Вакцина інактивована проти інфекційного ринотрахеїту, парагрипу-3 та вірусної діареї великої рогатої худоби “рипавак-3″

Реферат: Вакцина інактивована проти інфекційного ринотрахеїту, парагрипу-3 та вірусної діареї великої рогатої худоби "РИПАВАК-3" містить компоненти вірусів ІРТ і ВД, штам "Молдавський" вірусу ІРТ, штам "ВК-1" вірусу ВД, ад'ювант та інактиватор. Додатково містить як виробничий штам "ЗКСМ" або "М-87" вірусу ПГ-3, захисне середовище (нейтральний гліцерин), перещеплювану лінію культури клітин нирки теляти для репродукції вірусів, як ад'ювант введено 6 % гідроокис алюмінію. UA 116607 U (12) UA 116607 U UA 116607 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної вірусології та біотехнології і може використовуватись для виготовлення інактивованих вакцин проти інфекційного ринотрахеїту, парагрипу-3 та вірусної діареї на підприємствах біологічної промисловості. Вакцина призначається для профілактичної імунізації великої рогатої худоби та забезпечує формування напруженого імунітету проти вірусів інфекційного ринотрахеїту (ІРТ), діареї (ВД) та парагрипу-3 (ПГ-3) у вакцинованих тварин через 14 діб після повторної вакцинації, який зберігається впродовж 6 місяців. Для профілактики інфекційного ринотрахеїту і парагрипу-3 існує асоційована жива вакцина проти парагрипу-3 та інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби (АС СРСР №926813). Також існує вакцина "Тривак (ВИЕВ)” для профілактики інфекційного ринотрахеїту, парагрипу-3 та вірусної діареї - хвороби слизових ВРХ [Патент RU №2111011, від 11.12.1996, МПК А61К З9/295, А61К 39/15]. Недоліком цих вакцин є те, що вони виготовлені із атенуйованих штамів вірусів, що може призвести до їхньої персистенції в організмі щеплених тварин та створювати загрозу подальшого розповсюдження цих хвороб. Існує бівалентна інактивована концентрат-вакцина проти інфекційного ринотрахеїту та вірусної діареї великої рогатої худоби [Патент UA № 4626 від 17.01.2005, А61К39/265], яка є найближчим аналогом. Недоліком є те, що вакцина містить у своєму складі 2 вірусних компонента, використовується для профілактики ІРТ та ВД, є дороговартісною, але не може використовуватись проти парагрипу-3. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити вакцину, інактивовану проти інфекційного ринотрахеїту, парагрипу - 3 та вірусної діареї ВРХ "РИПАВАК - 3", що містить компоненти вірусів ІРТ і ВД, а саме, штам "Молдавський" вірусу ІРТ, штам "ВК-1" вірусу ВД, ад'ювант та інактиватор, шляхом додавання як виробничого штаму "ЗКСМ" або "М-87" вірусу ПГ-3, використаня перещеплюваної лінії культури клітин нирки теляти для репродукції вірусів, використання як ад'юванту - 6 % гідроокис алюмінію, та захисного середовища (нейтральний гліцерин), щоб забезпечити ефективність тривалентної інактивованої вакцини проти інфекційного ринотрахеїту, вірусної діареї і парагрипу-3. Порівняльний аналіз із найближчим аналогом дозволяє зробити висновок, що вакцина "Рипавак-3", яка заявляється містить додатково: 1. Компонент парагрипу-3 для захисту тварин від вищеозначеної хвороби, 2. Має інше співвідношення компонентів, що входять до складу вакцини, а саме по 20 % антигенів вірусу ІРТ, ВД та ПГ-3, гліцерину та ад'юванту на фосфатному буфері. 3. Має в своєму складі захисне середовище (нейтральний гліцерин), що створює умови збереження антигенної структури вірусу. 4. Віруси ІРТ, ВД та ПГ-3 накопичують у культурах клітин нирки теля (НТ), трахеї теля (ТрТ), нирки вівці (НВ), а не нирка вівці (ПО-2) для ІРТ та коронарні судини теля (КСТ) для ВД. 5. Як ад'ювант використовується гідроокис алюмінію 6 % концентрації, а не масло французької фірми Seppic ISA-70. 