Спосіб одержання лікарського засобу з гіпоглікемічною та гіполіпідемічною дією з листя брусниці звичайної

Реферат: Винахід належить до способу одержання засобу з гіпоглікемічною та гіполіпідемічною дією, що включає екстракцію рослинної сировини, фільтрацію, упарювання, очищення та сушіння. Як рослинну сировину використовують листя брусниці звичайної, екстракцію проводять трикратно 40-60 % розчином спирту етилового у співвідношенні сировини і екстрагенту 1:6-1:10, очищення проводять шляхом відстоювання та відокремлення надосадової рідини, яку піддають UA 111133 C2 (12) UA 111133 C2 стерилізації, та додають в процесі сушіння аргінін у 2-4-кратній еквімолярній кількості відносно загальної суми фенольних сполук. UA 111133 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до фармації та медицини, а саме до способів одержання біологічно активних речовин з природної сировини, зокрема до способів одержання лікарських засобів гіпоглікемічної та гіполіпідемічної дії з листя брусниці звичайної з додаванням аргініну, що впливають на вміст глюкози, продуктів обміну ліпідів у крові при лікуванні захворювань, пов'язаних з порушенням обмінних процесів, таких як цукровий діабет. Відомий спосіб одержання лікувально-профілактичного гіпоглікемічного засобу з листя кизилу, прийнятий за прототип [1], полягає у послідовній екстракції 50 % етанолом, а потім водою очищеною листя кизилу, подрібненого до розміру часток 1,0-2,0 мм, з додатковим очищення водної витяжки і подальшим об'єднанням екстрактів і упарюванням досуха. Одержаний спиртово-водний екстракт являє собою сухий порошок світло-коричневого кольору зі слабким специфічним запахом. Недоліками цього способу є використання нефармакопейної, нестандартизованої сировини. Оскільки засіб не стерилізують, то при зберіганні та використанні можуть виникати проблеми з мікробною забрудненістю лікарського засобу. При одержанні екстракту використовують два розчинники - етанол та воду, які мають різну полярність, тому в можуть виникнути проблеми з розчинністю екстракту та однорідністю його лікарських формах. Задачею винаходу є одержання лікарського засобу з гіпоглікемічною та гіполіпідемічною дією шляхом екстракції листя брусниці звичайної з додаванням аргініну у 2-4-кратній еквімолярній кількості відносно загальної суми фенольних сполук в перерахунку на галову кислоту, який може бути використаний для профілактики та лікування порушень обмінних процесів при цукровому діабеті. Поставлена задача вирішується таким чином, що спосіб одержання засобу з гіпоглікемічною та гіполіпідемічною дією включає екстракцію рослинної сировини 40-60 % розчином спирту етилового, фільтрацію, упарювання, очищення та сушіння. Винаходом передбачено, що як рослинну сировину використовують листя брусниці звичайної, екстракцію проводять трикратно 40-60 % розчином спирту етилового у співвідношенні сировини і екстрагенту 1:6-1:10, очищення проводять шляхом відстоювання та відокремлення надосадової рідини, яку піддають стерилізації, після чого у процесі сушіння екстракт змішують з аргініном у 2-4-кратній еквімолярній кількості відносно загальної суми фенольних сполук. В одержаному сухому екстракті з листя брусниці звичайної міститься не менше 20 % суми фенольних сполук у перерахунку на галову кислоту, не менше 2 % гідроксикоричних кислот у перерахунку на хлорогенову кислоту та не менше 3 % флавоноїдів в перерахунку на рутин. Вибір листя брусниці звичайної, як сировини для одержання заявленого засобу, обумовлений значним вмістом у ньому фенольних сполук та достатньою вітчизняною сировинною базою [2]. Експериментальним шляхом встановлено, що ефективним при здійсненні заявленого способу є використання співвідношення сировини і екстрагенту як 1:3-1:9. При цьому, якщо співвідношення менше 1:3, не забезпечується достатня екстракція БАР, що приводить до зниження фармакологічної активності та виходу цільового продукту. Навпаки, якщо співвідношення більше 1:9, це веде до ускладнення та подовження технологічного процесу, часу упарювання та підвищення енерговитрат. Встановлене