Кондуктометричний біосенсор для визначення концентрації іонів важких металів у водних розчинах

Кондуктометричний біосенсор для визначення концентрації іонів важких металів у водних розчи 3 25456 іммобілізовані на поверхню амперометричного перетворювача мутаротазу та глюкозооксидазу, інвертазу ж просто додавали у реактор разом із пробою, а це ускладнює процедуру вимірів і збільшує його собівартість [6]. Другий варіант є більш практичним, в ньому іммобілізують всі три ферменти одразу, хоча мутаротазу потребляють у неоправдано великій кількості [7]. Але основним недоліком цих дво х біосенсорів є використання амперометричного методу вимірювання, який є дуже чутливим до впливу електроактивних часток, а тому менш селективний. Кондуктометричні методи аналізу на відміну від амперометричних є достатньо простими, зручними, точними та дозволяють вирішити ряд важливих науково-дослідних та виробничих задач [8]. Найбільш близьким до пропонованого за технічною суттю є кондуктометричний біосенсор для визначення концентрації іонів важких металів у водних розчинах, який має дві пари кондуктометричних електродів, на одну з яких нанесена робоча мембрана з уреази, на другу нанесена референтна мембрана, а вказаний біосенсор призначений для підключення до кондуктометричної установки [9]. Недоліком описаного пристрою є те, що його чутливість для визначення концентрації деяких важких металів у водних розчинах є недостатньою, оскільки у робочій мембрані використовують уреазу, яка порівняно з три-ферментною системою є менш чутливою до певних іонів важких металів, наприклад таких як Hg, Ag тощо. В основу запропонованої корисної моделі поставлено задачу створення такого кондуктометричного біосенсора для визначення концентрації іонів важких металів у водних розчинах, який би був більш чутливим. Поставлена задача вирішу 4 ється за рахунок застосування ефекту інгібування робочої мембрани на основі трьох ферментів: мутаротази, глюкозооксидози та інвертази і створення умов для селективної оцінки вмісту важких металів у досліджуваному зразку рідини. Поставлена задача вирішується запропонованим кондуктометричним біосенсором для визначення концентрації іонів важких металів у водних розчинах, який, як і відомий, має дві пари кондуктометричних електродів, на одну з яких нанесена робоча мембрана, на другу нанесена референтна мембрана, а вказаний біосенсор призначений для підключення до кондуктометричної установки, а, відповідно до пропозиції, робоча мембрана складається з ферментної системи інвертазамутаротаза-глюкозооксидаза, селективної до важких металів. Серед важких металів, як відомо ртуть (Hg) вважають одним із самих шкідливих. Навіть дуже малі концентрації Hg могуть впливати на здоров'я людини. Тому було поставлено задачу створити селективний біосенсор для визначення важких металів з більш високою порівняно з прототипом чутливістю. Необхідну чутливість до металів, зокрема до Hg, автори отримали завдяки використанню у складі чутливо ї мембрани: по-перше трьох ферментів, кожен з яких сам по собі інгібується важкими металами, а по-друге фермента інвертази, який найбільш чутливий саме до іонів Hg. Щоб отримати селективний біосенсор, який можливо було б використати для роботи з реальними зразками, ми вирішили застосовувати кондуктометричний метод вимірювання. В основі роботи кондуктометричного біосенсора для визначення важких металів лежить ефект інгібування трьох-ферментної системи з наступним каскадом ферментативних реакцій: INV Цукроза + Н2О ® b-D-фруктоза + a- D-глюкоза MUT a- D-глюкоза ® b- D-глюкоза GOD b- D-глюкоза + О2® D-глюконолактон + Н2О2 ß ¬ D-глюконова кислота + Н2О ® залишок кислоти + Н+ де INV - інвертаза, MUT - мутаротаза, GOD глюкозооксидаза. Інвертаза та мутаротаза, що утворюють другий шар мембрани, поетапно розщеплюють цукрозу до b- D-глюкози, а глюкозооксидаза, що утворює перший шар мембрани, розщеплює її до перекису водню та D-глюконолактону. Глюконолактон, в свою чергу, спонтанно гідролізується до глюконової кислоти, яка дисоціює на залишок кислоти і протон, при цьому змінюється провідність розчину, яку і можна реєструвати за допомогою кондуктометричного перетворювача [10]. Далі необхідно провести інкубацію біосенсора у досліджувальному розчині з можливим вмістом в ньому іонів важких металів. В ході цієї інкубації важкі метали інгібують роботу ферментів. При чому деякі іони металів інгібують один чи два (1) (2) (3) (4) ферменти, а інші всю трьох-ферментну систему, що призводить до підвищення чутливості до них. Тому в ході каскаду реакцій, після інгібування, генерується вже менше протонів, що призводить теж до зміни