Спосіб визначення аутосенсибілізації організму

Спосіб визначення аутосенсибілізації організму, що включає відбір крові, який відрізняється тим, що кров відбирають у кількості 0,5-1,0мл, стабілізують гепарином, відбирають 5мкл крові для контрольного та 5мкл крові для дослідного зразка у ємності для дослідження, додають до контроль 3 21382 аутосенсибілізації, що обумовлена тільки присутністю сенсибілізованих лімфоцитів не враховуючи можливу роль протитканинних антитіл. Найбільш близьким за технічною сутністю способу, що заявляється є спосіб визначення аутосенсибілізації організму [3. Фрадкин В.А. Аллергодиагностика in vitro. -М: Медицина, 1975. - 143с.] шляхом забору крові. При цьому кров забирають із вени та визначають аутосенсибілізацію організму за допомогою тесту показника пошкодження нейтрофілоцитів (ППН). Кров у об’ємі 0,08мл вносять у дослідну пробірку з 0,02мл антигену, розведеного 5% розчином цитрату натрію, та 0,08мл - у контрольну пробірку з 0,02мл 5% розчину цитрату натрію, струшують, інкубують у термостаті протягом 2 годин при 38°С, після цього знову стр ушують, готують мазки та підсушують їх, фіксують в спиртовому розчині цитрату міді та нітрату кальцію з додаванням формаліну, 3-х кратно відмивають у 96° спирті й фарбують за Шабадашем А.Л. - інкубують 20-25 хвилин в розчині перйодату при кімнатній температурі, промивають протягом 2-3 хвилин в дистилюючій воді, занурюють на 20-25 хвилин у реактив Шиффа, обробляють в трьох порціях сірчистої води по 2 хвилини в кожні, тричі по 15 хвилин промивають в дистилюючій воді, фарбують в розчині гематоксиліна протягом 2-10 хвилин, підраховують 100 нейтрофілоцитов в дослідному та контрольному зразках і обчислюють сенсибілізацію за формулою - відношення різниці кількості пошкоджених нейтрофілоцитов в дослідному зразку і контролі до 100. Недоліком відомого способу є порівняно значна складність фіксації та забарвлення мазків, варіабельність результатів забарвлення та відповідна відсутність стабільності у відтворністі способу, порівняно велика тривалість обробки мазків. В основу способу, що заявляється, поставлена задача створення способу визначення аутосенсибілізації організму, шля хом забору порівняно малої кількості крові, інкубації крові з тканинними антигенами/алергенами та підрахування кількості неушкоджених лейкоцитів у дослідних (з тканинним антигеном) та контрольному (з фізіологічним розчином) зразках, що дає можливість прискорити дослідження та спростити визначення аутосенсибілізації організму. Суть способу визначення аутосенсибілізації організму полягає в тому, що виконується шляхом забору крові у кількості 0,5-1,0мл, кров стабілізують гепарином, відбирають 5мкл крові для контрольного та 5мкл крові для дослідного зразка у ємності для дослідження, додають до контрольного зразка крові 10мкл 0,15М розчину NaCI, а до дослідного зразка крові - 10мкл тканинного антигену, до якого визначається сенсибілізація, струшують, інкубують 30-35хв в термостаті при 37°-38°С, додають в ємності з дослідним та контрольним зразком по 400мкл 3% оцтової кислоти з барвником, струшують ємності, інкубують 15хв. при 18-25°С, та підраховують вміст лейкоцитів у дослідній та контрольній ємностях, визначають рівень сенсибілізації організму як відношення різниці контрольдослід до контролю і при результатах обчислення 4 більше за 0,09 встановлюють аутосенсибілізацію організму до конкретного тканинного антигену. Новим є те, що кров забирають у кількості 0,51,0мл, стабілізують гепарином, відбирають 5мкл крові для контрольного та 5мкл крові для дослідного зразка у ємності для дослідження, додають до контрольного зразка крові 10мкл 0,15М розчину NaCI, а до дослідного зразка крові - 10мкл тканинного антигену, до якого визначається сенсибілізація, струшують, інкубують 30-35хв в термостаті