Спосіб вибору тактики лікування гострого вірусного гепатиту с

Реферат: Винахід належить до способу вибору тактики лікування гострого гепатиту С (ГГС), що включає прогнозування розвитку гепатиту шляхом аналізу комбінації поліморфізмів генів цитокінів, причому визначають RNA-HCV у сироватці крові, поліморфізм гена IL-28В по алелях rs 12979860 та rs 8099917, та при наявності генетичних асоціацій СС/ТТ початок антивірусної UA 109238 C2 (12) UA 109238 C2 терапії починають з 20 тижня з моменту дебюту захворювання, а у випадку наявності генетичних асоціацій CT/TG або TT/GG лікування починають після 12 тижня з моменту дебюту захворювання. UA 109238 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузі медицини і може бути використаним як лікувальнопрофілактичний захід, спрямований на лікування інфекційного ураження печінки у вигляді гепатиту С. Гепатит С є головною формою захворювань печінки з неухильно прогресуючим перебігом і характеризується значною міжіндивідуальною варіабельною клінічною картиною і результатами (Collier J.D., Woodall Т., et al., 2005). Головною причиною морбідності і смертності хворих на хронічний гепатит С (ХГС) є цироз печінки (ЦП), швидкість формування якого залежно від індивідуальної варіабельності варіює від декількох років до декількох десятків років (Hoofnagle J.H., 2002). Останніми роками особлива увага приділяється вивченню генетичних чинників ризику прогресування гепатиту. У ряді досліджень, присвячених визначенню клінічного і прогностичного значення носійства алельних варіантів гена HFE, встановлений взаємозв'язок між наявністю мутації в цьому гені і прогресуючим перебігом гепатиту (Smith B.C., Gorve J., et al., 1998). Вивчався також взаємозв'язок алельних варіантів генів цитокінів з розвитком фіброзу при гепатиті. Powell E.E. et al. (2000) Gewaltig J. et al. (2002) і Wang H. et al. (2005) встановили наявність такого зв'язку між успадкованим поліморфізмом (915) GC в гені TGF-bl і прогресуючим перебігом гепатиту. Показано також, що на природний перебіг захворювання може впливати (511) СТ поліморфізм в гені IL-1b (Bahr M.J. et al., 2003). Проте дослідження, присвячені вивченню асоціації одного поліморфізму з особливостями перебігу гепатиту, мають ряд недоліків. З одного боку, результати відомих робіт нерідко суперечать один одному, а з іншої - не надають надійних критеріїв розподілу хворих з високим і низьким ризиком розвитку цирозу печінки. Усунення цих недоліків можливе при дослідженні комбінації алельних варіантів декількох генів, оскільки при цьому відбувається підсумовування чинників ризику, а отже, підвищується достовірність результатів прогнозу. Найбільш успішною спробою застосування цього, найближчого до пропонованого, підходу для оцінки стану захворювання та швидкості розвитку цирозу при гепатиті є спосіб прогнозування прогресуючого перебігу гепатиту С (див. RU2317335, МПК C12Q 1/68, C12N 15/24 дата публікації: 20.02.2008) шляхом аналізу комбінації поліморфізмів генів цитокінів, що включає: дослідження зразка геномної ДНК хворого гепатитом, аналіз ДНК на наявність поліморфізмів генів цитокінів (-511) СТ IL-lb, (-174) GC IL-6 и (+915) GC TGF-bl, а висновок щодо прогнозу здійснюють на підставі визначених розробником табличних емпіричних даних. Недоліком способу є його обмеженість в зв'язку з тим, що спосіб спрямовано лише на прогноз перебігу захворювання без вибору параметрів тактики лікування в залежності від індивідуальної варіабельної клінічної картини. Задачею розробки є створення способу вибору тактики лікування гострого вірусного гепатиту С, в якому за рахунок дослідження нової сукупності показників, застосування нових параметрів граничних значень тактики лікування забезпечується індивідуалізація лікування пацієнта, в залежності від індивідуальної варіабельної клінічної картини, що зменшує ризик виникнення побічних ефектів та забезпечує підвищення ефективності лікування гострого вірусного гепатиту С. Для вирішення цієї задачі спосіб вибору тактики лікування гострого гепатиту С (ГГС) включає прогнозування розвитку гепатиту шляхом аналізу комбінації поліморфізмів