Спосіб розмноження рослин конопель з насіння з низькою схожістю та життєздатністю

Реферат: Спосіб розмноження рослин конопель з насіння з низькою схожістю та життєздатністю включає стерилізацію насіння за допомогою гіпохлориту натрію, висаджування насіння на агаризоване живильне середовище Мурасіге і Скуга, мікроклональне розмноження утворених пагонів in vitro. Для стерилізації насіння застосовують водний розчин гіпохлориту натрію у концентрації 1,5 % з експозицією 12,5 хв. Насіння висаджують на живильне середовище Мурасіге і Скуга з макро- і мікроелементами у повній дозі, до складу якого входить 5,0 мг/л тіаміну, 1,0 мг/л піридоксину, 5,0 мг/л аскорбінової кислоти, 0,4 мг/л ГК3, 4,0 мг/л бурштинової кислоти, 15,0 г/л сахарози і яке не містить нікотинової кислоти. Культивують 3-4 доби при температурі 20-22 °C і надалі при температурі 24-26 °C. Для мікроклонального розмноження утворених пагонів з коренями використовують безгормональне живильне середовище Гамборга (В5), до складу якого входить 5,0 мг/л тіаміну, 1,0 мг/л піридоксину, 5,0 мг/л аскорбінової кислоти, 15,0 г/л сахарози. Для мікроклонального розмноження утворених пагонів без коренів використовують середовище Гамборга (В5), до складу якого входить 5,0 мг/л тіаміну, 1,0 мг/л піридоксину, 5,0 мг/л аскорбінової кислоти, 1,5 мг/л ІОК, 15,0 г/л сахарози. UA 120489 U (54) СПОСІБ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН КОНОПЕЛЬ З НАСІННЯ З НИЗЬКОЮ СХОЖІСТЮ ТА ЖИТТЄЗДАТНІСТЮ UA 120489 U UA 120489 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до сільського господарства (рослинництва) і може бути використана в сільськогосподарській біотехнології і селекції для отримання цінних генотипів конопель з насіння, що має низьку схожість та життєздатність. За умови зберігання у звичайних умовах складських чи лабораторних приміщень насіння конопель здатне до проростання не більше 3-4 років. У самозапилених ліній конопель більш пізніх генерацій (починаючи з І5-I6) проявляється явище інбредної депресії генеративних органів, тому насіння характеризується низькою життєздатністю. У обох зазначених випадках таке насіння не може у достатній мірі забезпечити відтворення та розмноження селекційного матеріалу. Крім того, з однієї пророслої насінини в ґрунті отримують лише одну рослину. Таким чином, актуальним є розробка способу розмноження рослин конопель з насіння з низькою схожістю та життєздатністю. Відомим є спосіб відновлення схожості насіння перцю (Івченко Т.В. Наукове обґрунтування ефективності методів біотехнології в селекції та насінництві овочевих рослин родин Solanaceae Gals., Alliaceae L., Asteraceae Dumort., Apiaceae Lindl., Cucurbitaceae Juss.: автореф. дис. на здобуття наук. ступеня докт. с.-г. наук: спец. 06.01.05 "Селекція рослин" / Т. В. Івченко. - X., 2016. - С. 11), в основу якого поставлено пророщування насіння в умовах in vitro на середовищі Мурасіге і Скуга, модифікованому ГК3 (0,1 мг/л) і кінетином (3 мг/л) та на середовищі Мурасіге і Скуга, модифікованому бурштиновою кислотою (3 мг/л). Недоліком відомого способу є те, що наявність у складі живильного середовища кінетину з концентрацією 3 мг/л у проростках конопель викликатиме активний калусогенез, іноді пригнічення, а не формування нормально розвинених проростків. Наявність у складі живильного середовища лише бурштинової кислоти з концентрацією 3 мг/л не забезпечуватиме значне підвищення схожості насіння культури конопель. Відомий спосіб розмноження рослин міскантусу з низькою схожістю та життєздатністю (Пат. 97957 UA, A01B 79/00. Спосіб розмноження рослин міскантусу з низькою схожістю та життєздатністю / С.М. Гонтаренко, С.О. Лашук; заявник і патентовласник Інститут біоенергетичних культур і цукрових буряків НААН. - № u 2014 12015; заявл. 06.11.14; опубл. 