Спосіб моделювання порушень ендокринної функції тимуса при нейродегенеративних захворюваннях, зокрема паркінсонізмі

Реферат: Спосіб моделювання порушень ендокринної функції тимуса при нейродегенеративних захворюваннях, зокрема паркінсонізмі, включає введення тваринам моделюючого засобу, здатного впливати на зміни функціонального стану тимуса. Вводять одноразово, стереотаксичною ін'єкцією у лівий висхідний латеральний пучок переднього мозку, нейротоксин 6-ГОДА з наступною оцінкою вмісту гормону тимуса тимуліну у сироватці крові. При його вірогідному зменшенні порівняно із контрольною групою свідчать про гіпофункцію тимуса. UA 108025 U (12) UA 108025 U UA 108025 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до експериментальної медицини і може застосовуватись для моделювання порушень функціонального стану центрального органа імунної системи тимуса у тварин (щури, миші) з метою вивчення значення імунних факторів як для патогенезу, так і обґрунтування підходів до терапії нейродегенеративних захворювань центральної нервової системи (ЦНС), зокрема паркінсонізму. Хвороба Паркінсона (ХП) одне із найрозповсюдженіших прогресуючих нейродегенеративних захворювань, при якому масова загибель дофамінергічних нейронів компактної частини чорної субстанції середнього мозку призводить до дефіциту дофаміну у неостріатумі та розвитку характерних моторних порушень. В останній час спостерігається тенденція до зростання частоти ХП у всьому світі, в тому числі і Україні, а тому дослідження патогенетичних ланок ХП та їх можливого зв'язку із ефективністю терапії цього захворювання має велике значення. Загальновизнані механізми нейродегенерації при ХП/паркінсонізмі включають розвиток оксидативного стресу, нейрозапалення із активацією мікроглії, ушкодження шляхів деградації протеїнів та дисфункцію мітохондрій, тощо. Встановлено також важливість змін функціонального стану периферичної ланки імунної системи для патогенезу цього захворювання. Відомий спосіб моделювання в експерименті імунодепресивного стану шляхом вилучення у щурів тимуса [Патент № 92267U UA "Спосіб моделювання імунодефіцитного стану у білих лабораторних щурів в експерименті", Опубл. 11.08.2014, Бюл. № 15]. Даний спосіб полягає у тимектомії тварин, проте відсутність гормону тимуса в крові таких тварин не дає можливості оцінити значення ендокринної функції цього органа для динаміки розвитку патологічних станів, що моделюються у таких тварин. Відомий спосіб моделювання імунозалежних процесів при нейродегенеративних захворюваннях головного мозку [Патент UA № 36843U "Спосіб моделювання комбінованого судинно-імунного пошкодження мозку", Опубл. 10.11.2008, Бюл. № 21]. Спосіб полягає в сенсибілізації мозковим антигеном та послідуючою емболізацією ізольованими адипоцитами гілок сонної артерії в півкулі головного мозку експериментальних тварин з наступним дослідженням в динаміці (впродовж 30 діб) нейродегенеративних, компенсаторних і відновлювальних процесів цього органа з використанням гістологічних, біохімічних, імунологічних та інших методів. Проте даний спосіб є узагальненим і не конкретизує важливість виявлення порушень функціонування тимуса в механізмах реалізації імунозалежних процесів при нейродегенеративних захворюваннях. Відомий спосіб моделювання змін клітинного складу лімфоїдного компонента тимуса щурів при експериментальному алергічному енцефаломієліті, який є моделлю такого нейродегенеративного захворювання як розсіяний склероз. Спосіб полягає у введенні енцефалітогенної суміші (гомогенат спинного мозку разом з ад'ювантом Фрейнда) у подушечку задніх лап тварин із оцінкою співвідношення різних популяцій тимоцитів у різні терміни після індукції захворювання [Мельник Н.О. Клітинний склад часточок тимуса при демієлінізації та після лазерного опромінення / Н.О. Мельник // Медицина сьогодні і завтра. - 2005. - № 1. - С. 48]. Проте і даний спосіб застосовується для дослідження конкретних механізмів змін переважно лімфоїдного компонента тимуса, а тому не дозволяє у повній мірі виявити зміни секреторного компонента цього органа та їх зв'язок із перебігом розсіяного склерозу. Найближчим аналогом способу, що заявляється, є спосіб моделювання при нейродегенеративних захворюваннях змін структури тимуса і його Т-клітинного складу шляхом прийому тваринами впродовж одного тижня нейротоксину купризон [Thymic atrophy and + + apoptosis of CD4 CD8 thymocytes in the cuprizone model of multiple sclerosis / I. Solti [et al.] // PLOS one, June 8, 2015/DOI:10.1371/journal.pone.0129217. 18 p.]. Недоліками цього способу є: необхідність щоденного прийому нейротоксину (впродовж одного тижня) для реалізації його токсичного ефекту на тимус; неможливість досягнення морфофункціональних порушень секреторного компонента мозкової частини тимуса із визначенням вмісту в крові тимічного гормону тимуліну; короткостроковість дослідження динаміки змін функціонального стану тимуса, а отже недостатня інформативність отриманих результатів. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб моделювання порушень ендокринної функції тимуса при нейродегенеративних захворюваннях, зокрема паркінсонізмі, шляхом введення щурам нейротоксину-6-гідроксидофаміну (6-ГОДА), що дозволить інформативно відтворити модель для дослідження ролі імунних механізмів за участі тимуса у 1 UA 108025 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 патогенезі паркінсонізму, зокрема гіпофункції цього органа, з метою подальшого обґрунтування підходів до терапії цього захворювання та тестування медикаментозних препаратів. Поставлена задача вирішується тим, що у способі, який включає введення експериментальним тваринам моделюючого засобу, здатного впливати на зміни функціонального стану тимуса, згідно з корисною моделлю, щурам вводять одноразово, стереотаксичною ін'єкцією у лівий висхідний латеральний пучок переднього мозку нейротоксин 6-ГОДА, з наступною оцінкою вмісту гормону тимуса тимуліну у сироватці крові і при його вірогідному зменшенні порівняно із контрольною групою свідчать про гіпофункцію тимуса, зокрема при паркінсонізмі. 6-ГОДА ("Sigma", США) - це нейротоксин, який є важливим ендогенним патогенетичним фактором розвитку ХП/паркінсонізму, що селективно ушкоджує дофамінергічні нейрони чорної субстанції середнього мозку із їх апоптозом, спричинює розвиток ендогенного стресу, нейрозапалення. Дане рішення стало можливим завдяки дослідженню авторами механізмів впливу гормонів тимуса на імунну та нервову систему при нейродегенеративних захворюваннях, оскільки встановлено порушення імунних реакцій при ХП та значення активованих імунних клітин (Тлімфоцити, нейтрофіли, макрофаги) для ушкодження дофамінергічних нейронів головного мозку в результаті синтезу прозапальних цитокінів, хемокінів, вивільнення активних форм кисню та азоту. Диференціювання Т-лімфоцитів у тимусі, їх міграція на периферію і прояв функціональної активності знаходиться під впливом гормонів тимуса, зокрема високоактивного тимуліну. Тимулін також впливає на активність макрофагів при нейрозапаленні, пригнічує синтез прозапальних цитокінів (туморнекротичний фактор α, інтерлейкін 1β) і підвищує вміст протизапальних цитокінів (інтерлейкін 10). Спосіб здійснюється наступним чином. Інтактним тваринам (дорослі щури віком 3-4 міс.) одноразово, у лівий висхідний латеральний пучок переднього мозку, вводять стереотаксичною ін'єкцією 8,0 мкг 6-ГОДА, який попередньо розчинений у 4,0 мкл фізіологічного розчину, з додаванням 0,1 %-го розчину аскорбінової кислоти як стабілізатора, що гальмує окиснення 6-ГОДА. Доза препарату експериментально підібрана для моделювання пошкодження дофамінергічних нейронів. За 30 хв. до мікроін'єкції нейротоксину внутрішньоочеревинно вводять 40 мг/кг паргіліну ("Sigma", США), який пригнічує метаболічні перетворення 6-ГОДА моноамінооксидазою, і 25 мг/кг дезипраміну ("Sigma", США), що блокує захоплення нейротоксину норадренергічними клітинами. Усі вказані маніпуляції проводять під нембуталовим наркозом (50 мг/кг, внутрішньоочеревинно, "Sigma", США). Контрольній групі тварин (псевдооперовані щури) роблять усі вище вказані маніпуляції, але стереотаксично вводять 4,0 мкл 0,1 %-го розчину аскорбінової кислоти. Через тиждень після стереотаксичної ін'єкції нейротоксину 6-ГОДА у тварин проводять апоморфінів тест для визначення міри ушкодження дофамінергічних нейронів. З цією метою піддослідним щурам внутрішньоочеревинно вводять агоніст дофамінових рецепторів апоморфін (0,5 мг/кг, "Sigma", США) і оцінюють ротаційні рухи (об/хв.) у бік, контралатеральний стороні уведення нейротоксину. Інтенсивність таких рухів слугує індикатором ступеня однобічної дегенерації нігростріатної дофамінергічної системи. За нашими попередніми морфологічними дослідженнями, відсутність рухової асиметрії в апоморфіновому тесті (0 об/хв.) відповідає ушкодженню в середньому близько 44 % дофамінергічних нейронів, а наявність інтенсивних циркуляторних рухів у цьому тесті (більше шести об/хв) свідчить про ушкодження близько 97 % дофамінергічних клітин. Тварини знаходились у стандартних умовах віварію при природному режимі освітлення. Наприкінці експерименту (не раніше 45 діб після операції) у всіх тварин беруть кров під ефірним наркозом для отримання сироватки, яку зберігають при -20 °C до дослідження. Вміст тимуліну у сироватці визначають за методом Bach J.F. [Demonstration of a circulation thymic hormone in mouse and in man / Bach J.F., Dardenne M., Bach M.A. // Transplant. Proc. - 1973. - 1, № 1. - P. 99104]. Якщо у піддослідних щурів із відсутністю рухової асиметрії в апоморфіновому тесті вміст тимуліну зменшується в 1,5-2 рази відносно псевдооперованих тварин, то у щурів із наявністю рухової асиметрії в апоморфіновому тесті значення показника стають менше уже в 8 разів (р