Спосіб отримання кардіоліпіну

Реферат: Винахід належить до способу отримання кардіоліпіну шляхом екстракції ацетоном подрібненої тканини серця великої рогатої худоби, обробки метанолом, осадження цільового продукту розчином хлористого барію і виділення у вигляді натрієвої солі, де подрібнену тканину серця екстрагують регенерованим ацетоном, після фільтрації операцію екстрагування нейтральних ліпідів повторюють ще два рази сумішшю ацетону і ацетону, регенерованого в співвідношенні 1:1, зневоднену макуху серцевої маси обробляють сумішшю регенерованого метанолу та хлороформу, після фільтрації макухи процес повторюють ще два рази сумішшю метанолу та UA 111439 C2 (12) UA 111439 C2 хлороформу, а також сумішшю регенерованого метанолу та хлороформу у співвідношенні 9,5:0,5. UA 111439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до хімії природних сполук, а саме до способу отримання кардіоліпіну, і може бути використаний в медицині для виготовлення лікувальних і діагностичних препаратів. Кардіоліпін застосовується для отримання, контролю та стандартизації кардіоліпінових антигенів для діагностики сифілісу, а також використовується для моделювання біологічних мембран і виробництва ліпосомальних препаратів. Відомий спосіб отримання кардіоліпіну шляхом екстракції ацетоном подрібненої тканини серця великої рогатої худоби, обробки метанолом, осадження цільового продукту розчином хлористого барію і виділення у вигляді натрієвої солі [Регламент № 36-75 получения кардиолипинового антигена для реакции Вассермана. 11.06.75]. Відомий також спосіб отримання кардіоліпіну шляхом екстракції ацетоном подрібненої тканини серця великої рогатої худоби, обробки метанолом, осадження цільового продукту розчином хлористого барію і виділення у вигляді натрієвої солі. При цьому екстракцію ацетоном проводять в атмосфері інертного газу, а осадження барієвої солі кардіоліпіну проводять при певній температурі [А.с. № 709092 СССР. Опубликовано 15.01.80. Бюллетень № 2]. Даний спосіб отримання кардіоліпіну є найбільш близьким до того, що заявляється, за технічною суттю та результатом, який може бути досягнутий, тому він вибраний нами за прототип. Відомий спосіб не забезпечує високого виходу кардіоліпіну (0,5 г з 1 кг серцевого м'яза), так як втрачається вихід цільового продукту за рахунок неповної екстракції кардіоліпіну метанолом. У зв'язку з вищевикладеним, в основу винаходу поставлена задача підвищення кількості та якості кардіоліпіну, що виділяється з серця великої рогатої худоби, а також зменшення витрати органічних розчинників. Задачу, яку поставлено в основу винаходу, вирішують тим, що у відомому способі отримання кардіоліпіну шляхом екстракції ацетоном подрібненої тканини серця великої рогатої худоби, обробки метанолом, осадження цільового продукту розчином хлористого барію і виділення у вигляді натрієвої солі, згідно з винаходом, подрібнену тканину серця екстрагують регенерованим ацетоном, після фільтрації операцію екстрагування нейтральних ліпідів повторюють ще два рази сумішшю ацетону і ацетону, регенерованого в співвідношенні 1:1, зневоднену макуху серцевої маси обробляють сумішшю регенерованого метанолу та хлороформу, після фільтрації макухи процес повторюють ще два рази сумішшю метанолу та хлороформу, а також сумішшю регенерованого метанолу та хлороформу у співвідношенні 9,5:0,5. Технічний ефект винаходу обумовлений синергізмом сукупності дій, порядку їх виконання, а також умов, за яких ці дії виконуються. Теоретичним обґрунтуванням способу став той факт, що ліпіди, в тому числі і кардіоліпін, краще розчиняються в суміші органічних розчинників. Спосіб здійснюють наступним чином: Серця великої рогатої худоби очищають ножами вручну від жиру, крові і сполучної тканини. Серцевий м'яз розрізають на шматки і пропускають через м'ясорубку. Отриманий фарш тричі знежирюють і зневоднюють охолодженим в холодильному прилавку до температури мінус (10±2)°С чистим і регенерованим ацетоном при безперервному перемішуванні. Зі знежиреного та зневодненого фаршу серцевого м'яза тричі екстрагують фосфоліпіди сумішшю метанол:хлороформ і сумішшю регенерований метанол:хлороформ при температурі (24±2)°С. З порції