провідності розчину, але у меншій мірі ніж спочатку. В залежності від цієї різниці і визначають наявність важких металів в досліджувальному зразку. Оптимальне співвідношення компонентів (ферментів) було отримано авторами експериментально за умов отримання покращених аналітичних характеристик біосенсору таких як селективність, чутливість, операційна стабільність, а також мінімальної собівартості. Суть пропонованої корисної моделі пояснюється графічними матеріалами, де на 5 25456 Фіг.1 схематично показано кондуктометричний біосенсор для визначення концентрації іонів важких металів у водних розчинах; на Фіг.2 показана блок-схема кондуктометричної установки; Фіг.3 демонструє принцип роботи кондуктометричного біосенсора для визначення важких металів; а на Фіг.4 наведено калібрувальний графік залежності залишкової активності біосенсора від концентрації іонів Hg. Кондуктометричний біосенсор для визначення концентрації важких металів у водних розчинах складається з двох пар електродів 1 та 2. На одну пару електродів 1 нанесена двошарова робоча мембрана 3, 4. На другу пару електродів 2 нанесена двошарова референтна мембрана 5, 6. Згаданий біосенсор підключений до кондуктометричної установки. Робоча мембрана 3, 4 складається із ферментної системи інвертазамутаротаза-глюкозооксидаза, селективної до впливу важких металів. Кондуктометрична установка містить блок 7 для реєстрації сигналів біосенсора /РБ/, низькочастотний генератор сигналів 8 /ГС/ (типу Г3-118 /Україна/), входи якого підключені до відповідних електродів кондуктометричного біосенсора. Виходи генератора сигналів 8 /ГС/ підключені до входу фазочутливого нановольтметра 9 /НВ/. Ви ходи нановольтметра 9 /НВ/ підключені до реєстраційного блоку 7 /РБ/, призначеного для реєстрації сигналів з біосенсора. Окрім того, установка забезпечена опорами навантаження 11, призначеними для з'йому сигналів з відповідних пар електродів. При цьому входи нановольтметра 9 /НВ/ через диференційний підсилювач 10 /ДП/ підключені до відповідних пар електродів біосенсора, які розташовані у вимірювальній комірці 12. Пропонований кондуктометричний біосенсор на основі інгібіторного аналізу важких металів працює так. На робочу поверхню однієї пари електродів 1 кондуктометричного біосенсора наносили робочу мембрану, яка складається з двох шарів, перший з яких 3 (об'єм 100нл) вносили в пари глутарового альдегіду (ГА) на 20-30 хвилин. Цей шар 3 формували із 20мМ фосфатного буфера, рН 7,2, і наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас %): глюкозооксидаза (ГОД) 4,5-5,5 сироватковий альбумін бика (БСА) 4,5-5,5 гліцерин 8-12. Після нанесення першого шару його висушували на повітрі протягом 20-30 хвилин і наносили другий шар 4 робочої мембрани (100нл), що формували із 10мМ фосфатного буфера, рН 7,2, та наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас %): інвертаза 1-3 мутаротази 1,5-5 гліцерин 5-10 ГА 0,5-1,5 На другу пару електродів 2 наносили референтну мембрану, яка має два шари, перший з 6 яких 5 (100нл) вносили в пари глутарового альдегіду на 20-30 хвилин, цей шар формували з 20мМ фосфа тного буфера, рН7,2, і наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас %): БСА 9-11 гліцерин 8-12 Другий шар 6 референтної мембрани (100нл), наносили після висушування першого шару, і який формували з 10мМ фосфатного буфера, рН7,2, та наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас %): БСА 5-10 гліцерин 5-10 ГА 0,5-1,5 З генератора 8 на електроди біосенсора 1 та 2, що утворюють диференційну пару і знаходяться в комірці 12 з розчином, що досліджується, подавали змінну напругу з частотою 100кГц та амплітудою 10мВ. При цьому із згаданих електродів 1 та 2 отримували сигнали, які знімалися з опорів навантаження 11 (Rн=1кОм) та надходили через диференційний підсилювач [типу Unipan233-6 (Польша)] 10 до селективного нановольтметра [типу Unipan-233 (Польша)] 9. Після нановольтметра 9 сигнал подається до реєстраційного блоку 7 для реєстрації сигналу біосенсора кондуктометричної вимірювальної установки, в якій відбувалося перерахування даних та отримання сигналу, який відповідає концентрації вмісту іонів важких металів у досліджуваному водному розчині. Пропоновану систему використовували так. Попередньо виготовляли біоселективні мембрани. Створення біосенсора: виготовляли робочу мембрану 3, 4. Для цього готували розчин з вмістом 5% глюкозооксидази (ГОД), 5% БСА та 10% гліцерину у 20мМ фосфатному буфері, рН7,2. Референтну мембрану 5, 6 виготовляли таким же чином, але замість наважки ферментів брали 10% БСА. Гліцерин у складі мембран 3, 4, 5, 6 використовувався для стабілізації