Спосіб контролю денатурації днк при використанні електрофорезу у поліакриламідному гелі

Реферат: Спосіб контролю денатурації ДНК при використанні електрофорезу у поліакриламідному гелі застосовується шляхом проведення електрофоретичного розподілу у денатуруючому поліакриламідному гелі ампліфікованих мікросателітних локусів. Додатково до дослідних проб у кожному гелі використовують контрольний зразок, який містить ампліфікований цільовий фрагмент ядерної ДНК гомозиготної особини виду Gallus gallus, що містить у своєму складі динуклеотидний мотив (мікросателіт). Після проведення електрофорезу у випадку досягнення повної (ефективної) денатурації дослідних проб у контрольному зразку в наявності лише один фрагмент ДНК. Наявність більшої кількості фрагментів ДНК вказує на неповне досягнення умов денатурації та, відповідно, на необхідність повторення процедури електрофоретичного розподілу дослідних проб. UA 123147 U (12) UA 123147 U UA 123147 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до генетики, зокрема молекулярної генетики та молекулярної діагностики, а саме проведення контролю ефективності денатурації при використанні вертикального електрофорезу ДНК у денатуруючих поліакриламідних гелях. Корисна модель може бути використана у лабораторіях, які займаються молекулярногенетичними дослідженнями, діяльність яких спрямована на вивчення генетичної мінливості популяцій, проведення генетичного контролю походження особин за ДНК-маркерами, проведення різних досліджень, що пов'язані з застосуванням мікросателітних локусів. Відомий спосіб електрофоретичного розподілу нуклеїнових кислот та продуктів ампліфікації мікросателітних локусів, який полягає у використанні електрофорезу в денатуруючому поліакріламідному гелі (ПААГ). В якості денатуруючих реагентів використовують сечовину або формамід [Westermeier R. Electrophoresis in Practice, 4th, Revised and Updated Edition/ Reiner Westermeier., 2004. - 426 p.]. Недоліком цього способу є те, що в процесі електрофорезу не контролюють ефективність денатурації зразків. Відсутність контролю ефективності денатурації призводить до можливості невірної інтерпретації результатів генотипування за рахунок прояву додаткових артефактних фрагментів на електрофореграмі, що утворюються впродовж процесів ампліфікації мікросателітних локусів. Артефактні молекули на електрофореграмі представлені у вигляді додаткових фрагментів ДНК, що значно ускладнює визначення цільових алелів та призводить до значних помилок у генотипуванні особин. Найбільш поширені додаткові фрагменти відносяться до класу конформаційних химерних молекул (нелінійна гомодуплексна ДНК, гетеродуплексна ДНК). При проведенні електрофорезу в денатуруючому поліакриламідному гелі додаткові фрагменти не утворюються тільки за умови досягнення повної денатурації та молекули ДНК розподіляються лише в залежності від їх розміру (кількості пар нуклеотидів), тобто конформаційні ефекти зведено до мінімуму. Для досягнення повної денатурації перш за все необхідно використання певних реагентів (сечовина, формамід) в достатній концентрації та підтримка оптимальної температури гелю впродовж всього часу проведення електрофорезу. У випадку невиконання цієї умови, повністю денатуруючих умов не буде досягнуто, незважаючи на весь спектр використаних реагентів. Для запобігання помилок генотипування при проведенні мікросателітного аналізу внаслідок утворення неспецифічних конформаційних артефактних продуктів, використання денатуруючого ПА АГ необхідно доповнити способом контролю ефективності денатурації ДНК. Найбільш близьким до заявленого матеріалу за технічною сутністю, що вибрано за прототип, є спосіб реєстрації генотипів кукурудзи на основі сукупності мікросателітних маркерів з використанням електрофоретичного розподілу ампліфікованих фрагментів у денатуруючому поліакриламідному гелі [Патент України на винахід № 62244 G01 N33/48. Спосіб реєстрації генотипів кукурудзи /Сиволап Ю.М., Кожухова Н.Е.; заявл. 07.02.2003; опубл. 15.12.2003, Бюл. № 12. -С. 3]. Недоліком прототипу є те, що запропонований спосіб електрофорезу ампліфікованих фрагментів в денатуруючому поліакриламідному гелі проводиться за відсутності контролю денатурації ДНК, що призводить до значних труднощів при генотипуванні дослідних зразків в умовах утворення артефактних фрагментів упродовж ампліфікації мікросателітних локусів. Запропонований нами спосіб контролю ефективності денатурації при використанні електрофорезу ДНК у денатуруючому поліакриламідному гелі усуває недоліки прототипу, оскільки дозволяє ефективно визначити наявність артефактних молекул на електрофореграмі та відрізнити їх від цільових фрагментів, що у свою чергу значно підвищує ефективність генотипування. Задача корисної моделі полягає в розробці способу контролю денатурації ДНК при використані електрофорезу у поліакриламідному гелі для проведення молекулярно-генетичних досліджень в області мікросателітного аналізу. Поставлена задача вирішується шляхом проведення електрофоретичного розподілу у денатуруючому поліакриламідному гелі ампліфікованих мікросателітних локусів, згідно з корисною моделлю додатково до дослідних проб у кожному гелі використовують контрольний зразок, який містить ампліфікований цільовий фрагмент ядерної ДНК гомозиготної особини виду Gallus gallus, що містить у своєму складі динуклеотидний мотив (мікросателіт). Після проведення електрофорезу у випадку досягнення повної (ефективної) денатурації