Спосіб оцінки функціональних характеристик клітинних популяцій методом хемілюмінесценції

Ш МІГШОЇ N33/53 СПОСІБ ОЦІНКИ ФУНКЦІОНАЛЬНИХ ХАРАКТЕРИСТИК КЛІТИННИХ ПОПУЛЯЦІЙ МЕТОДОМ ХЕМІЛЮМІНІСЦЕНЦІЇ Винахід від носиться до медицини та біології і може бути використаним для діагностики широкого кола функціональних та патологічних станів організм)7. ВІДОМІЇИ спосіб визначення етіології кульових утворень легенів (ах. №1763983, МКІ G 01 N 33/53). Для диференціальної діагностики ехінококку, туберкульозу та раку легенів використовують метод ініційованої хемілюмінісцеиції (ХЛ) зразків плазми крові (одержують із суміши цільної крові, в яку добавлені ехінококкова рідина або туберкулін, або витяжка периферічного раку легенів) після 30-хвплпнної інкубації і при збільшенні загальної світлосуми одного з HIIV в 1.5 і більше раз у порівнянні з контролем ставлять діагноз ВІДПОВІДНОГО і'ЛКІіОрЮІІПШІЯ. Недоліком методу є по середи с (побічне) відбиття процесів, ідо відбуваються в клітинах через їх вплив на плазму крові, відносна трудомісткість, ірпвалість. В ід о м и й " С п о с іб оцінки ф у н к ц іо н а л ь н о ї а к т и вн о с т і імунокомнетенгних клітин в системі цільної крові" (а . с. № 2067766, МКІ G 01 N33/52). Метод включає відбір кроні, реєстрацію ріння хемілюмінісцентної реакції в присутності індуктора і а хемілкшінісцентного зонда з послідуючнм розрахунком оціночного показника, по величині якого судять про ступінь активності імунокомпетентнпх клітин. Недоліком способу с використання цільної крові, що знижує специфічність методу, використання зонду - дорогостоячої речовини, а також трудомісткість способу. Найбільш близьким до заявленою винаходу є "Спосіб визначення сенсибілізації до алергенів" (а.с. №1569705, МКІ G 01 N 33/48). Суіь методу полягає в безпосередньому виділенні досліджуваних клітин - лімфоцитів та вимірюванні їх спонтанної ХЛ та ХЛ після 10-20 хвилин інкубації І 20 мл розчину алергену і нрп збільшенні інтенсивності ХЛ на 11°і. і більше діагнозують (підтверджують) сенсибілізацію до цього алергену. Недоліком способу с мала чутливість методу. В основу винаходу поставлена задача створення точного та швидкого способу визначення функціональних характеристик клітинних популяцій різною походження шляхом підбору універсальної системи індукції хемілюмініецеїщії, яка сумісно з конкретним для досліджуемої реакції індикатором дозволяє реєструвати специфічну хемілюмінісцентну відповідь, на підставі якої визначають функціональні характеристики, резерви та патологічний етап організму. Спосіб здійснюється слідуючим чином. З крові або іншого біологічного матеріалу виділяють звичайним широко розповсюдженим способом досліджуєм^ популяцію клітин (наприклад, лімфоцити). В кювету хемілюміпометра наливають 1 мл фізіологічного розчину (0.9% NaCI), добавляю і ь певну кількість клітин, які знаходяться в 0.05 мл рідини, потім в цю суміш добавляють 0.05 мл необхідного індикатора (наприклад, алерген) та систему індукції і після вимірювання фону хемілюмінісценції реєструкпь спалах та хемілюмініспентпу відповідь шолому, по величині та динаміці якого судять про функціональні характеристики популяції клітин і визначають відповідний стан організму Приклад 1. Діагностика алергнчного стану організму. Для цього виділяють популяцію лімфоцитів із крові хворого. Б градієнті щільності з верографіпу (*J= 1.077) двічі промішали середовищем Хенкеа, доводили