Спосіб приготування живильного середовища для культивування продуцентів l-лізіну

ДЛЯ СЛУЖ1 ЫЮГО ПОЛЬЗОВАНИЯ )KJ N * СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЄСПУ6ЛИН (ІЧЇ ( 5 1 ) 5 С 12 Р 1 3 / 0 8 , С 12 1/20 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГННТ СССР К ї (21) 4733582/13 (22) 29,08,89 (71) Трипольскии биохимический завод Украинского производственного биохимического объединения "Укрбиохимпрепарат" (72) А„М. Эисенко, Н и Иг Якимович, И.Е, Попкович, Н„К« Краева, Э.ПО Кузьмина, А„Н, Русских, Л С Филиппова и М„А„ Казарян (53) 6 6 3 П 5 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР № 378411, кл„ С 12 Р 13/08, 1 9 7 1 . Временный (пусковой) технологический регламент производства кормового концентрата лизина на Тричольском биохимическом заводе Н ВР-02-86* ° 1986, с 107-108, (54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ L-ЛИЗИИА (57) Изобретение относится к б и о т е х нологии и к а с а е т с я приготовления питательных сред для культивирова Изобретение относится к биотехнологии и касается приготовления питательных сред для культивирования продуцентов L-лизина - незаменимой амино кислоты, которая используется в животноводстве дпя балансирования кормов о Известен способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов L-лРзика, предусматривающий приготовление водного раствора, 35-91 ния продуцентов L-лизина - незаменимой аминокислоты, которая и с п о л ь з у е т ся в животноводстве для балансирования кормов-, Целью изобретения я в л я е т ся повышение к а ч е с т в а среды для у в е личения "выхода L-лизина, Способ заключ а е т с я в т о м , что в процессе приготовления питательной среды мелассу ипи другой источник углеводородов с м е шивают с йодным раствором минеральной соли или смеси минеральных с о л е й , а стерилизацию т а к о г о м е л а с с н о солевого р а с т в о р а осуществляют при рН 7 , 5 - 1 0 , 0 , Раствор источников ростовых веществ в смеси с источниками минерального фосфора или без них г о т о в я т и стерилизуют отдельно, После стерилизации растворы смешивают, Сред а , приготовленная предложенным с п о собом, имеет более высокое к а ч е с т в о за счет лучшей сохранности витаминов (биотмн, тиамин) и редуцирующих веществ при стерилизации, Выход л и з и на при этом в о з р а с т а е т на 15-20%. 3 табл, содержащего мелассу, минеральные соли и источники ростовых факторов^, и его стерилизацию. Недостатком способа является частичное разрушение углеводов и витаминов в процессе стерилизации, приводящее к лонижекию выхода L-лизина , Наиболее близким к предложенному является способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов L-лизина, предусматрива йМО ! 1679ЯО1 юшки upm ОІОИПРШІР р ж т н о р а п насr w и гіделі по растнора, содержаще г о гидролизат ВВК И минеральные сппи, г их pd щечьную стерилизацию и последующее с меишваиис , Стериптаиию раствора мелассы проводят при 124-12V- С и е с т е с т в е н ном рП 5,0-7,0 в течение 10-20 мин. Pat хвор гидролизата БВК с минерально ными солями стерилизуют при 1 261?В°С и естественном рН 4 , 8 - 6 , 5 в течение 10-20 мин, Недостатком этого способа следует признать т о , что в процессе стерили- 15 зации раствора мелассы и з - з а частичной карамелизации Сахаров и разрушения витаминов снижается качество питательной среды и соответственно уменьшается выход лизина, 20 Целью изобретения является повышение качества среды для увеличения выхода L-лизина Способ заключается в следующем R процессе приготовления питатель- 25 ной среды мелассу или другой источник углеводов смешивают с водным раствором минерапьнои соли игш пмеси минеральных солей, необходимых для роста культуры - продуцента и био30 синтеза лизина, а стерилизацию т а к о го мелассно-солевого раствора осуществляют в щелочных условиях при рН 7 , 5 - 1 0 , 0 . При этом в мепассу добавляют р а с т вор одной из солей аммония или р а с т - 35 вор смеси солей аммония, например