Спосіб одержання екзополісахариду

Спосіб одержання екзополісахариду, який включає культивування Acinetobacter sp. ІMB В 3 65949 го складу (г/л) : КН2РО4 - 1,8; MgSO4×7Н2О - 0,4; СаСl2×2Н2О - 0,1; FeSO4×7Н2О - 0,001. У середовище додатково вносять 0,5 % (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006 % (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш фумарату натрію (1,8 %, масова частка) і меляси (1,0 %, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (16-18 год), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить 0,5 % (масова частка) глюкози як джерело вуглецевого живлення. Кількість посівного матеріалу становить 10 %. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (220 об/хв.) при 30 °С, рН 6,8-7,0 упродовж 90 год. Використання нового способу дає підвищити концентрацію синтезованого ЕПС і ЕПСсинтезувальну здатність Acinetobacter sp. ІMB В7005 в 1,2 разу. Приклад 1. Синтез екзополісахариду за умов росту Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на суміші фумарату натрію і меляси Культивування бактерій здійснюють в колбах на качалці (300 об/хв.. при 30 °С упродовж 90 год. на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): КН2РО4 - 1,8; NH4Cl - 0,4; MgSO4×7H2O 0,4; СаСl2×2Н2О - 0,1; FeSO4×7Н2О - 0,001. У середовище додатково вносять 0,5 % (об'ємна частка) дріжджового автолізату, 0,0006 % (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш фумарату натрію (1,8 %, масова частка) і 4 меляси (1,0 %, масова частка), а також суміш фумарату натрію і глюкози (1,8 % та 0,5 % відповідно). Фумарат натрію вносять у середовище у вигляді 10 %-ного розчину. Початкове рН середовища становить 7,0 (перед внесенням посівного матеріалу середовище підлужнюють 10 %-ним розчином калій гідроксиду). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (16-18 год.), вирощену на середовищі наведеного вище складу, яке як джерело вуглецю та енергії містить фумарат натрію (0,5 %). Концентрація інокуляту становить 10 %. Концентрацію біомаси визначають за оптичною густиною клітинної суспензії з наступним перерахунком на абсолютно суху біомасу клітин (АСБ) у відповідності з калібрувальним графіком. Ефективність трансформації вуглецю субстратів в ЕПС оцінюють за наступними показниками: кількість синтезованих ЕПС, ЕПС-синтезувальна здатність. Кількість синтезованого екзополісахариду встановлюють ваговим методом. ЕПСсинтезувальну здатність розраховують як відношення кількості синтезованого ЕПС до біомаси та виражають у г ЕПС/г АСБ. Як видно з наведених у табл. 1 даних, заміна глюкози на мелясу у середовищі 1 супроводжується незначним (на 8-9 %) підвищенням кількості синтезованого ЕПС, проте у цьому разі спостерігається суттєве зростання рівня біомаси, що призводить до зниження ЕПС-синтезувальної здатності майже у три рази (з 18,6 до 6,6г ЕПС/г біомаси). Таблиця 1 Синтез ЕПС за умов росту Acinetobacter sp. IMB В-7005 на суміші фумарату і С6-сполук Субстрат Фумарат+глюкоза (найближчий аналог) Фумарат+меляса ЕПС, г/л ЕПС-синтезувальна здатність, г ЕПС/г біомаси 9,8±0,45 18,6±0,80 10,8±0,50 6,6±0,32 Це явище може бути зумовлене наявністю у середовищі як мінерального джерела азоту (у вигляді NH4Cl), так і азоту, що входить до складу меляси. Відомо, що меляса містить до 1,8 % азоту, третя частина якого перебуває у формі бетаїну, що практично не засвоюється мікроорганізмами. Отже, концентрація доступного для бактерій азоту меляси становить близько 0,8-1,2 %. Враховуючи концентрацію меляси у середовищі культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 (0,5 % за вуглеводами), вміст «мелясного» азоту (за елементом N) в середовищі становить 0,1 г/л. Така сама кількість азоту міститься в 0,4 г/л NH4Cl. Отже, рівень біомаси за умов росту продуцента ЕПС на середовищі з фумаратом і мелясою повинен бути удвічі вищим, ніж на аналогічному середовищі з фумаратом і глюкозою. Таким чином, для