидазу. Ці її властивості є технологічно ефективними. Ензимний препарат, одержаний з цієї культури осадженням сульфатом амонію (90 % насичення), здатний ефективно діяти в діапазоні значень рН реакційного середовища від 5,0 до 11,0 з помітним піком активності при рН 10,0. Ензим стабільний при вказаних вище значеннях рН впродовж 24 годин. Ензимний препарат активний від 20 до 70 °C (оптимум при 50 °C). Термостабільність препарату при 25 °C повністю зберігається впродовж доби; при 50 °C активність знижується на 50 % через 120 хв витримування; при 40 °C - лише на 15 %. Препарат зберігає активність впродовж 1 року при 5-6 °C. Таким чином, отримано новий штам-продуцент фібринолітичної пептидази, який може знайти використання у медико-технологічних процесах. Джерела інформації: 1. Wang S., Xu X., Gao S., Zhu S., Rong R., Li B. Purification and partial characterization of a novel flbrinogenase from the venom of Deinagkistrodon acutus: inhibition of platelet aggregation // Protein Expr. Purif. - 2014. - Vol. 99. - P. 99-105. 2. Han Y.L., Li Z.W. Purification and biochemical character of a fibrinolytic protein from Eupolyphaga sinensis // Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. - 2006. - Vol. 22, № 4. - P. 639-643. 3. Sumi H., Nakajima N., Mihara H. Fibrinolysis relating substances in marine creatures // Соmр. Biochem. Physiol. B. - 1992. - Vol. 102, № 1. - P. 163-167. 4. Singh T.A., Devi K.R., Ahmed G., Jeyaram K. Microbial and endogenous origin of fibrinolytic activity in traditional fermented foods of Northeast India // Food Research International. - 2014. Vol. 55. - P. 356-362. 5. Mecikoglu M., Saygi В., Yildirim Y., Karadag-Saygi E., Ramadan S.S., Esemenli T. The effect of proteolytic enzyme serratiopeptidase in the treatment of experimental implant-related infection // J. Bone Joint Surg. Am. - 2006. -Vol. 88, № 6. - P. 1208-1214. 6. Deepak V., Kalishwaralal K., Ramkumarpandian S., Babu S.V., Senthilkumar S.R., Sangiliyandi G. Optimization of media composition for Nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface methodology // Bioresource Technol. - 2008. - Vol. 99, № 17. - P. 8170-8174. 7. Habib S.A., Abodoubara M.I., Abdel-Malak C.A., Badawy R.M. Optimization of fibrinase productivity from Actinomycetes // Egypt. J. Hosp. Med. - 2010. - Vol. 40. - P. 375-388. 2 UA 103136 U 5 10 15 20 8. Kwon J.Y., Chang A.K., Park J.E., Shin S.Y., Yoon S.M., Lee J.S. Vibrio extracellular protease with prothrombin activation and fibrinolytic activities // Int. J. Моl. Med. - 2007. - Vol. 19, № 1. - P. 157163. 9. Dubey R., Kumar J., Agrawala D., Char Т., Pusp P. Isolation, production, purification, assay and characterization of fibrinolytic enzymes (Nattokinase, Streptokinase and Urokinase) from bacterial sources // Afr. J. Biotechnol. - 2011. - Vol. 10, № 8. - P. 1408-1420. 10. Sugimoto S., Fujii Т., Morimiya Т., Johdo O., Nakamura T. The fibrinolytic activity of a novel protease derived from a tempeh producing fungus, Fusarium sp. BLB // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2007. - Vol. 71, № 9. - P. 2184-2189. 11. Серкина А.В. Структура и функции предшественников бактериальных протеиназ / А.В. Серкина, А.Б. Шевелев, Г.Г. Честухина // Биоорган, хим. - 2001. - Т. 27, № 5. - С. 323-346. 12. Snehal Anil, Mali Anil Kashinath. Production, characterization and optimization of potent protease (serratiopeptidase) from Serratia marcescens E15 // Int. Res J Pharm. App Sci. - 2013. - Vol. 3, № 4. - P. 95-98. 13. Нідялкова Н.А., Мацелюх О.В., Варбанець Л.Д. Оптимізація середовища для синтезу фібринолітичної пептидази Bacillus thuringiensis IMB В-7324 // Біотехнологія. - 2012. - Т. 5, № 4. С. 74-81. 14. Cohn E.J., Oncley J.L., Strong L.E. Chemical, clinical, and immunological studies on the products of human plasma frationation. I. The characterization of the protein fractions of human plasma // J. Clin. Invest. - 1944. - Vol. 23, № 4. - P. 417-432. 15. Masada M. Determination of the thrombolytic activity of Natto extract // Food style. - 2004. Vol. 8, № 1. - P. 92-95. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 Штам Bacillus thuringiensis var. israelensis - продуцент позаклітинної фібринолітичної пептидази, що зареєстрований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України під номером IMB В-7465. Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3