Спосіб підвищення якості та запліднювальної здатності сперміїв бугаїв

Реферат: Спосіб підвищення якості та запліднювальної здатності сперміїв бугаїв включає застосування типового лактозо-жовткового-гліцеринового середовища, сперму бугаїв і таурин. Перед розрідженням сперми у лактозо-жовтково-гліцеринове середовище додають 5 мл розчину комплексної сполуки полімер-транспортер+таурин. UA 117856 U (54) СПОСІБ ПІДВИЩЕННЯ ЯКОСТІ ТА ЗАПЛІДНЮВАЛЬНОЇ ЗДАТНОСТІ СПЕРМІЇВ БУГАЇВ UA 117856 U UA 117856 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біології, зокрема до репродуктивної біотехнології, а саме до способів підвищення тривалості виживання і запліднювальної здатності сперміїв за додавання розчину комплексу полімер-транспортер+таурин у середовище розрідження сперми. Корисна модель може бути використана у репродуктивній біотехнології для забезпечення збереженості і тривалого виживання та підвищення запліднювальної здатності сперміїв бугаїв за штучного осіменіння телиць і корів. Для захисту сперміїв від негативного впливу технологічних процесів підготовки еякулятів до кріоконсервування застосовують в розріджувачах сперми сполуки з антиоксидантними властивостями. До таких речовин належить таурин. Відомо, що таурин може виступати як антиоксидант, гальмуючи утворення вільних радикалів кисню, підвищуючи рівень відновленого глутатіону та активуючи каталазу і супероксиддисмутазу, а також нормалізувати транспортування електронів у дихальному ланцюзі мітохондрій [Ripps Η., Shen W. Review: Taurine: A "very essential" amino acid // Molecular Vision - 2012. - V. 18. - P. 2673-2686]. Крім того, таурин підвищує рухливість сперміїв [Sariozkan S., Bucak Μ.Ν., et al. The influence of cysteine and taurine on microscopic-oxidative stress parameters and fertilizing ability of bull semen following cryopreservation // Cryobiology. - 2009. - Vol.58 (2), P. 134-138]. Відомо також, що таурин підвищує кріопротекторні та антиоксидантні властивості сперми і, таким чином, здовжує тривалість виживання сперміїв [Van Den Elshout W. Method for improving the fertility of animals, EP 1714674 A1; Farley S.J., Ostermeier С.G., Taft R., Wiles V.M. Sperm cryoprotective media EP 2043431 A2]. Виявлено, що у складі лактозо-жовтково-гліцеринового середовища розрідження еякулятів таурин у оптимальних концентраціях (0,175-0,350 ммоль/л) підвищує виживання сперміїв. Недоліком наведених результатів досліджень є загальна біологічна характеристика впливу таурину на метаболізм клітин, в тому числі й сперміїв, використання водних розчинів сполуки у розріджувачах сперми. Найближчим до заявленого способу є спосіб підвищення виживання сперміїв за додавання таурину до промислових середовищ, які використовуються для розрідження сперми бугаїв [Остапів Р.Д., Манько В.В., Остапів Д.Д. № патенту: 84569 Опубліковано: 25.10.2013 Бюл. № 20]. Особливістю вказаного способу є використання водного розчину таурину у складі промислового розріджувача. Однак, за використання водного розчину сполуки проникнення таурину з розріджувача у спермії відбувається як пасивним, так і енергозалежним транспортом. Вказані особливості транспорту таурину через мембрани сперміїв призводять до часткової втрати ресинтезованого АТФ як в процесі гліколізу, так і в дихальному ланцюзі мітохондрій, що, своєю чергою, може призводити до зниження виживання статевих клітин. Заявлений спосіб усуває недоліки прототипу і при додаванні розчину полімертранспортер+таурин (готовий продукт) до розріджувача еякулятів бугаїв (лактозо-жовтковогліцеринового середовища) забезпечує проникнення комплексу полімер-транспортер+таурин через мембрани сперміїв без витрат енергії, захист ланок дихального ланцюга від утворених вільних радикалів Оксигену, зниження утворення продуктів вільнорадикального окиснення, збереження цілісності клітинної мембрани статевих клітин, підвищення ефективності використання субстратів розріджувачів і, тим самим, забезпечення високого виживання та активності сукцинатдегідрогенази і запліднювальної здатності сперміїв. В основу корисної моделі поставлена задача забезпечити підвищення збереження і виживання сперміїв поза організмом самців і, відповідно, запліднювальну здатність статевих клітин за додаткового введення розчину комплексної сполуки полімер-транспортер+таурин (готовий продукт) в склад лактозо-жовтково-гліцеринового середовища для розрідження еякулятів бугаїв. Технічний результат досягають додаванням до лактозо-жовтково-гліцеринового середовища розчину комплексної сполуки полімер-транспортер+таурин (готовий продукт) об'ємом 5 мл до 100 мл розріджувача. При проведенні патентно-інформаційного пошуку знайдено технічне рішення, в якому є суттєві ознаки спільні із заявленим рішенням: таурин використовується, як сполука, що підвищує життєздатність сперміїв; подібність складу лактозо-жовтково-гліцеринового розріджувача у прототипі та заявленому способі. Однак, наявність зазначених спільних з прототипом ознак є не достатньою