10.04.15, Бюл. № 7.), який включає використання як експлантів насіння міскантусу, застосування гіпохлориту натрію для стерилізації насіння, висаджування насіння на агаризоване живильне середовище з макро- і мікроелементами та додаванням регуляторів росту у певних концентраціях, отримання калусів у культурі in vitro, культивування калусів та регенерацію з них мікророслин. Відомий спосіб можна застосувати для розмноження рослин конопель. Недоліком відомого способу є те, що пропоновані співвідношення і концентрації фітогормонів суттєво не підвищуватимуть схожість насіння конопель, а викликатимуть утворення калусу. Потрібен ще тривалий час для ініціації морфогенезу і отримання рослин-регенерантів із калусу, які до того ж характеризуватимуться соматоклональною мінливістю. Відомий спосіб за технічною суттю і результатом, що досягається, є найбільш близьким до корисної моделі і може бути вибраний як прототип. У основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб розмноження конопель з низькою схожістю та життєздатністю насіння in vitro та підвищити коефіцієнт розмноження шляхом висаджування насіння на живильне агаризоване середовище певного складу з подальшим мікроклональним розмноженням отриманих пагонів. Поставлена задача вирішується тим, що в способі розмноження рослин конопель з насіння з низькою схожістю та життєздатністю, який включає використання насіння в ролі експлантів, стерилізацію насіння за допомогою гіпохлориту натрію, висаджування насіння на агаризоване живильне середовище Мурасіге і Скуга, мікроклональне розмноження утворених пагонів in vitro, згідно з корисною моделлю, для стерилізації насіння застосовують водний розчин гіпохлориту натрію у концентрації 1,5 % з експозицією 12,5 хв., насіння висаджують на живильне середовище Мурасіге і Скуга з макро- і мікроелементами у повній дозі, до складу якого входить 5,0 мг/л тіаміну, 1,0 мг/л піридоксину, 5,0 мг/л аскорбінової кислоти, 0,4 мг/л ГК 3, 4,0 мг/л бурштинової кислоти, 15,0 г/л сахарози і яке не містить нікотинової кислоти, культивують 3-4 доби при температурі 20-22 °C і надалі при температурі 24-26 °C, для мікроклонального розмноження утворених пагонів з коренями використовують безгормональне живильне середовище Гамборга (В5), до складу якого входить 5,0 мг/л тіаміну, 1,0 мг/л піридоксину, 5,0 мг/л аскорбінової кислоти, 15,0 г/л сахарози, для мікроклонального розмноження утворених пагонів без коренів використовують середовище Гамборга (В 5), до складу якого входить 5,0 мг/л тіаміну, 1,0 мг/л піридоксину, 5,0 мг/л аскорбінової кислоти, 1,5 мг/л ІОК, 15,0 г/л сахарози. 1 UA 120489 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Використання водного розчину гіпохлориту натрію у зниженій концентрації до 1,5 % з експозицією 12,5 хв. запобігає ушкодженню зародка насінини, слабких проростків конопель та появі видимих мутацій. За таких умов вихід стерильних експлантів становить 93,0-100 %. Вітамінний склад, куди входить 5,0 мг/л тіаміну, 1,0 мг/л піридоксину, 5,0 мг/л аскорбінової кислоти, а також 15,0 г/л сахарози забезпечують оптимізацію біохімічних процесів у пагоні конопель. Підвищена концентрація аскорбінової кислоти до 5,0 мг/л, яка є антиоксидантом, попереджує утворення фенольних сполук, які спричиняють пригнічення росту і розвитку або ж ведуть до загибелі експлантів. При цьому коноплі характеризуються природною здатністю до накопичення фенолів (канабіноїдів). Аскорбінова кислота зменшує окиснення КБДК, ТГКК, КБНК до відповідних сполук - КБД, ТГК і КБН. Гіберелін (ГК3) та бурштинова кислота саме у концентраціях 0,4 мг/л і 4 мг/л відповідно стимулюють поділ клітин у зародку насінини, ріст сім'ядоль, зародкових стебельця і корінця при одночасній збереженості генетичної автентичності зразка, що встановлено експериментально. Дозволяють призупиняти дію накопиченого в тканинах зиготичних зародків насінини в процесі зберігання природного інгібітора росту - абсцизової кислоти. Таким чином, зазначені регулятори росту пливають на регуляторні механізми, пов'язані