Спосіб одержання екзополісахариду

Реферат: Винахід належить до способу одержання екзополісахариду, який включає культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 на поживному середовищі, що містить джерело вуглецевого живлення, мінеральні солі і ростові фактори, де як джерело пантотенату використовують полівітамінний препарат "Комплевіт" з масовою часткою пантотенату 0,00085-0,00095 %. UA 108323 C2 (12) UA 108323 C2 UA 108323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнології, а саме до способу одержання мікробних екзополісахаридів (ЕПС), які можуть використовуватись у нафтовидобувній, хімічній, парфумерній, харчовій та ін. промисловості, сільському господарстві, медицині. Відомі способи одержання екзополісахаридів, продуцентами яких є Xanthomonas campestris 8162 [А.с. № 595379, СРСР, Опубл. 28.02.78, Бюл. № 8], Xanthomonas campestris NRLL В-12075 та NRLL В-12074 [патент № 4400467, США, опубл. 23.08.83], Xanthomonas campestris ATCC 31601 [патент № 4418145, США, опубл. 29.11.83]. Однак штами Xanthomonas campestris є фітопатогенними, деякі з них генетично нестабільні, оскільки дисоціюють на мукоїдні і немукоїдні форми, що спричиняє нестабільність якості синтезованих полісахаридів. Вказані негативні особливості штамів-продуцентів завдають шкоди довкіллю, а також обмежують використання препаратів. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ЕПС [патент України на винахід № 97910, С12Р 19/04. Спосіб одержання екзополісахариду / Пирог Т.П., Савчук О.М. Опубл. 26.03.2012, Бюл. № 6], який передбачає культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 на поживному середовищі, що містить суміш ацетату натрію і меляси, мінеральні солі і ростові фактори, причому у процесі культивування штаму IMB В-7005 здійснюють періодичну (кожні 18-20 год.) нейтралізацію культуральної рідини розчинами водорозчинних органічних кислот (оцтової, лимонної, бурштинової, щавлевої). Недоліком цього способу є недостатньо висока кінематична в'язкість водних розчинів ЕПС. В основу винаходу поставлено задачу створення нового способу одержання екзополісахариду, який покращує його реологічні властивості і підвищує показники синтезу. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання екзополісахариду включає культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 на поживному середовищі, що містить джерело вуглецевого живлення, мінеральні солі і ростові фактори. Згідно з винаходом як джерело пантотенату використовують полівітамінний препарат «Комплевіт» з масовою часткою пантотенату 0,00085-0,00095 %. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Використання як джерела пантотенату полівітамінного препарату «Комплевіт» з масовою часткою пантотенату 0,00085-0,00095 % дає змогу збільшити кінематичну в'язкість 0,05 % водних розчинів ЕПС у 2,8-2,9 разу. Спосіб здійснюється таким чином. Acinetobacter sp. IMB В-7005 вирощують на середовищі такого складу (г/л) : KН2РО4 - 6,8; KОН - 0,9; NH4NO3 - 0,4; MgSO4×7H2O - 0,4; СаСl2×2Н2О - 0,1; FeSO4×7Н2О - 0,001. У середовище додатково вносять 0,5 % (об'ємна частка) дріжджового автолізату та полівітамінний препарат «Комплевіт» з масовою часткою пантотенату 0,0009 %. Як джерело вуглецю та енергії використовують етанол (1,0 %, об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (24 год.), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить етанол (0,5 %, об'ємна частка) як джерело вуглецевого живлення. Кількість посівного матеріалу становить 10 %. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (220 об./хв) при 30 °С упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу збільшити кінематичну в'язкість 0,05 % водних розчинів ЕПС у 2,8-2,9 разу. Приклад 1. Синтез ЕПС Acinetobacter sp. IMB В-7005 залежно від джерела пантотенату у середовищі Acinetobacter sp. IMB В-7005 вирощують на середовищі такого складу (г/л) : KН 2РО4 - 6,8; KОН - 0,9; NH4NO3 - 0,4; MgSO4×7H2O - 0,4; СаСl2×2Н2О - 0,1; FeSO4×7Н2О - 0,001. У середовище додатково вносять 0,5 % (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006 % (масова частка) пантотенату кальцію і полівітамінний препарат «Комплевіт» з масовою часткою пантотенату 0,0006 %. Як джерело вуглецю та енергії використовують етанол і соняшникову олію (1 %, об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (24 год.), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить соняшникову олію і етанол (0,5 %, об'ємна частка) як джерело вуглецевого живлення. Кількість посівного матеріалу становить 10 %. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (220 об./хв) при 30 °С упродовж 120 год. Концентрацію біомаси визначають за оптичною густиною клітинної суспензії з наступним перерахунком на абсолютно суху біомасу клітин (АСБ) у відповідності з калібрувальним графіком. Ефективність трансформації вуглецю субстратів в ЕПС оцінюють за такими показниками: кількість синтезованих ЕПС і ЕПС-синтезувальна здатність. Кількість синтезованого екзополісахариду встановлюють ваговим методом: ЕПС осаджують з культуральної рідини ізопропанолом, осад промивають у чистому ізопропанолі і висушують при 1 UA 108323 C2 кімнатній температурі упродовж доби. ЕПС-синтезувальну здатність розраховують як відношення кількості синтезованого ЕПС до біомаси та виражають у г ЕПС/ г АСБ. Як видно з наведених у табл. 1 даних, у разі використання полівітамінного препарату «Комплевіт» показники синтезу є вищими, ніж за використання пантотенату кальцію. 