6. Для виготовлення вакцини використовують виробничі партії вірусів, інфекційна активність 3 3 яких становить для вірусу ІРТ - 7,0±0,5 lg ТЦД 50/см , вірусу ПГ-3-6,5±0,5 lg ТЦД 50/см , вірусу ВД 3 7,0±0,5 lg ТЦД 50/см , на відміну від концентрованих вірусів в найближчому аналогу. Вакцину готують таким чином. Виробничі штами "Молдавський" вірусу ІРТ, "ВК-1" вірусу діареї та "ЗКСМ" або "М-87" вірусу ПГ-3 адаптовані до моношарових культур клітин НТ, ТрТ та НВ. Культури клітин заражають вірусовміщуючою суспензією, інкубують за температури (37,0±0,2)°С, з щоденним контролем ЦПД. При ураженості 80-100 % клітин моношару їх заморожують. Після циклу дефростації вірусвміщуючої рідини, очистки від клітинного детриту та перевірки на інфекційну активність, отримані вірусні антигени використовують для виробництва вакцини. З цією метою вірусвміщуюча біомаса кожного вірусу інактивується розчином формальдегіду, за температури (36-38)°С впродовж 96 годин. Після визначення відсутності бактеріальної та грибної контамінації, а також перевірки на повноту інактивації вірусні антигени ІРТ, ВД та ПГ-3 (у співвідношенні по 20 %) змішують між собою та додають по 20 % гліцерину та гідроокису алюмінію на фосфатному буфері (ад'ювант). Після ретельного перемішування впродовж 15-20 хвилин утворена суспензія фасується у флакони, після чого проводиться контроль вакцини за наступними показниками: Приклад 1 Для перевірки якості вакцини проводили вибірки із різних місць кожної серії у кількості що визначена в формулі Π=0,4 де: Π - необхідна для контролю кількість упаковок (об'єм вибірки) 1 UA 116607 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 N - кількість упаковок у серії. Із вибірки відбирали 6 флаконів препарату методом випадкового відбору, 3 з яких використовували для проведення випробування, а решту (3 флакони) направляли в архів контролера для зберігання впродовж 27 місяців. Проби вакцини, які направляли в архів контролера, опечатували і супроводжували документом встановленої форми, де вказували назву препарату, дату виготовлення, номер серії, дату відбору проб (число, місяць, рік), об'єм серії, посаду й підпис особи, яка відбирала проби. На архівних зразках ставили штамп "Архів" В разі отримання незадовільних результатів випробувань хоча б по одному з показників, по ньому проводили повторні випробування на подвійній кількості об'єктів. Результати повторних випробувань вважали кінцевими і поширювали на всю серію. В разі отримання незадовільних результатів повторних випробувань серію препарату вважали такою, що не відповідає вимогам інструкції з виготовлення та контролю препарату, її бракували і знищували. Приклад 2 Визначення зовнішнього вигляду, кольору, наявності сторонніх домішок, плісняви, порушення герметичності флаконів проводили візуально в пронизуючому світлі. Вакцина являла собою прозору червоно-рожевого кольору рідину з білуватим осадом, без сторонніх домішок і плісняви. Флакони з вакциною були ретельно закупорені, без тріщин. Після цього визначали характер осаду перевертанням флаконів догори дном. Осад захоплювався рідиною і після збовтування розбивався у гомогенну суміш. Приклад 3 Визначення контамінації бактеріальною і грибковою мікрофлорою проводили у відповідності до ДСТУ 4483:2005 "Препарати ветеринарні імунобіологічні. Методи визначення бактеріальної та грибної контамінації". Визначення контамінації мікоплазмами препарату проводили згідно з ДСТУ 4613:2006 "Препарати біологічні для ветеринарної медицини. Метод визначення контамінації мікоплазмами". Вакцина не була контамінована бактеріальною, грибковою мікрофлорою і мікоплазмами. Приклад 4. Визначення нешкідливості. Для досліджень використовували 3 флакони з вакциною. Їх об'єднували в одному стерильному флаконі, струшували і застосовували для досліджень. Вакцину вводили 10 білим 3 мишам підшкірно по 0,2 см . Вакцина не викликала захворювання та загибелі мишей за 10 діб спостереження, що підтверджує її нешкідливість. Приклад 5. Визначення антигенної активності. Вакцину з 3-х флаконів об'єднували в одному стерильному флаконі і вводили 3 внутрішньом'язово в стегно п'яти морським свинкам в дозі 2 см . Через 18 діб проводили повторну вакцинацію, а через 14 діб після повторного щеплення від тварин отримували сироватку крові. Проби сироватки