Підсилюючий розчин для імунофлюоресцентного аналізу з використанням іонів тербію

Изобретение относится к анализу материалов, а именно к определению антигенов и помощью лантанидной метки (иона тербия) - к лантанидному иммунофлуоресцентному анализу. Известно при использовании в качестве лантанидной метки иона тербия применение усиливающего раствора, основным компонентом которого является пивалоилтрифторацетон [Ilka Hemmilia, Sirkku Holltylnen, Kim Petterson, Timo Lovgren. Clln. Chem., 1987, v,33/12. P.2281-2283]. Раствор содержит 200 mМ пивалоилтрифторацетона, 100 mM триоктилфосфиноксида (ТОФО), 5 мл тритона X—100 в ацетатном буферном растворе 0,1 моль/л при рН=4,0. Тербий в этом растворе детектируется в концентрации 4*10-11 моль/л. К недостатком описанного усиливающего раствора можно отнести невысокую чувствительность детекции. Наиболее близким к заявляемому изобретению является усиливающий раствор для иммунофлуоресцентного анализа на основе пивалоилтрифторацетона и 1,10-фенантролина с использованием в качестве метки ионов тербия. [Yong-Yuan Xu, Ilkka Hemmilia, Anal. Chlm. Acta, 1992, v.256, p.9-16]. В 200 m) этого раствора содержится 20 mI хлорида иттрия (75 /гМ), 20 mI тритона Х-100(0,6%), 20 mI пивалоилтрифторацетона (500 цМ), 10 mI 1,10-фенантролина (1тМ), 50 mI этанола, 70 mI воды и 20 mI буферного раствора (гексаметилентетрами-новый), К недостаткам этого усиливающего раствора можно отнести: многокомпонентность; необходимость использования двух сенсибилизирующи х реагентов пивалоилтрифторацетона и 1,10фенантролина. для повышения чувствительности определения используется в качестве основы хлорид иттрия, который готовят из оксида иттрия 99,9999% чистоты. Однако даже такой чистоты оксид иттрия, согласно ТУ, может содержать примеси Sm = 1*10-5 % и Тв – 1*10-5%, что может значительно сказываться на холостом опыте. Кроме того, оксид иттрия такой чистоты весьма дорогостоящ и дефицитен. Чувствительность детекции иона тербия 3 10'13 моль/л. Общими признаками прототипа и заявляемого изобретения являются: использование органического сенсибилизатора; использование буферного раствора; использование детергента; использование воды. Причины, по которым по прототипу не может быть достигнут заявляемый нами технический результат, следующие; Возбуждение иона лантаноида в молекуле с органическим лигандом происходит за счет переноса энергии возбуждения с триплетного уровня лиганда, в случае тербия энергия триплетного уровня сенсибилизатора должна быть не менее 205 КДж. Пивалоилтрифторацетон имеет триплетный уровень 22000 см-1 и эффективность передачи энергии на ион Tb, резонансный уровень которого составляет 205000 см -1 , значительно меньше вследствие диссипации энергии из-за значительного энергетического зазора, что не позволяет достичь более высокой чувствительности детекции. В основу изобретения поставлена задача создания усиливающего раствора для иммунофлуоресцентного анализа с использованием ионов тербия более высокой чувствительности по отношению к известным методам. Поставленная задача решается в усиливающем растворе для иммунофлуоресцентного анализа с использованием ионов тербия, содержащем буфер, сенсибилизирующее вещество , детергент и воду тем, что в качестве сенсибилизирующего реагента используется оксолиновая кислота, а в качестве детергента цетилтриметиламмоний бромид, при следующем соотношении компонентов, мл: Использование изобретения позволяет получить следующий те хнический результат: повысить чувствительность детекции Новым в заявляемом изобретении является использование в качестве сенсибилизирующего реагента оксолиновой кислоты, а в качестве детергента - цетилтриметиламмоний бромида Причинно-следственная связь между совокупностью заявляемых признаков и достижением технического результата состоит в следующем: Повышение чувствительности детекции стало возможным благодаря использованию оксолиновой кислоты. Оксолиновая кислота (1-этил-1,4-дигидро-6,7-метилендиокси-4-оксохинолин-3-кар-боновая кислота) имеет в ультрафиолетовой области спектра полосу поглощения lмакс = 263 нм) (фиг 1) с