метанольно-хлороформового екстракту в реакторі охолоджують до температури (4±2)°С, осаджують 20 % розчином барію хлориду, попередньо охолодженого до температури (4±2)°С. Отриманий осад фосфоліпідів розчиняють в діетиловому ефірі, а метанольно-хлороформову суміш направляють на регенерацію. Переосадження кардіоліпіну 20 % розчином барію хлориду повторюють ще 2 рази при температурі (4±2)°С. Барієву сіль кардіоліпіну розчиняють в діетиловому ефірі і переводять в натрієву сіль кардіоліпіну додаванням 18 % розчину хлористого натрію. Для кращого розшарування ефірного та водно-спиртового шарів додають спирт етиловий. До отриманого ефірного розчину кардіоліпіну додають рівний об'єм метанолу для видалення домішок у вигляді осаду. Потім кардіоліпін знову 2 рази осаджують 20 % розчином барію хлориду при температурі (4±2)°С і переводять в натрієву сіль додаванням 18 % розчину хлористого натрію. Отриманий ефірний розчин натрієвої солі кардіоліпіну зневоднюють сірчанокислим натрієм, упарюють при температурі не вище 37 °C і розчиняють в абсолютованому етанолі. Ефективність способу ілюструють такі приклади: Приклад 1. 50 кг серцевого м'яза великої рогатої худоби, очищеного від жиру, крові та сполучної тканини, подрібнюють на м'ясорубці і поміщують у реактор, який має сорочку для 1 UA 111439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 охолодження та підігріву, і за допомогою вакууму закачують 100 літрів ацетону, попередньо охолодженого в холодильному прилавку до температури мінус (10±2)°С, і ведуть перемішування суміші протягом трьох годин при 60 об/хв, температурі (4±2)°С. Після фільтрації операцію екстрагування нейтральних ліпідів повторюють ще 2 рази, ацетон направляють на регенерацію. З 300 літрів відпрацьованого ацетону після регенерації отримують 200 літрів регенерованого ацетону, який використовують для наступної серії отримання кардіоліпіну. Зневоднену макуху серцевої маси завантажують в реактор і доливають суміш метанолу і хлороформу у співвідношенні 95 літрів метанолу + 5 літрів хлороформу при температурі (24±2)°С і екстрагують фосфоліпіди, що містять кардіоліпін при безперервному перемішуванні суміші протягом 3-х годин. Після фільтрації макухи процес повторюють ще 2 рази. Всі три метанольного-хлороформових екстракти об'єднують, перекачують в інший реактор з охолодженням до температури (4±2)°С і осаджують 2,9 літрами 20 % розчину барію хлориду при температурі (4±2)°С при безперервному помішуванні. Суміш витримують при температурі (4±2)°С протягом 12-18 годин для формування осаду. Далі надосадову рідину (метанольнохлороформову суміш) декантують і направляють на регенерування. Отримують 200 літрів регенерованого метанолу, який використовують для отримання наступної серії кардіоліпіну. Осад реакційної маси промивають 24 л метанолу і після центрифугування розчиняють в 4,8 л ефіру. Для отримання натрієвої солі кардіоліпіну до отриманого ефірного розчину кардіоліпіну доливають 9,6 л метанолу, що містить 96 мл 20 % розчину барію хлориду, перемішують протягом 30 хвилин і центрифугують протягом 20 хвилин при 2500 об/хв і температурі (4±2)°С. Операцію осадження повторюють ще раз, після чого розчиняють в 4,8 л діетилового ефіру, доливають 1 л етилового спирту і 6,0 л 18 % розчину натрію хлориду. Водно-спиртовий шар видаляють. Операцію повторюють ще раз. Далі для видалення домішок до ефірного розчину натрієвої солі кардіоліпіну додають 1,6 л метанолу. Осад домішок видаляють центрифугуванням при температурі (4±2)°С, додають до суміші ще 3,2 л метанолу та осаджують барієву сіль кардіоліпіну повторно додаванням 1 л 20 % розчину барію хлориду. Для формування осаду суміш витримують 12-18 годин при температурі (4±2)°С. Осад, що сформувався, відділяють на центрифузі, розчиняють в 4,8 л ефіру і доливають 9,6 л метанолу та 100 мл 20 % розчину барію хлориду. Після перемішування і центрифугування операцію повторюють. Осад вторинної барієвої солі кардіоліпіну розчиняють в 4,8 л ефіру, доливають 1 л етилового спирту та 6 л 18 % розчину натрію хлориду. Після перемішування протягом 40 хвилин водно-спиртовий шар видаляють. Операцію повторюють ще раз. Отриманий ефірний розчин натрієвої солі кардіоліпіну зневоднюють додаванням безводного натрію сірчанокислого в кількості 2 кг і упарюють при температурі не вище 37 °C. Отриманий кардіоліпін розчиняють в 5,0 л спирту абсолютованого. Приклад 2. 