раствор хлористого или сернокислого аммония, смесь растворов хлористого и сернокислого аммония или смесь 40 растворов хлористого аммония и диаммониифосфата. Растлор источников ростовых в е ществ в смеси с источниками минерального фосфора (например, диаммо45 нийфосфата) или без него готовят и стерилизуют отдельно от углеводносолевого раствора г Конкретные температурные и в р е менные режимы стерилизации р а с т в о 50 ров не имеют существенного значения для достижения цели изобретения и процесс стерипнзации проводят в т е чение 15-1В мин в обычно принятых условиях при температуре 120-1 А С О Исходные и подпиточные среды гото - 55 , вят с использованием стерильного водного раствора мелагсы ини мелассы с питательными солнми Исходная с торильная питательная с р е д а , приготовленная по из в е с т н о му и предложенного гпособім, содержит, мае %: меласса (50£ РВ) 20, гидролизат КМ (с концентрацией прогидроли зова иного БГ»К - 20%) 7, Nil-Cl 1,6, (NfU^HPO^ 0, К ПОЛПИТОЧНРЯ стерильная п и т а т е л ь пая с р е д а , приготовленная по и з в е с т ному и предложенному с пособам, с о держит, мае %: меласса (50%) 6 0 , гидролизат БВК (с концентрацией прогидролизеванного БВК - 20%) 3, NH^Cl 6 » (NH^HPOq. 0 , 2 . Среды засевают культурoti B r e v i b a c t e r i u m s p . В П В-3708 (НИТИА-86) . КМ Ферментацию проводят в лабораторном ферментаторе при аэрации и механическом перемешивании среды в течение 60 ч при 31f1°C и подаче подпитывающей среды. Результаты, представленные в т а б л . 1 , показывают, что среда , приготовленная предложенным способом,имеет более высокое качество за счет лучшей сохраняемости витаминов и ростовых веществ (РВ) при стерилизации. Выход лизина при зтом в о з р а с т а е т на 15-20%. Величина рН, при которой осуществляют стерилизацию раствора мелассы с минеральными солями, имеет определенное значение для достижения п о с тавленной цели, что подтверждается данными табл с 2 Из данных т а б п . 2 следует, что РВ сохраняют устойчивость при значениях рН 7 , 5 - 1 0 , 0 . При этих значениях рН получены более высокие показатели при ферментации Аналогичные данные получены при использовании в качестве продуцентов L-лизина штаммов Brevibnc t e r i u m sp o E-531 и B r e v i b a c t e r i u m l a c t o f e r m e n tum В П B-4249 (НИТИА-88). РезультаКМ ты приведены в табл З П р и м е р 1. Готовят соленой раствор мелассы, содержащим, мае.%: меласса (50% РВ) 72, NH4C1 9,0, (NH4)Z1IPO4 0 , 3 5 . рН раствора поводят до 7,5 и стерилизуют при 1 26 С в т е чение 18 мин. Параллельно готовят раствор бепнового гидролиз.іта (рН 5, О , с одержащего 80 мас.% гидролиза гя ГВК (с кон центрациеи прогилрочикованного БВК 20%) Рас і вор бе і корректмр вки рН 5 6 1679801 ляет до- стерилизации: РВ 32 м а с Д , стерилизуют при 126 С в течение 1Zfi"C 1Й мин. тиамин 980 мкг/кг, биотин 38 мкг/кг. Содержание Е солевом растворе после стерилизации; РВ 34,4 мае -,%9 мелассы отдельных компонентов п;о тиамин 890 мкг/кг, биотин 35,5 мкг/кг t стерилизации составляет РВ 3 6 , О м а с Л В процессе стерилизации потери тиамина 1050 м к г / к г , биотина РВ, тиамина и биотина составляют 44 м к г / к г , после стерилизации: РВ 2,0, 9,0 и 6,7% соответственно. 34,9 мас.%, тиамина 940 м к г / к г , биотина 41 м к г / к г . В процессе стерилиза- 10 Получение исходной и подпиточной ции потери РВ, тиамина и биотина с о с питательных сред из стерильных солетавляют соответственно 3,1 10 и 7%0 вых растворов мелассы и гидролизата БВК с диаммониифосфатом, процесс Для получения исходной питательной биосинтеза личина с подачей подпитки среды смешивают стерильный солевой раствор мелассы со стерильным р а с т 15 проводят по примеру 1„ После окончания процесса ферментации содержание вором гидролизата БВК и стерильной лизина в культуральной жидкости с о с водой из расчета получения в среде тавляет 68,7 г / п : коэффициент конверсодержания РВ 12,5% и гидролиэата сии субстрата 0 , 4 3 . БВК 