крові в рівному співвідношенні об'єднували в одній ємкості й досліджували на наявність специфічних антитіл до вірусів ІРТ та ВД в реакції нейтралізації, а до вірусу ПГ-3 в реакції затримки гемаглютинації (РЗГА). Для визначення титру вірус нейтралізуючих антитіл готували в двох рядах пробірок 3 розведення сироватки від 1:4 до 1:512 так, щоб у кожній пробірці було по 2 см розведеної 3 сироватки. Потім у кожну пробірку першого ряду вносили по 2 см робочого розведення вірусу 3 ІРТ, який містив 100 ТЦД 50/см , а в кожну пробірку другого ряду додавали у тій же дозі вірус діареї (ВД). Після інкубування протягом години за температури (37,0±0,5)°С суміш кожного 3 розведення сироватки крові з вірусом вносили по 1 см у 4 пробірки з моношаром клітин нирки теляти (НТ), в яких перед цим провили заміну поживного середовища на підтримуюче. Для контролю залишали 4 пробірки з неінфікованими клітинами й одночасно проводили контрольне титрування вірусів ІРТ і ВД. Титр віруснейтралізуючих антитіл визначали за найбільшим розведенням сироватки крові, в якому ще спостерігали захист у 50 % пробірочних культур клітин від вірусів ІРТ і ВД. Для визначення титру гемаглютинуючих антитіл до вірусу парагрипу-3 використовували реакцію затримки гемаглютинації (РЗГА). На початку роботи встановлювали робоче розведення вірусного антигену, який повинен відповідати 4-ом гемаглютинуючим одиницям (ГАО). Перед постановкою основного досліду визначали коректність вибору 4 ГАО антигену вірусу парагрипа3. При коректному виборі робочої дози (4 ГАО) у першій та другій лунках спостерігали аглютинацію, а у третій та четвертій - аглютинація була відсутня. Окремим рядом ставили контроль на спонтанну аглютинацію еритроцитів морської свинки. Для постановки основного досліду у ряд лунок планшету вносили по 50 мкл 0,2 Μ фосфатно-буферного фізіологічного розчину (ФБФР), з рН (7,0±0,2). До першої лунки кожного ряду вносили 50 мкл досліджуваної 2 UA 116607 U 5 10 15 20 25 сироватки і робили двократне розведення сироваток крові за допомогою богатоканальної пипетки. Після цього в усі лунки планшету вносили по 50 мкл робочого розведення антигену вірусу прагрипу-3 (4 ГАО). Після контакту сироватки крові з антигеном протягом 1 години за температури (37,0+0,5)°С до всіх лунок додавали по 40 мкл 0,7 % суспензії еритроцитів морської свинки. За титр сироватки крові приймали найбільше розведення, яке гальмувало аглютинацію еритроцитів антигеном вірусу парагрипу-3, не менш ніж на два ++. Вакцину вважали такою, що вона пройшла контроль, якщо в сироватці крові вакцинованих морських свинок у реакції нейтралізації виявлено антитіла до вірусу ІРТ та ВД у титрах не нижче 1:8, а в РЗГА до вірусу ПГ-3 - не нижче 1:128. На основі отриманих даних можна зробити висновок, що вакцина відповідає вимогам інструкції з виготовлення та контролю препарату - стерильна, нешкідлива та антигенно активна. Вакцина з позитивним результатом пройшла міжвідомчі комісійні випробування. Крім цього препарат застосували більш ніж на 50 тис. голів великої рогатої худоби в різних областях України. Використання вакцини "Рипавак-3" в неблагополучних щодо інфекційного ринотрахеїту, вірусної діареї та парагрипу-3 господарствах призводить до зменшення клінічного прояву вищеозначених захворювань, сприяє утворенню колострального імунітету та забезпечує збереженість телят до 97,5 %. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Вакцина інактивована проти інфекційного ринотрахеїту, парагрипу-3 та вірусної діареї великої рогатої худоби "РИПАВАК-3", що містить компоненти вірусів ІРТ і ВД, а саме: штам "Молдавський" вірусу ІРТ, штам "ВК-1" вірусу ВД, ад'ювант та інактиватор, яка відрізняється тим, що додатково містить як виробничий штам "ЗКСМ" або "М-87" вірусу ПГ-3, захисне середовище (нейтральний гліцерин), перещеплювану лінію культури клітин нирки теляти для репродукції вірусів, як ад'ювант введено 6 % гідроокис алюмінію. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3