для одержання технічного результату заявленого рішення. Технічних рішень, які б за сукупністю ознак повністю співпадали з ознаками заявленого способу не знайдено. Це дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого технічного рішення критерію "новизна". У джерелах патентної і науково-технічної інформації не знайдено технічних рішень з ознаками, що відрізняють заявлений спосіб від прототипу і забезпечують технічний результат: 1 UA 117856 U 5 10 15 20 25 30 35 підвищення виживання сперміїв бугая за допомогою додавання розчину комплексної сполуки полімер-транспортер+таурин (готовий продукт) у дозі 5 мл до 100 мл розріджувача. Отже, заявлене технічне рішення не випливає явним чином з рівня техніки, що дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого рішення критерію винаходу "винахідницький рівень". Заявлений спосіб може бути використаний у галузі біології, зокрема в репродуктивній біотехнології та штучному осіменінні з метою підвищення запліднювальної здатності сперміїв і заплідненості корів, і тому відповідає критерію "промислова придатність". Таким чином заявлене технічне рішення є новим промислово придатним і має винахідницький рівень, тобто відповідає всім умовам патентної спроможності винаходу (корисної моделі). Готують лактозо-жовтково-гліцериновий розріджувач (ЛЖГР; лактоза -11,5 г, жовток курячих яєць - 20 мл, гліцерин - 5,0 мл, вода - 100 мл). Перед розрідженням сперми у лактозо-жовтковогліцеринове середовище додають 5 мл розчину комплексної сполуки: полімертранспортер+таурин (готовий продукт). Приклад. Для підтвердження ефективності заявленого способу в умовах лабораторії молекулярної біології та клінічної біохімії Інституту біології тварин НААН були проведені дослідження з вивчення впливу різних доз розчину комплексної сполуки полімер-транспортер+таурин (готовий продукт) на виживання сперміїв. Відібрані еякуляти бугаїв розріджують лактозо-жовтково-гліцериновим середовищем у відношенні (1:4) і ділять на чотири частини: одну контрольну з додаванням водного розчину таурину в оптимальній концентрації (0,35 ммоль/л; 43,7 мг/л) та три дослідні з додаванням розчину комплексної сполуки полімер-транспортер+таурин (готовий продукт) у дозах, відповідно, 1,0, 5,0 і 10 мл /100 мл розріджувача (6, 30 і 60 мг/л таурину). Еякуляти бугаїв, розріджені контрольною і дослідними частинами лактозо-жовтковогліцеринового середовища зберігають у холодильнику за температури 0-4 °С Оцінюють виживання сперміїв (год.) у контрольних і дослідних зразках один раз на добу: наносять краплю сперми на підігріте до температури 37 °C предметне скло, змішують з краплею 2,8 % натрію цитрату. Накривають покривним склом і досліджують під мікроскопом (збільшення: об'єктив 10, окуляр 12). Виявляють активні спермії з прямолінійним поступальним рухом. Для визначення запліднювальної здатності сперміїв бугаїв після першого осіменіння телиць та корів за використання середовищ розрідження еякулятів - прототипу і дослідного використовують активність ензиму-маркеру сукцинатдегідрогенази (СДГ; од / год0,1 мл сперми). Встановлено, що додавання розчину комплексу полімер-транспортер+таурин у наростаючих дозах (1,0, 5,0 і 10 мл / 100 мл середовища) до розріджувача сперми бугая підвищує виживання сперміїв, порівняно з контролем (табл. 1). Зокрема, за 1,0 мл комплексу полімертранспортер+таурин 40 Таблиця 1 Виживання сперміїв та активність сукцинатдегідрогенази за додавання таурину в середовище розрідження еякулятів бугаїв, год. Дози комплексу полімер-транспортер + таурин (мл) у 100 мл розріджувача 10,0 5,0 1,0 Контроль n Виживання, год. n 8 8 8 8 174,0±13,91 174,0±13,25 165,0±13,71 140,4±12,88 4 4 4 4 СДГ, од/год.  0,1 мл сперми 70,0±7,91* 60,0±3,54* 65,0±7,50* 39,0±6,12 Примітка. Різниця статистично вірогідна порівняно з контролем: * p < 0,05 45 у 100 мл розріджувача фізіологічний показник якості сперміїв зростає на 14,1 % і становить 165,0 год. При підвищенні дози комплексу полімер-транспортер+таурин до 5 мл у складі 100 мл розріджувача виживання сперміїв на 19,4 % є вищим і становить 174,0 год., а за максимальної дози (10 мл /100 мл розріджувача) - не змінюється (174,0±13,91 год.). 2 UA 117856 U 5 10 15 20 Отже, найефективнішою дозою розчину комплексу полімер-транспортер+таурин за додавання до складу лактозо-жовтково-гліцеринового середовища є доза 5,0 мл у 100 мл розріджувача. Таким чином, додавання розчину комплексної сполуки полімер-транспортер+таурин у дозі 5,0 мл до 100 мл лактозо-жовтко-гліцеринового середовища забезпечує на 33,6 год. (19,4 %) вище виживання сперміїв, порівняно з контролем. При аналізі результатів активності ензиму-маркеру запліднювальної здатності сперміїв сукцинатдегідрогенази встановлено, що додавання в середовище розрідження еякулятів водного розчину таурину активність ензиму становить 39,0±6,12 од/год0,1 мл сперми, а за додавання мінімальної дози комплексу полімер-транспортер+таурин (1 мл /100 мл розріджувача) зростає на 40,0 % (р