Спосіб виявлення біодеградації макромолекул мікробними компонентами дентальної біоплівки

Реферат: Спосіб виявлення біодеградації макромолекул включає нанесення досліджуваного матеріалу на носій та виявлення протеолітичних властивостей мікроорганізмів. Матеріал з біотопів ротової порожнини наносять на гнучку полімерну плівку із субстратним шаром та культивують шляхом накладання цієї плівки на поживне середовище в чашці Петрі з наступним вирощуванням при 37 °С. При виявленні зон із підвищеною прозорістю на плівці, а також змін у поживному середовищі, наприклад лізису еритроцитів, стверджують про біодеградацію макромолекул мікробними компонентами дентальної біоплівки. Як субстратний шар використовують емульсію, яка містить білки, полісахариди або інші макромолекули та нерозчинний барвник. Попередньо готують плівку Г-подібної форми, коротке вертикальне плече якої служить для утримування під час маніпуляції, а на зовнішній бік горизонтального плеча наносять субстрат. UA 122193 U (12) UA 122193 U UA 122193 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини, зокрема до стоматології, і може бути використана для виявлення патогенних властивостей мікроорганізмів ротової порожнини, зокрема протеолітичних властивостей, гіалуронідазної активності. Відомий спосіб виявлення біодеградації макромолекул шляхом прямого визначення протеолітичних властивостей мікроорганізмів [Е.Н Мишустин. Прямой метод определения суммарной протеолитической активности // Симпозиум по ферментам почвы. - Минск: Наука и техника, 1968. - С. 95-96], який полягає у розміщенні на тривалий час у досліджуваній пробі, зокрема ґрунту, рентгенівської плівки, що містить желатин як основу світлочутливого шару, з наступним виявленням протеазної активності мікробних колоній, що проявляється утворенням прозорих зон руйнування желатинового шару. Проте, світлочутливий шар рентгенівської плівки містить іони срібла, які проявляють антимікробну активність щодо бактерій організму людини. Крім цього, основою світлочутливого шару сучасних рентгенівських плівок замість желатину можуть бути інші субстрати, які не розкладаються мікроорганізмами. Цей спосіб непридатний для вивчення протеолітичних властивостей мікроорганізмів людини, оскільки плівка не може бути фіксована в організмі протягом тривалого часу. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб виявлення протеолітичних властивостей або інших ознак вірулентності, які проявляються змінами в поживному середовищі бактеріальних біоплівок ротової порожнини та свідчать про біодеградацію макромолекул мікробними компонентами дентальної біоплівки. Поставлена задача вирішується тим, що у способі виявлення біодеградації макромолекул, що включає нанесення досліджуваного матеріалу на носій та виявлення протеолітичних властивостей мікроорганізмів, згідно з корисною моделлю, матеріал з біотопів ротової порожнини наносять на гнучку полімерну плівку із субстратним шаром та культивують шляхом накладання цієї плівки на поживне середовище в чашці Петрі з наступним вирощуванням при 37 °С, і при виявленні зон із підвищеною прозорістю на плівці, а також змін у поживному середовищі, наприклад лізису еритроцитів, стверджують про біодеградацію макромолекул мікробними компонентами дентальної біоплівки. Поставлена задача вирішується також тим, що як субстратний шар використовують емульсію, яка містить білки, полісахариди або інші макромолекули та нерозчинний барвник. Поставлена задача вирішується також тим, що попередньо готують плівку Г-подібної форми, коротке вертикальне плече якої служить для утримування під час маніпуляції, а на зовнішній бік горизонтального плеча наносять субстрат. Запропонований спосіб виявлення біодеградації макромолекул відрізняється застосуванням гнучких полімерних прозорих плівок із фіксованим непрозорим субстратним шаром, який містить білки, полісахариди або інші макромолекули і використовуються для культивування на щільному поживному середовищі в чашці Петрі біоматеріалу, забраного з оральних біотопів і нанесеного зверху на субстратний шар, після чого виявляються зони деградації макромолекул та зміни в поживному середовищі, спричинені мікроорганізмами ротової порожнини. Спосіб дає можливість виявляти дію мікроорганізмів, наприклад тих, що містяться у ротовій порожнині людини в звичайних умовах та при патологічних станах, на білки, полісахариди або інші макромолекули, тобто виявляти патогенні та вірулентні властивості, які визначаються при культивуванні на поживних середовищах мікроорганізмів, нанесених на плівку із макромолекулярним субстратом. Запропонований спосіб дає можливість виявити мікроорганізми ротової порожнини що мають вірулентні властивості у складі дентальних біоплівок, може застосовуватися для етіологічної діагностики запальних процесів тканин ротової порожнини, клінічного супроводу та контролю при застосуванні ортодонтичних пристосувань. Спосіб пояснюється кресленням, на якому показано фотознімок чашки Петрі, де на біоплівці спостерігається розмноження бактерій, що супроводжується змінами середовища у вигляді зон гемолізу. Спосіб виявлення біодеградації макромолекул мікробними компонентами дентальної біоплівки здійснюють так. Попередньо готують плівку Г-подібної форми, коротке вертикальне плече якої служить для утримування під час маніпуляції, а на зовнішній бік горизонтального плеча наносять субстрат. Розміри плівки повинні бути достатніми для виявлення дії окремих колоній мікроорганізмів. Усі маніпуляції з плівками чи субстратами виконують в стерильних умовах. Субстратний шар одержують, наносячи на плівку емульсію, яка містить білки, полісахариди або інші макромолекули та нерозчинний барвник. Плівки поміщають в умови, що забезпечують фіксацію субстрату (висушування, охолодження або нагрівання, залежно від виду субстрату). 