7%, 20 Для получения подпиточной питаП р и м е р 3 . Готовят солевой тельной среды смешивают стерильный раствор мелассы, содержащий, м а с Д : солевой раствор мелассы со стерильмеласса (50% РЛ) 70, NH4C1 8,8, ным раствором гидролизата БВК и с т е рН раствора доводят до Я,7 и стеририльной водой из расчета получения лизуют при 1?6°С в течение 18 мин» в среде содержания РВ 29% и гидро25 Параллельно готовят раствор гид" лизата БВК 3,3%, ролизатз БВК с дкаммонийфосфаточ (рН 5 , 0 ) , содержащий 80 мас,% гидПитательную среду в количестве ролизата БВК и 1 ( N H 4 ) t H P 0 4 . Р а с т % 5 л засевают 0,5 л посевного материавор гидролизата БВК с диаммонийфосла штамма B r e v i b a c t e r i u m sp„ В П К М В-3708, Ферментацию проводят в л а б о - 30 Аатом без корректировки рП стерилизуют при 126°С в течение 18 мин. раторном ферментаторе при аэрации и механическом перемешивании среды в Состав мелассно-солевой части течение 58 ч при З Н 1 ° С питательной среды до стерилизации: РБ 35 мас.%; тиамин 1000 мкг/кг 1 , В процессе культивирования в фербиотин 40 м к г / к г ; после с т е р и л и з а ментационной среде поддерживают с о 35 |Ции: РВ 33,8 мае.Я, тиамин 92Омкг/кг держание Сахаров на уровне 0 , 6 - 2 , 0 'биотин 36 мкг/кг % В процессе стеримас.% (по РВ) путем внесения подпитлизации потери РВ, тиамина и биотина ки. Введение подпитки осуществляют составляют соответственно 3,4,8,10%, при падении в ферментационной среде уровня Сахаров ниже 2%. Получение исходной и подпиточкой 40 питательных сред из стерильных с о л е Всего внесено 1,5 л подпитки. В вых растворов мелассы и гидролизакультуральной жидкости накоплено тов БВК с диаммонийфосфатом 5 процесс 65,3 г/л лизина; коэффициент конвербиосинтеза лизина с подачей подпитсии субстрата 0 , 4 3 . ки проводят по примеру 1. П р и м е р 2. Готовят солевой После окончания процесса ферменраствор мелассы, содержащий, мас.%: тации содержание лизина в культуральмеласса (50% РВ) 64, (НН 4 ) г НР0 4 10. ной жидкости 65,9 г / л , коэффициент Раствор доводят до рН 8,7 и стериликонверсии субстрата 0 5 4 2 . зуют при 126°С п течение 18 мит „ П р и м е v 4 , Готовят солевой Параллельно готовят раствор гид50 раствор мелассы, содержащий, м а с Д ; ролизата БВК с диаммонийфосфатс: меласса (50% РВ) 8 0 , NH4C1 4 , 5 5 (NH4>2.HPO4 (рН 5 , 0 ) , содержащий (NH^HPO^. 5,5 рН раствора доводят 80 мас.% гидролизата БВК и 1% до 10 и стерилизуют при 126°С в т е чение 18 мин. Раствор гидролкзата с диаммоний55 Содержание в солевом растворе ме Фосфатом без корректировки рИ стерилассы составляет до стерилизации: лизуют при 126°С в течение 18 мин. ' РВ 39 мас-%, тиамин 1220 м к г / к г , Содержание в солевом растворе биотин 60 м к г / к г , лосле стерилизамелассы отдельньос компонентов с о с т а в й 7 8 1679801 ции: PR 37,9 мас.%, 'іиамнн 1ОЯ4 мкг/кг, биотин 55 мкг/кг. Параллельно готовят раствор гидролиза та БВК с днаммонийфосфатом (рН 5 , 0 ) , содержащий, мас г %: гидролизат БВК 80, диаммонийфосфата 1,4, Раствор гидролизата с диаммончйфосфатом без корректировки рИ стерилизуют при 126°С в течение 18 мин. В процессе стерилизации потери РВ, тиамина и биотина составляют соответственно 2 , 9 , 12 и 8%. Получение исходной питательной среды из стерильных солевых р а с т в о ров мелассы и гидролизата БВК с диаммонинфосфатом, процесс биосинтеза л и зина проводят по примеру 1. После окончания процесса ферментации содержание лизина в культуральной жидкости 67,4 г/л и коэффициент конверсии субстрата 0,42, П р и м е р 5. Готовят солевой раствор жидких сахаросодержащих про™ дуктов (ЖСП), полученных в процессе сахароварения, мас.%: Ж П (60% РВ) С 70, NH4C1 7,7 г рН раствора доводят до 9,0 и стерилизуют при 126°С в т е чение 18 мин. Параллельно готовят раствор г н д ролизата БВК с диаммонийфосфятом (рН 5 , 0 ) , содержащий 80 мас.% гидро-лизата БВК, 1,5 мас.