5 Таблиця 1 Вплив різних джерел пантотенату на синтез ЕПС Acinetobacter sp. IMB В-7005 Джерело вуглецю у середовищі Етанол Соняшникова олія ЕПС (г/л), % від контролю 125±6 115±5 ЕПС-синтезувальна здатність (г ЕПС/г АСБ), % від контролю 135±7 110±5 Примітка. Контроль (100 %) - показники синтезу ЕПС на середовищі з пантотенатом кальцію 10 15 20 Приклад 2. Синтез ЕПС Acinetobacter sp. IMB В-7005 на середовищі етанолом залежно від концентрації пантотенату у складі «Комплевіту» Культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 здійснюють як описано у прикладі 1. У середовище додатково вносять 0,5 % (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,00060,00105 % (масова частка) пантотенату у вигляді пантотенату кальцію і полівітамінного препарату «Комплевіт». Як джерело вуглецю та енергії використовують етанол (1 %, об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (24 год.), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить етанол (0,5 %, об'ємна частка) як джерело вуглецевого живлення. Показники синтезу ЕПС визначають як описано у прикладі 1. Як видно з наведених у табл. 2 даних, у разі внесення у середовище з етанолом 0,000850,00095 % пантотенату у вигляді «Комплевіту» показники синтезу ЕПС є найвищими. Приклад 3. Реологічні властивості розчинів ЕПС Acinetobacter sp. IMB В-7005 залежно від умов культивування Таблиця 2 Синтез ЕПС Acinetobacter sp. IMB В-7005 залежно від концентрації пантотенату у складі «Комплевіту» Концентрація пантотенату, % (масова частка) 0,0006 0,00075 0,00085 0,0009 0,00095 0,00105 ЕПС (г/л), % від контролю 125±6 135±7 150±8 160±8 155±8 140±7 ЕПС-синтезувальна здатність (г ЕПС/г АСБ), % від контролю 135±7 140±7 155±8 155±8 155±8 135±7 Примітка. Контроль (100 %) - показники синтезу ЕПС на середовищі з пантотенатом кальцію. 25 30 35 Культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 здійснюють на середовищі, склад якого наведено у прикладі 1. У середовище додатково вносять 0,5 % (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006-0,00105 % (масова частка) пантотенату у вигляді полівітамінного препарату «Комплевіт». Як джерело вуглецю та енергії використовують етанол (1,0 %, об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (24 год.), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить етанол (0,5 %, об'ємна частка) як джерело вуглецевого живлення. Кількість посівного матеріалу становить 10 %. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (220 об./хв) при 30 °С упродовж 120 год. Acinetobacter sp. IMB В-7005 вирощують також на середовищі такого складу (г/л) : KН 2РО4 2,0; MgSO4×7Н2О - 0,4; СаСl2×2Н2О - 0,1; FeSO4×7Н2О - 0,001. У середовище додатково вносять 0,5 % (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006 % (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш ацетату натрію (1,1 %, масова 2 UA 108323 C2 5 10 частка) і меляси (1,5 %, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (16-18 год.), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить суміш ацетату натрію (0,25 %, масова частка) і меляси (0,25 %, масова частка) як джерело вуглецевого живлення. Кількість посівного матеріалу становить 10 %. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (220 об./хв) при 30 °С упродовж 80 год. Кожні 18-20 год. здійснюють підкислення культуральної рідини до рН 7,0-7,2 6 %-ним розчином бурштинової, 8 %-ним розчином щавлевої, 20 %-ним розчином лимонної та 9 %-ним розчином оцтової кислот. ЕПС осаджують з культуральної рідини ізопропанолом, осад промивають у чистому ізопропанолі і висушують при кімнатній температурі упродовж доби. Кінематичну в'язкість 0,05 %-них розчинів ЕПС вимірюють на скляному віскозиметрі Оствальда ВПЖ-4 при температурі 20 °С. Таблиця 3 Реологічні властивості ЕПС, синтезованих за різних умов культивування Acinetobacter sp. IMB В7005 Умови культивування Згідно з прототипом Згідно запропонованим способом 15 Концентрація пантотенату, % (масова частка) 0,0006 0,0006 0,00075 0,00085 0,0009 0,00095 0,00105 Джерело пантотенату Пантотенат кальцію з Комплевіт В'язкість 0,05 % розчину 2 ЕПС, мм /с 2,3±0,12 5,6±0,13 5,3±0,12 6,5±0,32 6,7±0,34 6,6±0,33 5,6±0,13 Як свідчать дані, наведені у табл. 3, використання як джерела пантотенату полівітамінного препарату «Комплевіт» з масовою часткою пантотенату 0,00085-0,00095 % дає змогу збільшити кінематичну в'язкість 0,05 % водних розчинів ЕПС у 2,8-2,9 разу порівняно з прототипом. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 20 Спосіб одержання екзополісахариду, що включає культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 на поживному середовищі, що містить джерело вуглецевого живлення, мінеральні солі і ростові фактори, який відрізняється тим, що як джерело пантотенату використовують полівітамінний препарат "Комплевіт" з масовою часткою пантотенату 0,00085-0,00095 %. 25 Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3