генів цитокінів. Новим у способі є те, що визначають RNA-HCV у сироватці крові, визначають поліморфізм гена IL-28В по алелях rs 12979860 та rs 8099917, та при наявності генетичних асоціацій СС/ТТ початок антивірусної терапії починають з 20 тижня з моменту дебюту захворювання, а у випадку наявності генетичних асоціацій CT/TG або TT/GG, лікування починають після 12 тижня з моменту дебюту захворювання. Внаслідок дослідження в способі нової сукупності показників, застосування нових параметрів граничних значень тактики лікування, забезпечується індивідуалізація лікування пацієнта, в залежності від індивідуальної варіабельної клінічної картини, що зменшує ризик виникнення побічних ефектів та забезпечує підвищення ефективності лікування гострого вірусного гепатиту С. Спосіб, що заявляється, ілюструється прикладами його застосування. При здійсненні прикладів застосування способу, діагноз гепатиту С і цирозу печінки встановлювався на підставі даних анамнезу, клінічного обстеження, результатів лабораторних методів діагностики, включаючи серологічне та вірусологічне дослідження (позитивні тести на антитіла до вірусу гепатиту С і RNA HCV) та морфологічного дослідження печінки. Виділення геномної ДНК із зразка крові проводили за допомогою модифікованого методу з протеїназою К і екстракцією фенол-хлороформом. Для цього в 1,5 мл пробірку (Eppendorf) 1 UA 109238 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вносили 700 мкл аналізованого зразка крові і 700 мкл ТЕ-буфера (10 мМ Трис- НСl, рН 8,0, 1 мМ ЕДТА) для гемолізу еритроцитів. Процедуру повторювали 2 рази, а потім до клітинного осаду додавали 400 мкл буфера для протеїнази К, що містить 200 мкг/мл протеїнази К, після чого інкубували 4 години при 60°3 на термошейкері з постійним перемішуванням (850 про/хв). Далі проводили фенол-хлороформну екстракцію ДНК з подальшим осадженням 96 % етанолом і центрифугуванням впродовж 10 хв. при 10000 об/хв. Після серії промивань ДНК елюювали ТІ буфером (200 мкл). Концентрація виділеної ДНК складала від 30 до 50 нг/мкл. Для визначення поліморфізмів в досліджуваних генах застосовувався метод ПДРФ (поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів). ПЛР проводили в термоциклері Master Cycler (Eppendorf). При цьому використали пробу наступного складу: 100 мМ Tris - НСl, рН 8,3 (25 °C), 50 мМ KСl, MgCl2 (концентрація підбиралася індивідуально для кожної пари праймерів), чотири дезоксинуклеозидтрифосфати (по 200 мкМ кожного), Taq-полімераза (0,5 ед./реакцію) і 1-2 мкг геномної ДНК і праймери (4-8 пмоль/реакцію). Кінцевий об'єм реакційної суміші складав 25 мкл. При постановці ПЛР використовувався прийом "гарячого старту" (Hebert В., Bergeron J., Potworowski E.F., Tijssen P., 1993). Приклад 1 Хвора О. 48 p., була прийнята в клініку вірусних гепатитів зі скаргами на слабкість, зниження працездатності, періодично підвищення температури до субфебрильних цифр, артралгії, тяжкість в правому підребер'ї, сухість та гіркоту в роті. За 5 місяців до початку захворювання холецистектомія лапароскопічним методом. Діагноз гострого гепатиту С поставлений на основі епіданамнезу, вищенаведених скарг та даних клініко-лабораторного обстеження: збільшення розмірів печінки до 3 см нижче краю ребрової дуги, селезінки до 1 см по СКЛ, підвищення активності амінотрансфераз до 5 норм, наявність Ab-HCV IgM у сироватці крові та RNA-HCV (ПЛР). Був визначений варіант поліморфізму гену IL-28B - генетичних асоціацій CT/T/G по алелях rs 12979860 і rs 8099917, відповідно, лікування було розпочато після 12 тижнів з моменту дебюту захворювання при дослідженні RNA-HCV 1 раз в місяць. RNA-HCV у сироватці крові визначалась протягом всього періоду спостереження за хворою, була підвищена активність АлАТ, Ac AT до 3-х норм. Згідно нашим дослідженням, через 12 тижнів була розпочата комбінована противірусна терапія Пег-ІФ та рибавірином, яку пацієнтка отримувала протягом 24 тижнів. Вже через 4 тижні після початку терапії активність амінотрансфераз (АлАТ, АсАТ) прийшла до норми, RNA-HCV не визначалась в якісному тесті ПЛР, тобто була отримана швидка вірусологічна