1 UA 122193 U 5 10 15 20 25 30 35 При виконанні дослідження матеріал з біотопів ротової порожнини забирають за допомогою стерильної полімерної смужки й рівномірно наносять на плівку із субстратом. Після цього плівку накладають на щільне поживне середовище в чашці Петрі з наступним культивуванням при 37 °С не менше 24 годин. Колонії мікроорганізмів, що розвиваються на поверхні поживного середовища, виділяють ферменти, які змінюють субстрат, що проявляється в утворенні зон із підвищеною прозорістю, а також змінами поживного середовища. Проведено порівняльне дослідження відомого (Е.Н Мишустин) способу виявлення протеолітичних властивостей мікрофлори ротової порожнини. Для цього використовували зразки стандартних рентгенівських плівок різних фірм і приготованих плівок з нанесеним субстратним шаром. Із цією метою досліджували мікрофлору зубної бляшки пацієнтів, у яких з метою ортодонтичної корекції застосовано брекети. Біоматеріал забирали за допомогою стерильної полімерної пружної смужки із зубної бляшки в місцях фіксації брекета і наносили на поверхню плівок, що містили приготований субстратний шар, нанесений на поверхню світлочутливого шару стандартних зразків рентгенівської плівки. Після цього плівки накладали на поверхню поживного середовища (кров'яний агар) і культивували протягом 48 год. У всіх досліджених стандартних зразках рентгенівської плівки не виявлено змін прозорості. У цих же умовах прозорість плівки з нанесеним протеїновим шаром значно підвищувалась унаслідок протеолітичної дії бактерій. Результат зареєстровано на ілюстрації. Виявлено, що під полімерними плівками, на які був нанесений біоматеріал з ротової порожнини, спостерігалось розмноження бактерій, що супроводжувалось змінами середовища у вигляді зон гемолізу. Виявлено окремі зони зміни прозорості такої плівки, що утворились в місцях контакту бактеріальних колоній з протеїновим шаром плівки. Таким чином, показано, що запропонований спосіб, на відміну від прототипу, дозволяє виявити протеолітичну активність бактерій ротової порожнини. Під полімерною плівкою спостерігалось утворення колоній бактерій. При значному вмісті бактерій у зубній бляшці (запальний процес, порушення гігієни зубів) під плівкою відмічався суцільний ріст бактерій. У центральних зонах контакту плівки із середовищем виявлявся ріст поліморфних грамнегативних бактерій, морфологічно подібних до анаеробних неспорових бактерій. Спосіб застосовано для дослідження патогенних властивостей мікрофлори біоплівок ротової порожнини. Така мікрофлора характеризується певними вірулентними властивостями, які впливають на стан тканин пародонту [Philip D MarshBMC Oral Health. 2006; 6(Suppl 1): S14 Dental plaque as a biofilm and a microbial community-implications for health and didisease]. Нами досліджено вірулентні властивості мікробіоценозів, які формуються при застосуванні брекетів при корекції аномалій прикусу. Порівнювалась протеолітична активність бактерій в мікробіоценозах, одержаних при культивуванні матеріалу, забраного з окремих біотопів ротової порожнини перед встановленням брекету та через 7днів. Результат показано в Таблиці. Таблиця Протеолітична активність мікробних компонентів дентальної біоплівки Біотоп Вільна поверхня зуба Міжзубні проміжки Ясенна борозенка Брекети Кількість біотопів Протеолітична активність, % від загального числа обстежених Перед встановлення брекета Через 7 днів + ++ +++ ++++ + ++ +++ ++++ 40 90 % 5% 5% 40 70 % 17,5 % 40 60 % 20 % 15 % 5% 40 10 % 2,5 % 72,5 % 20 % 5% 2,5 % 60 % 15 % 15 % 5% 5% 40 % 30 % 20 % 7,5 % 2,5 % 40 % 20 % 25 % 10 % 5% 2 Примітки: «-» - протеолітичної активності не виявлено; «+» - 1-2 колонії на см ; «++» - до 5 2 2 колоній на см ; «+++» - більше 5 колоній на см ; «++++» - суцільний ріст 40 Як видно з Таблиці, у більшості осіб (90 %) перед встановленням брекета протеолітична активність бактерій, виділених з поверхні зуба, не виявлялась. Проте з міжзубних проміжків у 30 % обстежених виділялись бактерії, колонії яких проявляли невисоку протеолітичну 2 UA 122193 U 5 активність. Із ясенних борозенок такі бактерії виділені в 40 % обстежених. Через 7 днів після встановлення брекета склад мікробної біоплівки змінювався в напрямку збільшення кількості колоній, що проявляли протеолітичну активність. У місцях контакту брекетів з тканинами протеолітичні колонії виявлено у 60 % обстежених. Одночасно збільшувалась кількість колоній із високою протеолітичною активністю в мікробній біоплівці. виділених з міжзубних проміжків ясенних борозенок. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 20 1. Спосіб виявлення біодеградації макромолекул, що включає нанесення досліджуваного матеріалу на носій та виявлення протеолітичних властивостей мікроорганізмів, який відрізняється тим, що матеріал з біотопів ротової порожнини наносять на гнучку полімерну плівку із субстратним шаром та культивують шляхом накладання цієї плівки на поживне середовище в чашці Петрі з наступним вирощуванням при 37 °С і при виявленні зон із підвищеною прозорістю на плівці, а також змін у поживному середовищі, наприклад лізису еритроцитів, стверджують про біодеградацію макромолекул мікробними компонентами дентальної біоплівки. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що як субстратний шар використовують емульсію, яка містить білки, полісахариди або інші макромолекули та нерозчинний барвник. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що попередньо готують плівку Г-подібної форми, коротке вертикальне плече якої служить для утримування під час маніпуляції, а на зовнішній бік горизонтального плеча наносять субстрат. Комп’ютерна верстка В. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3