оптимальне співвідношення 1:61:10, при якому забезпечується максимальна екстракція БАР, час упарювання мінімальний та дозволяє отримувати екстракт на стандартному обладнанні без додаткового перезавантаження первинної сировини. Експериментально встановлено, що етанол у концентраціях від 40 до 60 % є оптимальними екстрагентом для вилучення основних груп БАР з листя брусниці звичайної. Вибір аргініну зумовлений тим, що утворення комплексів фенольних сполук з амінокислотами підвищує їх розчинність, покращує біодоступність та впливає на загальний фармакологічний ефект. Крім того, у патогенезі цукрового діабету важливу роль відіграють порушення функціонування ендотелію судин. Ключовим фактором, що регулює тонус судинного ендотелію, є найважливіший фізіологічний вазодилататор - монооксид нітрогену. Даний 2+ медіатор утворюється з аргініну під дією Са -залежного ферменту NO-синтази (NOS), тому як комплексоутворювач нами і був вибраний аргінін. Винахід ілюструється прикладами. Приклад 1 500 г листя брусниці звичайної, подрібненого до розміру часток 2-3 мм, поміщали в колбу, заливали трьома літрами 50 % розчином спирту етилового, екстрагували протягом доби при кімнатній температурі. Екстракцію повторювали тричі з новими порціями екстрагенту (1,0 л). Одержані витяжки об'єднували, відстоювали протягом доби, відфільтровували, стерилізували. Фільтрат упарювали за допомогою ротаційного вакуум-випарного апарата з додаванням аргініну 1 UA 111133 C2 5 10 15 20 у 2-4-кратній еквімолярній кількості відносно загальної суми фенольних сполук у перерахунку на галову кислоту. Одержаний розчин доводили до сухого екстракту та розтирали. Вихід сухого екстракту становить - 11 %. Приклад 2 Гіпоглікемічну активність сухого екстракту з листя брусниці звичайної вивчали на 18місячних самцях щурів лінії Wistar. Інсулінорезистентність моделювали утриманням тварин на дієті, збагаченою фруктозою (60,3 % фруктози, 18,3 % білка, 5,2 % жирів) [3]. Піддослідні тварини були розділені на три групи: 1) інтактні тварини, які утримувалися на стандартному раціоні віварію НФаУ; 2) тварини, які утримувалися шість тижнів на фруктозній дієті; 3) тварини, які утримувалися чотири тижні на фруктозній дієті та додатково два тижні на даній дієті з щоденним введенням сухого екстракту з листя брусниці з додаванням аргініну в дозі 2,5 мг на 100 г маси тіла. Тварин декапітовували під хлоразоло-уретановим наркозом. Об'єктом дослідження була сироватка крові. При виконанні експериментів дотримувалися "Загальних етичних принципів експериментів на тваринах" (Україна, 2001), гармонізованих з "Європейською конвенцією про захист хребетних тварин, що використовуються для експериментальних та інших наукових цілей" (Страсбург, 1985). Вміст глюкози, інсуліну, вільних жирних кислот (ВЖК) і триацилгліцеролів (ТАГ) визначали з використанням стандартних наборів фірми "Фелісіт-Діагностика" (Україна) та фірми "Lachema" (Чехія). Концентрації α-холестеролу (α-ХС) і β-холестеролу (β-XC) визначали за допомогою стандартних ферментативних холестеролоксидазних наборів фірми Boehringer Mannheim GmbH Diagnostica (Німеччина), попередньо розділивши фракції ліпопротеїнів турбідиметричним методом [4]. Результати представлені в таблиці. 25 Таблиця Гіпоглікемічна активність досліджуваних екстрактів на тлі високофруктозної дієти (М±m, n=6) Показник Інтакт Дієта Глюкоза, ммоль/л Інсулін, пг/мл ВЖК, ммоль/л ТАГ, ммоль/л α-ХС, ммоль/л β-XC, ммоль/л 4,7±0,1 1290±34 0,40±0,05 0,84±0,06 1,36±0,04 2,53±0,05 14,5±0,2* 2920±41* 0,69±0,04* 2,59±0,11* 0,82±0,04* 3,73±0,07* Дієта + екстракт брусниці + аргінін 8,2±0,4*# 1987±45*# 0,54±0,03*# 1,65±0,08*# 1,14±0,06*# 3,16±0,06*# * - відхилення достовірно відносно інтакту (р≤0,05), # - відхилення достовірно відносно "Дієти" (р≤0,05) 30 35 40 45 Аналіз наведених в таблиці результатів досліду свідчить, що утримання щурів на збагаченій фруктозою дієті викликає більш ніж трикратне збільшення рівня глюкози в сироватці крові. В цей же час спостерігається гіперінсулінемія, що при одночасній гіперглікемії свідчить про нечутливість