Біологічний оптоелектронний перетворювач, що контролює стереохімічне закріплення активних молекул

Біологічний оптоелектронний перетворювач, що контролює стереохімічне закріплення активних молекул, який містить призму повного внутрішнього відбитка з металевою плівкою, модифікованою самоорганізованим моношаром органічних сіркувміщуючи х молекул з аліфатичним вуглеводневим ланцюгом і багатошарове орієнтуюче покриття, який відрізняється тим, що орієнтуюче покриття виконано у вигляді багатошарової неорганічної плівки амінопентацианоферату міді. (19) (21) 2000031543 (22) 20.03.2000 (24) 16.04.2001 (33) UA (46) 16.04.2001, Бюл. № 3, 2001 р. (72) Гольцов Юрій Геннадійович, Матковська Лілія Олексіївна, Снопок Борис Анатолійович, Костюкевич Катерина Вікторівна, Ширшов Юрій Михайлович, Венгер Євген Федорович (73) Інститут фізики напівпровідників національної академії наук України 37078 вбудовують мембрани протеїнів або інші мембранно-пов'язані біологічно активні компоненти. Така бішарова ліпідна мембрана може специфічно зв'язувати цікавлячі біологічні об'єкти. У цьому випадку органічна моношарова плівка алкантіола захищає від деструктивного впливу металевої поверхні та забезпечує необхідні для спектроскопії поверхневого плазмонного резонансу однорідність і товщину. Орієнтоване закріплення активних біологічних молекул здійснюється за допомогою ліпідної мембрани білків. Проте, до недоліків виготовлення такого перетворювача можна віднести: використання біологічних речовин, що потребує складної і дорогої технології, тривалого часу і рішення конкретної наукової задачі з метою розробки й одержання молекули-спейсера й організації конкретної біологічної мембрани для конкретно досліджуваної біологічної молекули. Крім того, процес формування активної поверхні є багатостадійним. І нарешті, використання біологічних малостабільних реагентів веде до малого терміна служби оптоелектронного перетворювача. Таким чином, аналіз приведених перетворювачів поверхневого плазмонного резонансу показує, що чутливі поверхні таких оптичних пристроїв не забезпечують оптимального сполучення простого і недорогого методу виготовлення з чутливістю і стабільністю, які необхідні для високої відтворюваності параметрів перетворювача. В основу винаходу, поставлена задача збільшення стабільності і підвищення чутливості біосенсора при значному спрощенні і здешевленні виготовлення активної поверхні при забезпеченні оптимальних умов для орієнтованого закріплення біологічних молекул. Поставлена задача досягається тим, що в оптоелектронному перетворювачі поверхневого плазмонного резонансу, що містить призму ПВВ з металевою плівкою, модифікованою самоорганізованим моношаром алкантіолів передбачено нанесення неорганічної багатошарової плівки амінопентацианоферату міді, що дозволяє ефективно й орієнтовано закріплювати молекули білків на несучій поверхні із зберіганням їхньої природної конформації для підвищення чутливості і стабільності приладу. Збільшення стабільності досягається тим, що металева поверхня перетворювача, стабілізована щільнозапакованим моношаром алкантіола, додатково стабілізується і згладжується в результаті формування неорганічної багатошарової плівки амінопентацианоферату міді (товщина в області десятків ангстрем). Крім того, явною перевагою в порівнянні з прототипом у відношенні стабільності є використання неорганічного орієнтуючого покриття. Здешевлення випливає зі значного спрощення методу формування орієнтуючого покриття, що є двохстадійним, і полягає в зануренні призми з металевою плівкою у різноманітні неорганічні розчини з наступним промиванням у чистій воді і сушінням. При цьому не потрібно складного або дорогого устаткування і спеціальних умов, тобто процес відбувається з високим виходом і забезпечує високу відтворюваність параметрів чутливого елемента в цілому при умовах характерних для біль шості промислових і наукових організацій. Реактиви, які використовують у заявці є доступними і недорогими. Підвищення