з порушенням органічного спокою зрілих зародків конопель. Змінна температура культивування підвищує інтенсивність ростових процесів. Мікроклональне розмноження отриманих в результаті дії екзогенних регуляторів росту пагонів на живильному середовищі Гамборга (В 5) за наявності вітамінного комплексу дозволяє отримувати з 1-го проростка в середньому 5 мікроклонів. Додавання ІОК у концентрації 1,5 мг/л до живильного середовища для мікроклонального розмноження утворених пагонів без коренів сприяє активному ризогенезу. Спосіб реалізується на практиці наступним чином. Насіння конопель стерилізують водним розчином гіпохлориту натрію з концентрацією 1,5 % протягом 12,5 хв. в умовах ламінар-боксу. Після цього насіння тричі промивають стерильною дистильованої водою і висаджують на середовище Мурасіге і Скуга з макро- і мікроелементами у повній дозі, до складу якого входить 5,0 мг/л тіаміну, 1,0 мг/л піридоксину, 5,0 мг/л аскорбінової кислоти, 0,4 мг/л ГК3, 4,0 мг/л бурштинової кислоти, 15,0 г/л сахарози. Культивують насіння після висаджування при фотоперіоді 16 год. і відносній вологості повітря 60-80 % 3-4 доби при температурі 20-22 °C і надалі при температурі 24-26 °C. Після того, як пагони досягнуть 10-15 см проводять мікроклональне розмноження. Бічні бруньки (або живці з латеральними меристемами) пересаджують на безгормональне живильне середовище Гамборга (В5) з макро- і мікроелементами у повній дозі, до складу якого входить 5,0 мг/л тіаміну, 1,0 мг/л піридоксину, 5 мг/л аскорбінової кислоти, 15,0 г/л сахарози. Пагони без коренів, з зачатковими коренями або з неактивним ризогенезом висаджують живильне середовище Гамборга (В5) з макро- і мікроелементами у повній дозі, до складу якого входить 5,0 мг/л тіаміну, 1,0 мг/л піридоксину, 5,0 мг/л аскорбінової кислоти, 1,5 мг/л ІОК, 15,0 г/л сахарози. Дані, наведені в таблиці, свідчать про ефективність пропонованого способу. Порівняно з лабораторною і польовою схожістю на модифікованому середовищі значно зростає схожість насіння. Таблиця Схожість різних зразків конопель в залежності від умов пророщування Порядковий номер зразка 1 2 3 4 45 Лабораторна схожість, % 1±0,0 4±0,0 36±0,2 41±0,2 Польова схожість, % 0 0 16±0,1 20±0,1 Схожість в умовах in vitro за пропонованим способом, % 8±0,0 10±0,1 50±0,3 65±0,5 Запропонований спосіб забезпечує отримання цінного селекційного матеріалу конопель з насіння з низькою схожістю та життєздатністю, високий коефіцієнт їх розмноження, що прискорює селекційний процес. 2 UA 120489 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 Спосіб розмноження рослин конопель з насіння з низькою схожістю та життєздатністю, який включає стерилізацію насіння за допомогою гіпохлориту натрію, висаджування насіння на агаризоване живильне середовище Мурасіге і Скуга, мікроклональне розмноження утворених пагонів in vitro, який відрізняється тим, що для стерилізації насіння застосовують водний розчин гіпохлориту натрію у концентрації 1,5 % з експозицією 12,5 хв., насіння висаджують на живильне середовище Мурасіге і Скуга з макро- і мікроелементами у повній дозі, до складу якого входить 5,0 мг/л тіаміну, 1,0 мг/л піридоксину, 5,0 мг/л аскорбінової кислоти, 0,4 мг/л ГК3, 4,0 мг/л бурштинової кислоти, 15,0 г/л сахарози і яке не містить нікотинової кислоти, культивують 3-4 доби при температурі 20-22 °C і надалі при температурі 24-26 °C, для мікроклонального розмноження утворених пагонів з коренями використовують безгормональне живильне середовище Гамборга (В5), до складу якого входить 5,0 мг/л тіаміну, 1,0 мг/л піридоксину, 5,0 мг/л аскорбінової кислоти, 15,0 г/л сахарози, для мікроклонального розмноження утворених пагонів без коренів використовують середовище Гамборга (В5), до складу якого входить 5,0 мг/л тіаміну, 1,0 мг/л піридоксину, 5,0 мг/л аскорбінової кислоти, 1,5 мг/л ІОК, 15,0 г/л сахарози. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3