дослідних проб у контрольному зразку в наявності лише один фрагмент ДНК. Наявність більшої кількості фрагментів ДНК вказує на неповне досягнення умов денатурації та, відповідно, на необхідність повторення процедури електрофоретичного розподілу дослідних проб. Спосіб здійснюється наступним чином. Як універсальний контроль використовували специфічний ампліфікований фрагмент ядерної ДНК гомозиготної особини виду Gallus gallus, що містить динуклеотидний мотив 1 UA 123147 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 (мікросателіт). Ампліфікацію проводили з використанням специфічних праймерів, що фланкують відповідну ділянку ДНК. Поставлена задача вирішується у декілька етапів. На першому етапі проводили виділення ДНК із дослідних зразків з використанням одного із комерційних наборів реагентів ("ДНК-сорб-В", АмплиСенс, Росія або аналогічний). На другому етапі проводили ампліфікацію контрольного зразку геномної ДНК Gallus gallus з використанням праймерів 5'-tgtccttccaattacattcatggg-3' та 5’-tgcacgcacttacatacttagaga-3". Для проведення ампліфікації використовували стандартний набір реагентів (DreamTaq PCR Master Mix, Thermo Scientific). Для проведення полімеразної ланцюгової реакції використовували одноразові мікропробірки типу "епендорф" об'ємом 0,5 мкл. Концентрація праймерів має складати 0,2 мкМ. Поверх реакційної суміші нашаровували мінеральну олію 25-50 мкл. ПЛР проводили за наступною схемою: 1 цикл - денатурація: 94 °C, 3 хв.; 35 циклів - денатурація: 94 °C, 1 хв., відпал: 67 °C, 1 хв., елонгація: 72 °C, 1 хв.; 1 цикл - фінальна елонгація: 72 °C, 10 хв. Одночасно проводили ампліфікацію дослідних проб за відповідною програмою. Як негативний контроль використовували деіонізовану воду. На третьому етапі проводили електрофорез продуктів ампліфікації в 8-12 % (в залежності від розміру ампліфікованих фрагментів) денатуруючому поліакриламідному гелі (8 М сечовина). Денатурацію контрольного та дослідних зразків здійснювали з додаванням формаміду (співвідношення проба/формамід - 1/4) при 95 °C продовж 5 хв. Для внесення проб використовували суміш барвників (бромфеноловий синій, ксиленціанол) в концентрації 0,010,05 % з гліцерином (50 %). Денатурований зразок (контрольний ампліфікат) додавали в одну із лунок гелю. При цьому використовували стандартні умови проведення денатуруючого гельелектрофорезу в 1х ТВЕ буфері (89 mМ Тріс-НСІ, 89 тМ борат, 2 mМ ЕДТА, рН 8,3). Температура буферу під час внесення проб і впродовж форезу складала 60-65 °C, напруга поля  30 V/см. Візуалізацію проводили з використанням броміду етидію (0,5 мкг/мл), або азотнокислого срібла (0,2 %) відповідно стандартних методик. Облік результатів. У випадку досягнення необхідної ефективності денатуруючих умов використаного гелю у контрольній лунці (що містить контрольний ампліфікат) в наявності виявляється тільки цільовий фрагмент ДНК (бенд, смужка). Наявність одного фрагмента вказує на достатнє забезпечення денатуруючих умов електрофорезу, що дає можливість перейти до аналізу дослідних зразків. Наявність додаткових фрагментів у контрольній лунці на електрофореграмі вказує на недостатню ефективність досягнення умов повної денатурації, що, в свою чергу, вказує на необхідність повторного проведення електрофорезу. Ефективність методу наведена у прикладі. Приклад. Дослідження проведені в лабораторії молекулярно-генетичних і фізіолого-біохімічних досліджень у тваринництві Інституту тваринництва НААН. Здійснювали ДНК-типування особин великої рогатої худоби (n=50) української чорно-рябої породи за мікросателітними локусами RM185 та ВМ027. В якості джерела ДНК використовували волосяні цибулини. Для виділення ДНК використовували комерційний набір реагентів ("ДНК-сорб-В", АмплиСенс, Росія). Ампліфікацію за кожним з маркерів проводили з використанням відповідних праймерів та стандартного набору реагентів (DreamTaq PCR Master Mix, Thermo Scientific). Для типування, при проведенні електрофорезу в 8 % денатуруючому ПААГ, використовували контрольний зразок для визначення ефективності денатурації. Всього було досліджено 4 гелі. Після проведення електрофорезу з'ясовано, що у контрольних пробах у 3 гелях в наявності тільки один фрагмент ДНК (вказує на досягнення повної денатурації зразків). В той же час у 1 випадку (1 гель) в контрольному зразку визначили 3 фрагменти, що вказує на недостатню денатурацію зразків. У дослідних пробах також виявили додаткові артефайтні фрагменти, що привело до необхідності повторного проведення електрофорезу. 2 UA 123147 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб контролю денатурації ДНК при використанні електрофорезу у поліакриламідному гелі застосовується шляхом проведення електрофоретичного розподілу у денатуруючому поліакриламідному гелі ампліфікованих мікросателітних локусів, який відрізняється тим, що додатково до дослідних проб у кожному гелі використовують контрольний зразок, який містить ампліфікований цільовий фрагмент ядерної ДНК гомозиготної особини виду Gallus gallus, що містить у своєму складі динуклеотидний мотив (мікросателіт), після проведення електрофорезу у випадку досягнення повної (ефективної) денатурації дослідних проб у контрольному зразку в наявності лише один фрагмент ДНК, наявність більшої кількості фрагментів ДНК вказує на неповне досягнення умов денатурації та, відповідно, на необхідність повторення процедури електрофоретичного розподілу дослідних проб. Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3