ферменту при іммобілізації та запобігання передчасного підсихання розчину, нанесеного на поверхню перетворювача. В свою чергу, БСА в складі робочої мембрани 3, 4 відігравав роль стабілізуючого агенту для ферментів. Для створення перших шарів мембран, відповідно, 3 та 5, краплю суміші ГОД-БСА (100нл) наносили на одну частину чутливої поверхні перетворювача 1, а на іншу 2 -розчин БСА без ферменту (це був датчик порівняння). Для іммобілізації мембран датчики розміщували в атмосфері насичених парів глутарового альдегіду (ГА) на 20-30хв. і потім підсушували на повітрі й відмивали від надлишку ГА у буферному розчині протягом 10-20хв. Для створення другого шар у 4 робочої мембрани біосенсора для визначення токсинів готували розчин з вмістом 2,5% інвертази, 5% мутаротази, 10% гліцерину, у 20мМ фосфатному буфері, рН7,2. Розчин для другого шару 6 референтної мембрани створювали таким же чином, але замість наважки ферментів брали 7,5% БСА. Обидві мембрани мали однаковий вміст білку. 7 Перед нанесенням змішували рівні об'єми наведених розчинів з 1% водним розчином ГА. Суміш з інвертазою та мутаротазою наносили на електродну пару 1 з ГОД (як описано вище), а референтну суміш - на іншу електродну пару 2 з БСА. Нанесення проводили за допомогою мікропіпетки Eppendorf (загальною ємністю 0,1-2,5мкл), що становило приблизно 100нл кожного розчину на одну пару електродів. Потім біосенсор висушували 12 годин на спокійному повітрі при кімнатній температурі. Перед початком роботи для видалення надлишку глутарового альдегіду сенсор відмивали у буфері, в якому і проводились подальші досліди. Протокол аналізу важких металів на прикладі іонів Hg в модельних розчинах. Спочатку отримували залежності величин відгуків біосенсору на цукрозу до і після інкубації його в розчинах з різними концентраціями іонів Hg - одержували калібрувальний графік (Фіг.4). Для перевірки роботи пропонованого кондуктометричного біосенсора з реальними зразками, готували розчин з умовно невідомою концентрацією іонів Hg. За допомогою біосенсору отримували сигнал (X) на внесення до комірки 1мМ цукрози. Величину цього сигналу приймаємо за 100%. Потім біосенсор розміщували у розчині з умовно не відомою концентрацією іонів Hg на 30 хвилин. Після інкубації біосенсор відмивали від залишків іонів Hg і знову отримували сигнал (Y) біосенсора на внесення до комірки 1мМ цукрози. В залежності від величини сигналу по формулі Z=Y*100/X (Х, Y - величини сигналів біосенсора до і після, відповідно, інкубації його в розчині з іонами Hg) отримуємо залишкову активність (Z). Оскільки залишкова активність відома, по калібрувальному графіку отримуємо концентрацію Hg, яка на сто відсотків співпадає з умовно невідомою концентрацію Hg у розчині. З прикладу видно, що пропонований кондуктометричний біосенсор є функціонально придат 25456 8 ним і дозволяє отримувати результати з більш високим ступенем достовірності, порівняно із прототипом, проводити кількісний аналіз іонів Hg в реальних розчинах. Література. 1. V. Yatsenko // Journal of Chromatography A, 722 (1996) 233-243. 2. Мур Дж., Рамамурти С. Тяжелые металлы в природных водах // М. - Мир. - 1987. - 286с. 3. Никаноров A.M., Жулидов А.В. Биомониторинг металлов в пресноводных экосистемах // СПб. - Гидрометеоиздат. - 1991. - 312с. 4. В.В. Dzantiev, E.V. Yazynina, A.V. Zherdev at al Sensors and Actuators В 98 (2004) 254-261. 5. Sherma J., Zweig G. Pesticides // Anal. Chem. - 1983. - V.55. - P.5 6. P. Bertocchi, E. Ciranni, D. Compagnone , V. Magearu, G. Palleschi, S. Pirvutoiu , L. Valvo , Flow injection analysis of mercury(II) in pharmaceuticals based on enzyme inhibition and biosensor detection // Journal of Pharmaceutical and Biomedical .Analysis 20 (1999) P.263-269. 7. H. Mohammadi, A. Amine, S. Cosnier, С Mousty, Mercury-en zyme inhibition assays with an amperometric sucrose biosensor based on a trienzymatic-clay matrix // Analytica Chimica Acta 543 (2005) P.143-149. 8. Дзядевич СВ. Кондуктометричні ферментні біосенсори: теорія, технологія, застосування // Біополімери і клітина. - 2005. - Т.21. - №2 – с.91106. 9. G.A. Zhyl yak, S.V. D zyadevich, Y.I. Korpan, A.P. Soldatkin, A.V. El'skaya, Application of urease conductometricbiosensor for heavy-metal ion determination // Sensors and Actuators В 24-25(1995) P. 145-148. 10. Дзядевич С.В., Шульга А.А., Пацковский С.В., Архипова В.Н., Солдаткин А.П., Стриха В.И. Тонкопленочные кондуктометрические датчики для ферментативных биосенсоров // Электрохимия. 1994. том 30.8. с.982-987. 9 Комп’ютерна в ерстка М. Мацело 25456 Підписне 10 Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601