высоким молярным коэффициентом поглощения e = 54500, что обуславливает эффективное поглощение энергии возбуждения этим лигандом. Триплетиый уровень лиганда Т = 20618 см -1, с которого передается энергия возбуждения на ион тербия, и резонансный уровень тербия (20500 см-1) очень близки, что способствует эффективной передаче энергии и тем самым более высокой интенсивности люминесценции по сравнению с прототипом. Использование катионного детергента цетилтриметиламмоний бромида в заявляемом изобретении позволяет увеличить жесткость молекулы комплекса, а также снизить степень проникновения молекул воды, туша щих люминесценцию, во внутреннюю сферу комплекса. Все это способствуе т снижению безызлучательных потерь энергии возбуждения. Взаимодействие оксолиновой кислоты с тербием проходит в области pH от 4,5 до 11, максимум люминесценции комплекса наблюдается при значении pH 7,5 (фиг. 2), которое создавали в растворе (10 мл) добавлением 0,2 мл 40%-ного раствора уротропина. Интенсивность люминесценции тербия в растворе оптимальна при добавлении в раствор 0,4 мл (1*10-3 моль/л) оксолиновой кислоты (фиг, 3) и 1 мл 0,05%-го раствора цетилтриметиламмоний бромид (фиг.4), который используется в качестве детергента. На фиг. 1-5 приведена зависимость: на фиг. 1 - спектр поглощения раствора оксолиновой кислоты (С = 1*10-4моль/л); на фиг. 2 - интенсивность люминесценции тербия в комплексе с оксолиновой кислотой от pH раствора. (CТв,3+ = 1 * 10-5 моль/л); на фиг. 3 -интенсивность люминесценции тербия в комплексе с оксолиновой кислотой от количества лиганда (С=1*10-3 моль/л); на фиг. 4 интенсивность люминесценции тербия в комплексе с оксолиновой кислотой от количества цетилтриметиламмоний бромида (С=0,05%); на фиг. 5 - интенсивность люминесценции тербия от его концентрации в растворе. Как видно из приведенных фиг. 1-5 оптимальная интенсивность иона тербия наблюдается при значении pH 7,5, при содержании в 100 мл водного раствора уротропина 40%-го - 2 мл, оксолиновой кислоты 1*10-3 моль/л -4 мл, цетилтриметиламмоний бромида 0,05% - 10 мл. Приготовление усиливающего раствора осуществляется следующим образом. В мерную колбу на 100 мл вводили 2 мл 40%-ного раствора уротропина, 4 мл 1*10-3 моль/л оксолиновой кислоты добавляли 10 мл 0,05%-но раствора цетилтриметиламмоний бромида и доводили водой до метки. Применение усиливающего раствора при постановке лантанидного иммунофлуоресцентного анализа было проверено с использованием ионов тербия. Для приготовления раствора хлорида тербия (0,1 М) точную навеску прокаленного оксида тербия (2,0121 г) растворяли при нагревании в соляной кислоте (1:1), выпаривали раствор до получения влажных солей и разбавляли дистиллированной водой до 100 мл в мерной колбе. Концентрацию полученного раствора контролировали комплексонометрически с индикатором арсеназо 1. Рабочие растворы готовили путем разбавления исходного. В серию пробирок вводили различные количества хлорида тербия в концентрации от 1*10-13 моль /л до 1*10-8 моль/л в каждую добавляли по 1 мл усиливающего раствора, разбавляли др 3 мл бидистиллиро-ванной водой и записывали интенсивность люминесценции пробы на спектрометре СДЛ-1, люминесценцию возбуждали светом ртутной лампы СВД-12.0А со светофильтром УФС-2. Результаты опытов представлены на фиг. 5. Как видно из фиг.5, график прямолинеен, при содержаниях тербия от 1*10-13 моль/л до 1*10-8 моль/л, чувствительность детекции тербия составляет 5*10-14 моль/л. Аналогичные результаты были получены при использовании в качестве источника ионов тербия антивидовых иммуноглобулинов, меченых ионами тербия (данные приведены на фиг. 5). Точность и достоверность обнаружения ионов тербия в растворе проверены путем статической обработки результатов определения. При n = 5, Р = 0,95 величина среднего статического отклонения Sr составляет 0,090.05. Таким образом, предложенный усиливающий раствор дает следующие преимущества: снижается минимально детектируемая концентрация тербия в шесть раз; в качестве детергента используется катионное поверхностно-активное вещество - цетилтриметиламмоний бромид.