підвищення ефективності синтезу ЕПС у разі використання як субстрату суміші фумарату і меляси культивування Acinetobac ter sp. ІMB В-7005 слід здійснювати на середовищі, яке не містить мінерального джерела азотного живлення. Приклад 2. Вплив джерела мінерального азоту на синтез ЕПС за умов росту Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на середовищі з фумаратом і мелясою. Культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 здійснюють на середовищах такого складу (г/л): середовище 1: КН2РО4 - 1,8; NH4CI - 0,4; MgSO4×7H2O - 0,4; СаСl2×2Н2О - 0,1; FeSO4×7Н2О - 0,001; середовище 2: КН2РО4 - 1,8; MgSO4×7H2O - 0,4; СаСl2×2Н2О - 0,1; FeSO4×7Н2О - 0,001. У середовища додатково вносять 0,5% (об'ємна частка) дріжджового автолізату, 0,0006 % (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш фумарату натрію (1,8 %, масова частка) і меляси (1,0 %, масова частка). Початкове рН середовища становить 7,0 (перед внесенням посів 5 65949 ного матеріалу середовище підлужнюють 10 %ним розчином калій гідроксиду). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (16-18 год.), вирощену на середовищах 1 і 2, які як джерело вуглецю та енергії містять фумарат натрію (0,5 %). Концентрація інокуляту становить 10 %. Культивування бактерій здійснюють в колбах на качалці (300 об/хв.) при 30 °С упродовж 90 год. Показники синтезу ЕПС визначають як описано у прикладі 1. Дані, наведені у табл. 2, засвідчують, що виключення джерела мінерального азоту з середовища для одержання посівного матеріалу і культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 супроводжується підвищенням ЕПСсинтезувальної здатності у 2 рази порівняно з ви 6 користанням середовища 1 (з 6,6 до 13,3 г ЕПС/г біомаси відповідно). Приклад 3. Вплив якості посівного матеріалу на синтез ЕПС за умов росту Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на суміші фумарату натрію і меляси. Культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 здійснюють на середовищі 2 (див. приклад 2) з фумаратом натрію (1,8 %, масова частка) і мелясою (1,0 %, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (16-18 год.), вирощену на середовищі 2, яке як джерело вуглецю та енергії містить глюкозу (0,5 %), мелясу (1,0 %), фумарат натрію (0,7 %) та суміш фумарату і меляси (0,56 і 0,126 % відповідно). Концентрація інокуляту становить 10 %. Культивування бактерій здійснюють в колбах на качалці (300 об/хв.) при 30 °С упродовж 90 год. Таблиця 2 Синтез ЕПС за умов росту Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на безазотному середовищі з фумаратом натрію і мелясою Середовище для одержання інокуляту 1 (з NH4Cl) 2 (без NH4Cl) Середовище для біосинтезу 1(з NH4Cl) 2 (без NH4Cl) 2 (без NH4Cl) Показники синтезу ЕПС визначають як описано у прикладі 1. Дані, наведені у табл. 3, засвідчують, що найвищі показники синтезу ЕПС на суміші фумарату і меляси спостерігаються у разі використання посівного матеріалу, вирощеного на моносубстраті глюкозі. Отже, використання як джерела вуглецю суміші фумарату натрію (1,8 %) і меляси (1,0 %) і ЕПС, г/л 10,8±0,50 11,0±0,45 11,0±0,45 ЕПС-синтезувальна здатність, г ЕПС/г біомаси 6,6±0,32 9,8±0,49 13,3±0,65 посівного матеріалу, вирощеного на глюкозі, а також виключення мінерального джерела азотного живлення зі складу середовища дає змогу підвищити концентрацію синтезованого ЕПС і ЕПСсинтезувальну здатність в 1,2 разу порівняно з культивуванням Acinetobacter sp. IMB В-7005 на суміші фумарату і глюкози. Таблиця 3 Залежність синтезу етаполану на суміші фумарату і меляси від способу підготовки посівного матеріалу Джерело вуглецю у середовищі одержання інокуляту Глюкоза Меляса Фумарат Фумарат+меляса Комп’ютерна верстка Д. Шеверун ЕПС, г/л 11,8±0,55 10,6±0,53 11,0±0,45 10,9±0,45 Підписне ЕПС-синтезувальна здатність, г ЕПС/г біомаси 22,3±1,4 10,3±0,46 13,3±0,65 11,5±0,57 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601