відповідь на призначений курс терапії. В процесі лікування спостерігались гематологічні побічні дії препаратів (анемія, лейкопенія, тромбоцитопенія), які піддавались корекції. Після закінчення 24-тижневого курсу терапії, RNA-HCV не визначалась у сироватці крові якісним методом ПЛР, активність амінотрансфераз була в межах нормальних величин. Після спостереження за пацієнткою протягом 24 тижнів отримана стійка вірусологічна відповідь (СВВ) (RNA-HCV у сироватці крові не визначалась), тобто зафіксований ефект одужання від ГГС. Приклад 2 Хворий В., 32 p., звернувся на консультацію в клініку вірусних гепатитів у зв'язку з підвищеним рівнем АлАТ, АсАТ у сироватці крові до 7-8 норм та загальною слабкістю. За даними епідеміологічного анамнезу протягом останнього року проходив лікування у стоматолога. При детальному огляді та обстеженні пацієнта, було зафіксовано збільшення розмірів печінки до 2 см нижче краю ребрової дуги, в аналізі крові підвищення активності АлАТ до 330 Од/л, АсАТ до 284 Од/л, наявність Аb-HCV IgM та RNA-HCV (ПЛР) у сироватці крові. Був діагностований гострий гепатит С. При обстеженні на поліморфізм гену IL-28B, визначений варіант генетичних асоціацій СС/ТТ (по алелях rs 12979860 та rs 8099917, відповідно). Згідно з вищенаведеними даними, антивірусну терапію було розпочато з 20 тижня з моменту дебюту захворювання при періодичному дослідженні RNA-HCV 1 раз в місяць. Негативація RNA-HCV наступила після 20 тижня спостереження за хворим та триває по цей час. Таким чином, у пацієнта наступив спонтанний кліренс на 5-му місяці перебігу гострої HCV-інфекції, що дало можливість не застосовувати йому комбіновану противірусну терапію. Приклад 3 Хвора Т., 42 p., поступила в клінічний відділ інституту зі скаргами на загальну слабкість, зниження працездатності. Хворіє протягом 3-х років, коли вперше були виявлені Ab-HCV та RNA-HCV у сироватці крові. Збереглася виписка з історії хвороби, в якій зазначено, що хвора в 2011 році перенесла гострий гепатит С (мало місце підвищення активності АлАТ до 860 Од/л та АсАТ до 740 Од/л, білірубіну загального до 134 мкмоль/л, прямого до 103 мкмоль/л, наявність Ab-HCV IgM та RNA-HCV у сироватці крові). В анамнезі були гінекологічні втручання. Пацієнтка в той час не була обстежена на поліморфізм гену IL-28B та не лікувалась комбінованою 2 UA 109238 C2 5 10 противірусною терапією; за нею проводився нагляд лікарем-інфекціоністом ЦРЛ та періодично отримувала вона симптоматичну і патогенетичну терапію. При зверненні хворої в інститут та подальшому її обстеженні, був діагностований хронічний гепатит С, визначено RNA-HCV у сироватці крові, фаза реплікації - 4,6*10*5 IU/ml, 1-в генотип з помірною біохімічною та вірусологічною активністю, F2,A2. Хронічний холецистопанкреатит. При обстеженні на поліморфізм гена IL-28B (rs 12979860 та rs 8099917), визначений варіант генетичної асоціації TT/GG, відповідно. Лікування було розпочато після 12 тижня з моменту дебюту захворювання. Хворій була призначена комбінована противірусна терапія ПегІФ та рибавірином, яку вона отримувала протягом 48 тижнів. Швидка вірусологічна відповідь не наступила після 4 тижня терапії, але була зафіксована рання вірусологічна відповідь (після 12 тижня лікування). Хвора успішно закінчила повний курс ПВТ з негативацією RNA-HCV у сироватці крові та продовжує спостерігатись в поліклінічному відділі інституту до отримання стійкої вірусологічної відповіді. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 15 20 Спосіб вибору тактики лікування гострого вірусного гепатиту С, що включає прогнозування розвитку гепатиту шляхом аналізу комбінації поліморфізмів генів цитокінів, який відрізняється тим, що визначають RNA-HCV у сироватці крові, визначають поліморфізм гена IL-28В по алелях rs 12979860 та rs 8099917, та при наявності генетичних асоціацій СС/ТТ початок антивірусної терапії починають з 20 тижня з моменту дебюту захворювання, а у випадку наявності генетичних асоціацій CT/TG або TT/GG лікування починають після 12 тижня з моменту дебюту захворювання. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3