50 кг серцевого м'яза великої рогатої худоби, очищеного від жиру, крові та сполучної тканини, подрібнюють на м'ясорубці і поміщують в реактор, який має сорочку для охолодження та підігріву, і за допомогою вакууму закачують 100 літрів регенерованого ацетону, попередньо охолодженого в холодильному прилавку до температури мінус (10±2)°С, і ведуть перемішування суміші протягом трьох годин при 60 об/хв, температурі (4±2)°С. Після фільтрації операцію екстрагування нейтральних ліпідів повторюють ще 2 рази ацетоном + ацетоном регенерованим (1:1). Зневоднену макуху серцевої маси завантажують в реактор і доливають суміш метанолу і хлороформу у співвідношенні 95 літрів регенерованого метанолу + 5 літрів хлороформу при температурі (24±2)°С і екстрагують фосфоліпіди, що містять кардіоліпін при безперервному перемішуванні суміші протягом 3-х годин. Після фільтрації макухи процес повторюють ще 2 рази метанолом + хлороформ і регенерованим метанолом + хлороформ (співвідношення метанолу та метанолу регенерованого 1:1). Всі три метанольно-хлороформних екстракти об'єднують, перекачують в інший реактор з охолодженням до температури (4±2)°С і осаджують 2,9 літрами 20 % розчину барію хлориду при температурі (4±2)°С, при безперервному помішуванні. Суміш витримують при температурі (4±2)°С протягом 12-18 годин для формування осаду. Осад реакційної маси промивають 24 л метанолу і після центрифугування розчиняють в 4,8 л ефіру. Для отримання натрієвої солі кардіоліпіну до отриманого ефірного розчину кардіоліпіну доливають 9,6 л метанолу, що містить 96 мл 20 % розчину барію хлориду, перемішують протягом 30 хвилин і центрифугують протягом 20 хвилин при 2500 об/хв і температурі (4±2)°С. 2 UA 111439 C2 5 10 15 20 Операцію осадження повторюють ще раз, після чого розчиняють в 4,8 л діетилового ефіру, доливають 1 л етилового спирту і 6,0 л 18 % розчину натрію хлориду. Водно-спиртовий шар видаляють. Операцію повторюють ще раз. Далі для видалення домішок до ефірного розчину натрієвої солі кардіоліпіну додають 1,6 л метанолу. Осад домішок видаляють центрифугуванням при температурі (4±2)°С, додають до суміші ще 3,2 л метанолу та осаджують барієву сіль кардіоліпіну повторно додаванням 1 л 20 % розчину барію хлориду. Для формування осаду суміш витримують 12-18 годин при температурі (4±2)°С. Сформований осад відділяють на центрифузі, розчиняють в 4,8 л ефіру і доливають 9,6 л метанолу та 100 мл 20 % розчину барію хлориду. Після перемішування і центрифугування операцію повторюють. Осад вторинної барієвої солі кардіоліпіну розчиняють в 4,8 л ефіру, доливають 1 л етилового спирту та 6 л 18 % розчину натрію хлориду. Після перемішування протягом 40 хвилин водно-спиртовий шар видаляють. Операцію повторюють ще раз. Отриманий ефірний розчин натрієвої солі кардіоліпіну зневоднюють додаванням безводного натрію сірчанокислого в кількості 2 кг і упарюють при температурі не вище 37 °C. Отриманий кардіоліпін розчиняють в 5,0 л спирту абсолютованого. Запропонований спосіб дозволяє збільшити вихід цільового продукту і отримати 30 г кардіоліпіну з 50 кг серцевого м'яза, а також знизити собівартість розчинників на 2/3 за рахунок їх регенерації. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 25 30 Спосіб отримання кардіоліпіну шляхом екстракції ацетоном подрібненої тканини серця великої рогатої худоби, обробки метанолом, осадження цільового продукту розчином хлористого барію і виділення у вигляді натрієвої солі, який відрізняється тим, що подрібнену тканину серця екстрагують регенерованим ацетоном, після фільтрації операцію екстрагування нейтральних ліпідів повторюють ще два рази сумішшю ацетону і ацетону, регенерованого в співвідношенні 1:1, зневоднену макуху серцевої маси обробляють сумішшю регенерованого метанолу та хлороформу, після фільтрації макухи процес повторюють ще два рази сумішшю метанолу та хлороформу, а також сумішшю регенерованого метанолу та хлороформу у співвідношенні 9,5:0,5. Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3