при 37°-38°С, додають в ємності з дослідним та контрольним зразком по 400мкл 3% оцтової кислоти з барвником, струшують ємності, інкубують 15хв. при 18-25°С, та підраховують вміст лейкоцитів у дослідній та контрольній ємностях, визначають рівень сенсибілізації організму як відношення різниці контроль-дослід до контролю і при результатах обчислення більше за 0,09 встановлюють аутосенсибілізацію організму до конкретного тканинного антигену. Спосіб здійснюється таким чином: кров забирають у кількості 0,5-1,0мл, стабілізують гепарином. Відбирають за допомогою автоматичних дозаторів 5мкл крові для контрольного та 5мкл крові для дослідного зразка у ємності для дослідження (центрифужні пробірки ), додають до контрольного зразка крові 10мкл 0,15М розчину NaCI, а до дослідного зразка крові - 10мкл тканинного антигену, до якого визначається сенсибілізація. Струшують, інкубують 30-35хв в термостаті при 37°-38°С. Додають за допомогою автоматичних дозаторів в ємності з дослідним та контрольним зразком по 400мкл 3% оцтової кислоти з барвником (азуреозином), струшують ємності, інкубують 15хв. при 18-25°С. Підраховують за допомогою імерсійного мікроскопу та камер Горяєва вміст лейкоцитів у дослідній та контрольній ємностях. Визначають рівень сенсибілізації організму як відношення різниці контроль-дослід до контролю і при результатах обчислення більше за 0,09 встановлюють аутосенсибілізацію організму до конкретного тканинного антигену. Приклади Приклад 1 Визначали аутосенсибілізацію організму тварин до тканинних антигенів (печінки, нирок, серця, селезінки, тимусу, наднирників, яєчників, кори головного мозку, легень та нативної ДНК (н-ДНК) у щурів з моделлю системного аутоімунного захворювання та у інтактних тварин. Для цього забирали кров у сухі стерильні центрифужні пробірки, після утворення згустків відбирали сироватку у пластикові пробірки типу епендорф, зберігали при -20°С до постановки дослідження. Постановку реакції непрямої гемаглютинації (РНГА) виконували у три етапи за допомогою фіксованих глютаровим альдегідом еритроцитів барана, що обробляли тканинними антигенами. Перший етап фіксація еритроцитів барану. Наступного дня виконували другий етап - сенсибілізацію зафіксованих еритроцитів. На третій день виконували третій етап - головне дослідження - реєстрацію та визначення аутосенсибілізації у досліджуваних тварин. Досліджувані сироватки розтитровували у кратності 2-х та додавали до розведеної сироватки ерит 5 21382 роцити, що були оброблені тканинними антигенами. Визначали титр протитканинних антитіл як 6 останнє розведення сироватки, що давало непряму аглютинацію еритроцитів. Титри аутоантитіл до антигенів у щурів з моделлю САЗ та інтактних Титри антитіл (In) у гр упах досліджених тварин Тварини з САЗ Інтактні тварини 3,0±0,29 0,82±0,052* 3,4±0,22 0,80±0,046* 2,7±0,14 0,72±0,036* 3,0±0,28 1,12±0,196* 2,8±0,15 0,96±0,112* 0,88±0,04 0,70±0,05 0,81±0,009 0,80±0,01 0,73±0,04 0,74±0,05 0,9±0,10 0,81±0,09 3,6±0,12 0,80±0,051* Використані тканини антигени Печінки Нирки Серце Селезінки Тимус Наднирники Яєшники Кора головного мозку Легені н-ДНК * - різниця між показниками дослідних тварин з САЗ та інтактними щурами вірогідна (р£0,05) Дослідження виконано за три доби, у зв’язку з необхідностю здійснення попередніх підготовчих етапів. Зразки сироватки накопичували протягом 1-2 місяців, визначено наявність сенсибілізації до антигенів тканин печінки, нирок, серця, селезінки, тимусу та нативної ДНК (до 6 з 10 антигенів, що були використані). Не вдалось визначити сенсибілізацію до ткани: наднирників, яєшників, кори головного мозку, легенів. Приклад 2. Визначали аутосенсибілізацію організму тварин до тканинних антигенів (печінки, нирок, серця, селезінки, тимусу, наднирників, яєшників, кори головного мозку, легень та нативної