% кукурузного экстракта и 1% ( N H 4 ) z H P O r Приготовленный раствор стерилизуют при г 1 Q 126 d C в течение 18 мин. Процесс биосинтеза осуществляют по примеру 1. В конце ферментации в культуральной жидкости накоплено 70 г/л лизина при коэффициенте конверсии 0,42, При осущест вленин способа в а н а логичных условиях на исходной и подпяточной средах, приготовленных и з вестным способом, накопление лизина в культуральной жидкости составляет 57,3 г / л , коэффициент конверсии субстрата 0,37 15 Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я Способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов 2Q L-лизина, предусматривающий приготовление водных растворов, содержащих углеводы, минеральные соли азота и фосфора, а также гидролизат БВК в качестве источника ростовых веществ, 25 их стерилизацию и последующее смешивание, о т л н ч а ю щ й й с я тем, ч т о , с целью повышения качества питательной среды для увеличения выхода 'L-лнзина, осуществляют смешивание 30 водных растворов, содержащих углеводы и по крайней мере одну из минеральных солейд а стерилизацию полученного углеводно-солевого раствора осуществляют при рН 7 , 5 - 1 0 , 0 . Т а б л и ц а 1 Сравнительная характеристика известного и предложенного способов Известный способ Показатели до стерилизации после стерилизации Предложенный способ до стерилизации Содержание сахаров (РВ),%: - в растворе мелассы с солями - в растворе мелассы 35,3 35,7 32,5 после стерилизации i 0 1679801 , , ПрОДОГМ'РНИ' Извест ныи способ ПрРДППЖРШПіІП способ Показатели после стсрилн до стерилизации Содержание тиамина, мкг/л: - в растворе мелассы с солями - в растворе мелассы 7 Л О П . І до стсрнпизации после стернлиза 1150 46,0 1150 020 42,5 830 Содержание биотина, мкг/л: - в растворе мелассы с солями - в растворе мелассы 34,2 46,3 Содержание лизина в культуральной жидкости, г/л 58,3 68,5 Коэффициент конверсии субстрата в лизин 0,36 0,42 П р и м е ч а н и е , , Испытуемые водные растворы мелассы їй мелассы с питательными солями (питательной солью) готовят из одной порции мелассы. Штамм-Продуцент - Brevibacterium sp c ВКПМ-3 708 (НИТИД-36) г Таблиц.а2 Влияние рН стерилизуемой углеводно-солевой части питательной среды на содержание РВ среды и выход L-лизина рН стерилизуемой углевод Редуцирующие вещества в углеводно-солевой части -питательной среды Содержание лизина в Коэффициент конверсии суб вой части питательной среды до стерилизации, % ральной жидкости, лизине после стелили зации,% потери, % г/л 33,0 33,4 9 ,0 62, 1 7, 0 36,2 36,2 7 ,8 63, 0 0,36 0,36 7 ,5 36,2 34,6 4 ,5 66, 8 0,40 8 ,0 36,2 34,7 ,1 68, 1 0,42 6 ,0 1 Ї679801 12 Продолжение табл.2 рИ стерилизуемой yiлевод Редуцирующие вещества в углеподно-солевой части питательной среды Содержании ли типа в КоэффИШ!" цо стерилиза культу— ральной жидкости, г/л страта в лизине 1 1 ГЛ *-• Ґ* Г~\ ГҐ /Л — но солє вой части питательной среды после стерилиза ции, % потери, % ент конверсии суб ции ,% 8,5 35,0 35,1 3,3 9,0 36,2 36,2 0, 41 2,9 69,4 67,5 10,0 36,2 35,1 2,9 65,9 0, 40 10,5 36,2 34,3 5,3 56,5 0, 35 0, 42 Т а б л и ц Влипни* способа приї отоп іения питчтелыюи гредм «а ее качество и ОМУод личина Штамм-продуценг ГпосоР приготовления среды Содержание РВ, 1 к мчесе подпитки до стерилизации Л1П1ЦШ1 Потери РВ в процес се стерилизации , Z Тиамин, 7. потерь после стериличацни Бнотин 1 потерь после стериліпа— ции Содержание пи чина в культур ал мі oft жидкости. Конверсия РВ в лизин, Ж Производитель~ ность, KT/M S сут г/л Hicvibic terniir Sp, Іпвест 1Р И,1 20 23 '.2 ,4 ЗО , 0 12 .в 28, 0 27 ,о 3, 7 ІЗ 9 51 ,/, 32 .3 ,8 ИіпсстпыА 20, 3 іа , 5 9, 8 ІЗ 2! 49 . 8 41 ,6 п Иредлпгаеммй 23, 3 23 , 0 f, 3 \2 7 56 ,2 46 .0 14 иі їй Прсплагяемміі В.lactofermcntus» В П В-4?4Ч КМ Редактор Т г Иванова 5 Составитель Л. Минеева Техр ед Л.Олийнык Корректор С. Пекмар Заказ 3642/ДСП Тираж Подписное В И П Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР НИИ 113035, Москва, Ж-35, Раушская н а б . , д . 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101