клітин до інсуліну, тобто про розвиток інсулінорезистентності. Зростання концентрації ТАГ, що спостерігається через шість тижнів експерименту, є наслідком мобілізації жиру з жирової тканини і посилення ендогенного синтезу ТАГ і ліпопротеїнів дуже низької щільності печінкою через ослаблення інгібуючої дії інсуліну на ліполіз. Значне падіння рівня αхолестеролу і підвищення вмісту β-холестеролу у даної групи щурів пов'язане з посиленням перенесення естерів холестеролу від ЛПВЩ до атерогенних апоВ-ліпопротеїнів і обумовлено накопиченням ТАГ. В результаті зазначених змін розвивається атерогенна дисліпідемія, характерна для метаболічного синдрому [5]. При цьому у тварин третьої групи, які приймали сухий екстракт з листя брусниці звичайної спостерігається достовірне зниження рівня глюкози на 43 % та інсуліну на 32 % у порівнянні з групою тварин, які мали високофруктозну дієту, що свідчить про гіпоглікемічну активність екстракту. Встановлено, що введення сухого екстракту з листя брусниці звичайної в комплексі з аргініном, проявляє нормалізуючу дію на метаболічні порушення на тлі високофруктозної дієти. Так значно знижуються концентрації α-холестеролу, β-холестеролу та триацилгліцеролів, що свідчить про гіполіпідемічну активність екстракту. 2 UA 111133 C2 5 10 15 20 25 30 Таким чином, заявлено новий спосіб одержання засобу з гіпоглікемічною та гіполіпідемічною активністю на основі екстракту з листя брусниці звичайної з аргініном, який відзначається рядом переваг: 1) простота виконання та можливість здійснення на стандартному обладнанні у промислових умовах України; спосіб доступний, екологічно безпечний, дешевий, такий що не вимагає роботи з отруйними та шкідливими для здоров'я людини реактивами; 3) використання як сировини листя чорниці, яка має достатню сировинну базу і широко розповсюджена на території України; 4) наявність вираженої гіпоглікемічної активності екстракту з листя чорниці звичайної з ізотинолом, одержаного за заявленим способом; 5) перспективність використання одержаного екстракту як лікарської субстанції для одержання різних лікарських форм; 6) нетоксичність екстракту, одержаного за заявленим способом, дозволяє використовувати його довгостроково при лікуванні за рекомендацією лікаря; 7) тривалий термін зберігання засобу, одержаного за заявленим способом. Джерела інформації: 1. Пат. на корисну модель № 89735 Україна, МПК А61K 36/40, А61K 3/10. Лікувальнопрофілактичний засіб із гіпоглікемічною дією з листя кизилу /В.А. Рибак, Л.М. Малоштан, О.В. Криворучко, В.А., В.М. Ковальов. - № u201314662; Заявл. 16.12.2013; Опубл. 25.04.2014, Бюл. № 8. - 4 с. 2. Дослідження фенольних сполук спиртового екстракту з листя брусниці звичайної /М.А. Комісаренко, А.С. Гейдеріх, А.М. Ковальова, О.М. Кошовий //Український журнал клінічної та лабораторної медицини. - 2012. - № 2. - С. 24-26. 3. Endothelial dysfunction in high fructose containing diet fed rats: increased nitric oxide and decreased endothelin-1 levels in liver tissue /M. Altas, A. Var, K. Ozbilgin et al. //Dicle University Med School. - 2010. - V. 37, № 3. - P. 193-198. 4. Кейтс Μ. Техника липидологии. Μ975. - Μ.: Мир. - 322 с. 5. Загайко А.Л. Метаболічний синдром: механізми розвитку та перспективи антиоксидантної терапії: Монографія /А.Л. Загайко, Л.М. Вороніна, К.В. Стрельченко. - X.: Вид-во НФаУ: Золоті сторінки, 2007. - 216 с. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 35 40 Спосіб одержання засобу з гіпоглікемічною та гіполіпідемічною дією, що включає екстракцію рослинної сировини, фільтрацію, упарювання, очищення та сушіння, який відрізняється тим, що як рослинну сировину використовують листя брусниці звичайної, екстракцію проводять трикратно 40-60 % розчином спирту етилового у співвідношенні сировини і екстрагенту 1:6-1:10, очищення проводять шляхом відстоювання та відокремлення надосадової рідини, яку піддають стерилізації, та додають в процесі сушіння аргінін у 2-4-кратній еквімолярній кількості відносно загальної суми фенольних сполук. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3