ДНК) у щурів з моделлю системного аутоімунного захворювання та у інтактних тварин. Для цього забирали кров у пробірки з гепарином, струшували. Реакцію гальмування міграції лейкоцитів (РГМЛ) виконували шляхом заповнювання капіля рів сумішшю гепаринизованої крові у об’ємі 0,2мл і відповідного тканинного антигену у об’ємі 0,2мл (дослідні зразки капілярів) та - сумішшю крові у об’ємі 0,2мл і фізіологічного розчину у об’ємі 0,2мл (контрольні зразки капілярів). Виконували 3-4 паралельні дослідження з одним тканинним антигеном. Підготовлені таким чином капіляри центрифугували 5хв. при 1500об./хв., після чого у вертикальному положенні розміщували на 18-24 години, після чого реєстрували довжину зони міграції лейкоцитів від межі еритроцитарного осаду в контрольних і в дослідних капілярах у всіх паралельних дослідженнях, обчислювали середнє значення і показники гальмування міграції як відношення різниці середнього значення зони міграції в контрольних та дослідних капілярах до середнього значення зони міграції у контрольних капілярах, що помножили на 100. Показники сенсибілізації до тканинних антигенів у щурів з моделлю системного аутоімунного захворювання у РГ МЛ Антигени печінки нирки серце селезінки тімусу Наднирники Яєшники Кора головного мозку Легені н-ДНК Показники РГМЛ у щурів (%) Щури з моделлю САЗ Інтактні щури 58,6±4,26 99,3±2,5* 38,6±3,45 99,3±2,24* 98,1±3,7 99,7±3,9 52,1±3,13 97,2±2,46* 42,4±3,12 96,1±2,15* 89,0±5,2 95,0±4,1 97,3±3,5 99,0±4,0 95,6±3,9 96,0±4,0 0,90±5,1 0,91±4,9 36,5±2,85 98,2±1,22* * - різниця між показниками дослідних тварин з САЗ та інтактними щурами вірогідна (р£0,05) Дослідження виконано за дві доби, визначено наявність сенсибілізації до антигенів тканин печінки, нирок, селезінки, тимусу (до 4 з 10 використаних антигенів). Не вдалось визначити сенсибілізацію до тканин наднирників, яєшників, кори головного мозку, серця, легенів. Приклад 3. Визначали аутосенсибілізацію організму тварин до тканинних антигенів (печінки, нирок, серця, селезінки, тімусу наднирників, яєшників, кори головного мозку, стовбур у мозку, мозочка, колагену, легень та нативної ДНК) у щурів з моделлю системного аутоімунного захворювання 7 21382 та у інтактних тварин за допомогою тесту ППН (показника пошкодження нейтрофілоцитів). Кров у об’ємі 0,08мл вносили у дослідну пробірку з 0,02мл тканинного антигену, розведеного 5% розчином цитрату натрію, та 0,08мл - у контрольну пробірку з 0,02мл 5% розчину цитрату натрію, струшували, інкубували у термостаті протягом 2 годин при 38°С, після цього знову струшували, готували мазки та підсушували їх, фіксували в 8 спиртовому розчині цитрату міді та нітрату кальцію з додаванням формаліну, 3-х кратно відмивали у 96° спирті й фарбували за Шабадашем А.Л. та в розчині гематоксиліну. Підраховували 100 нейтрофілоцитов в дослідному та контрольному зразках і обчислювали сенсибілізацію за формулою відношення різниці кількості пошкоджених нейтрофілоцитов в дослідному зразку і контролі до 100. Показники сенсибілізації до тканинних антигенів у щурів з моделлю системного аутоімунного захворювання за тестом ППН Антигени печінки нирки серце селезінки тімусу Наднирники Яєшники Кора головного мозку Легені н-ДНК Показники сенсибілізації у щурів (у.