до концентрації 2-10ь кл/мл. Беруть 0.05 мл клітинної суспензії, вміщують в кювету, в яку попередньо налито 1 мл фізіологічного розчину, додають 0.05 мл алергену (концентрація як для реакції РГМЛ) та систему індукції. Після вимірювання ХЛ-відповіді лімфоцитів показники зрівнювали з хемілюмінісценцепцією лімфоцитів крові здорової людини і по різниці показників встановлювали алергичну реакцію на алерген, а по висотіступінь сенсибілізації організму до нього. Результати дослідження Хсмілюмінісцсиція. Хворші Дата Алерген Показники реакції РГМЛ імп/10 с (в капілярах) П.І.Б. (норма >0.65) Здорова людина Хворий ЩЛ.ІІ. ^8.12.98 кобальт 510 2994 0.30-позитивна В.Л.П. нікель 665 4163 0.38-позптивна 25.11.97 Висновок. З представлених даних видно значну впраженість хемілюмінесцентної відповіді лімфоцитів при навантаженні алергеном, що свідчить про сенсибілізацію організму, ступінь якої підтверджується реакцією гальмування ми рації лейкоцитів (РГМЛ). Приклад 2. Дослідження функціональних показників лімфоцитів людини і тварини. Виділяють популяцію лімфоцитів з крові вказаним вище методом. Беруть 0.05 мл клітинної зависі (суспензії) і проводять реакцію, як вказано вище. Як індикатор використовують добавки - мітоген (ФГА)} теофілін та ін. Результати дослідження , які характеризують різні сторони функціональної о с і ану цієї клітинної популяції. Хворий Індикатор Дата Показники Показники ХЛ-відповіді, реакції РГМЛ по ІІ.Б.І. імп^ІОс Ф.Ы.П. 25.11.97 6106 С.А.В. R.O.B. 2.12.97 Висновок. Представленні дат в нормі 15639 27.11.97 0.75 - знижена 3328 Теофілін 0.27 - підвищено 1152 -" 28.11.97 0.65) 0.31 - в нормі 8379 Фітогемаглютпнпн К.В.М. 20.11.97 Б.Т.Н. ФГА (норма до підвищено показують різні типи хемілюмінісцснтної відповіді лімфоцитів на міюген і теофілін, що свідчить про різний стан метаболічної активності клітини. При цьому ступінь чутливості лімфоцитів до мітогену переконливо підтверджується проведениям реакції РГМЛ. Подібна залежність висоти спалаху ХЛ від функціональної активності спостерігається і при дослідженні популяції тромбоцитів, атакож еритроцитів. Приклад 3. Дослідження активності комплементу сироватки крові шляхом реєстрації хемілюмінісцешної відповіді популяції еритроцитів барана. Реактиви готують за методом Вавілова Л.М. та ш. (Лаб. Дело - 1984. - №12, - С. 743-775), В кювету для хемілюмпюметра вміщують 1 мл фізіологічного розчину, а також 25 мкл еритроцитів барана, сенсибілізованих антитілами до них (гемолітична сироватка). Як індикатор беруть сироватку хворого н кількості 25 мкл, попередньо разведену 1:3 філолопчним розчином, приливать систему індукції і вимірюють хемілюмінесцентний сигнал. Результати досліджень Хворий, П.І.Б. А.А.В. С.А.В. Г.А.Д. Дата Показники ХЛ Показники по методу відповіді, імії/ІОс 2591 (норма 12-24) -титр 1:20 - в нормі 03.12.97 3200 1:24-в нормі 03.12.97 1260 1:10 - знижена І 03.12.97 Висновок. Даний метод пригодшш для визначення активності системи комплементу, що підтверджується кореляцією одержаних результатів і показниками, одержаними по методу Вавілової Л.М. і співав горів. Таким чином, запропонована система індукції хемілюмінесценції є універсальною для всіх клітинних популяцій і служить предметом розробки цілого ряду методів ранньої діаі поетики функціональних та патологічних порушень в організмі - простих, точних, швидких, специфічних, іцо не поіребують дорої их реактивів.