од.) Щури з моделлю САЗ Інтактні щури 0,6±0,04 0,04±0,001* 0,4±0,05 0,05±0,05* 0,1±0,09 0,06±0,070 0,51±0,03 0,06±0,003* 0,08±0,01* 0,40±0,03 0,20±0,06 0,1±0,009 0,27±0,04 0,09±0,05 0,18±0,03 0,11±0,02 0,20±0,07 0,13±0,09 0,3±0,04 0,05±0,02* * - різниця між показниками дослідних тварин з САЗ та інтактними щурами вірогідна (р£0,05) Дослідження виконано за дві доби, визначено наявність сенсибілізації до антигенів тканин печінки, нирок, селезінки, тимусу, ДНК (до 5 з 10 використаних антигенів). Не вдалось визначити сенсибілізацію до тканин наднирників, яєшників, кори головного мозку, серця, легенів. Треба відзначити значну варіабельність результатів. Приклад 4. Визначали аутосенсибілізацію організму тварин до тканинних антигенів (печінки, нирок, серця, селезінки, тімусу наднирників, яєшників, кори головного мозку, стовбур у мозку, мозочка, колагену, легень та нативної ДНК) у щурів з моделлю системного аутоімунного захворювання та у інтактних тварин. Для цього забирали кров у пробірки з гепарином, струшували. Відбирали по 5мкл крові для контрольного та по 5мкл крові для дослідного зразка у ємності для дослідження (центрифужні пробірки), додавали до контрольного зразка крові 10мкл 0,15М розчину NaCI, а до дослідного зразка крові - 10мкл тканинного антигену, до якого визначали сенсибілізацію, струшували, інкубували 30-35хв в термостаті при 37°38°С, додавали в ємності з дослідним та контрольним зразками по 400мкл 3% оцтової кислоти з барвником, струшували ємності, інкубували 15хв. при 18-25°С, та підраховували вміст лейкоцитів у дослідній та контрольній ємностях, визначали рівень сенсибілізації організму як відношення різниці контроль-дослід до контролю і при результатах обчислення більше за 0,09 встановлювали аутосенсибілізацію організму до конкретного тканинного антигену. Показники сенсибілізації до тканинних антигенів у щурів з моделлю системного аутоімунного захворювання, що визначені за допомогою РІЛ Антигени печінки нирки серце селезінки тімусу Наднирники Яєшники Кора головного мозку Легені н-ДНК Показники сенсибілізації у щурів (у.од.) Щури з моделлю САЗ Інтактні щури 0,36±0,04 0,04±0,01* 0,18±0,05 0,06±0,01* 0,29±0,06 0,05±0,01* 0,36±0,06 0,05±0,01* 0,27±0,04 0,07±0,01* 0,35±0,06 0,04±0,01* 0,25±0,05 0,05±0,01* 0,21±0,04 0,06±0,01* 0,34±0,07 0,1±0,09 0,32±0,05 0,04±0,05* * - різниця між показниками дослідних тварин з САЗ та інтактними щурами вірогідна (р£0,05) 9 21382 Дослідження виконано за 5 годин, визначено наявність сенсибілізації до антигенів тканин печінки, нирок, серця, селезінки, тімусу, наднирників, яєшників, кори головного мозку та ДНК. не вдалось визначити сенсибілізацію до антигенів легенів. Для виконання дослідження непотрібно було готувати напередодні тест-систему (як в дослідженні за допомогою РИГА, приклад 1), дослідження не вимогало нічної інкубації (як у прикладі 2, РГМЛ), дослідження не потребує достатньо складної та довготривалої методики обробки та забарвлення мазків як при використанні методики ППН (приклад 3), проте є достатньо інформативним (зареєстровано сенсибілізацію до 9 антигенів з 10 використаних, 90%) та оперативним - дослідження виконано за один робочий день протягом 5 годин. Таким чином використання способу, що заявляється дає можливість провадити визначення аутосенсибілізації організму при використанні незначного об’єму крові досліджуваного, кров може Комп’ютерна в ерстка М. Ломалова 10 бути відібрана з пальця. Можливість використання малих об’ємів крові важливо при комплексному клінічному обстеженні пацієнта, при дослідженні експериментальних тварин, коли неможливо отримати великі об’єми крові. Відсутність етапів тривалої інкубації (18-24 години), багато етапного фарбування прискорює та спрощує визначення, покращує його відтворюванність. Відсутність етапу попередньої сенсибілізації еритроцитів тканинними антигенами дає можливість виконувати дослідження оперативно, в міру необхідності. Література: 1. Ніколенко Ю.І. Взаємопов’язані порушення імунітету і пуринового обміну при аутоімунних захворюваннях та процесах. - Автореф. дис. докт. мед. наук. -К, 1994, - 25с. 2. Клиническая иммунология и алергология. T.1: /Под ред. Л.Йегера. - 2-изд., перерабртанное и дополненое .-М: Медицина, 1990. - 528с. 3. Фрадкин В.А. Аллергодиагностика in vitro. М: Медицина, 1975. - 143с. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601