чутливості досягається тим, що несуча поверхня перетворювача, на якій відбуваються досліджувані процеси біологічної взаємодії, вкрита неорганічною багатошаровою плівкою амінопентацианоферату міді, зовнішня поверхня якої містить велику кількість рівномірно розподілених активованих аміно груп (NН3+). Білкові молекули ефективно й орієнтовано зв'язуються карбоксильними групами Fc фрагмента з NН3+ групами амінопентацианоферату міді (пептидний зв'язок), тобто утворюють щільний моношар із зберіганням природної конформації, що призводить до значного збільшення отриманого сигналу і, о тже, підвищенню чутливості перетворювача. Такий щільний і орієнтований моношар біологічних молекул неможливо одержати у випадку використання ліпідної мембрани, запропонованої в прототипі. На фіг. 1 - показана блок-схема устрою, що містить перетворювач, де 1 - джерело рполяризованого світла; 2 - призма з металевою плівкою, яка модифікована неорганічною багатошаровою плівкою амінопентацианоферату міді за допомогою самоорганізованого моношару алкантіола; 3 - блок керування обертанням призми; 4 блок подачі рідкої проби; 5 - фоточутли вий елемент; 6 - комп'ютерна система. На фіг. 2 - показана схема формування модифікуючого покриття і орієнтованого закріплення імуноглобулінів на ньому. На фіг. 3 - приведені сенсорограми кінетики адсорбції антитіла кози проти фібриногену людини (Б-момент інжекції розчину з концентрацією 100 мкг/мл) і його взаємодії з фібриногеном людини (Вмомент інжекції розчину з концентрацією 100 мкг/мл) відносно фосфатного буферу (А-момент інжекції 0,01 М розчину) на вільній поверхні золота (І) і на поверхні, що містить орієнтуючу неорганічну багатошарову плівку амінопентацианоферату міді. Біологічний оптоелектронний перетворювач, у винаході, є сенсорним приладом, робота якого базується на використанні явища поверхневого плазмонного резонансу (Поверхностные поляритоны. Электромагнитные волны на поверхностях и границах раздела сред. Под редакцией В.М. Аграновича, Д.Л. Миллса. – М.: Наука, 1985. - 525 с.; Поверхностные поляритоны в полупроводниках и диэлектриках. Н.Л. Дмитрук, В.Г. Литовченко, В.Л. Стрижевский. – К.: Наукова думка, 1989. - 375 с.) Робота приладу базується на вивченні поводження поверхневих плазмонів, що поширюються уздовж зовнішньої поверхні металевої плівки. Поверхневі плазмони збуджуються в тонкому металевому шарі, нанесеному на підставу скляної призми в умовах повного внутрішнього відбитка від межі поділу призма-метал, при цьому зовнішня сторона шару металу контактує з досліджуваною пробою. Резонансне зв'язування між фотонами збуджуючого світла та електронною плазмою на зовнішній поверхні металу відбувається в результаті падіння р-поляризованого світла з боку призми і сканування внутрішньої сторони металевої плівки в діапазоні кутів більше критичного обертом призми. Проявом такого зв'язування є зменшення інтенсивності світла повного внутрішнього відбитка 2 37078 від кута падіння, що фіксується фотодіодом. У такий спосіб формується основна характеристика приладу - резонансна крива відбитка, параметри якого визначаються діелектричними властивостями контактуючих середовищ. Форма кривої плазмонного резонансу і, зокрема, положення мінімуму, залежать як від показника заломлення призми, оптичних констант і товщини шар у, у якому збуджується поверхневий плазмонний резонанс, так і від оптичних параметрів і товщини шар у контактуючого з металом. Виміряючи зміну резонансних умов виникнення плазмонного ефекту, тобто спостерігаючи за зміною положення мінімуму плазмонного резонансу в часі, ми можемо судити про процеси взаємодії, що відбуваються на межі поділу і характеризувати їх кількісно. Чутливий елемент перетворювача, (фіг. 1-2) був виконаний нами з використанням призми повного внутрішнього відбитка, що має кут при підставі 68°, на робочу поверхню якої напиляли шар золота (45 нм). Золота плівка піддавалася модифікації самоорганізованим моношаром алкантіола з наступним нанесенням неорганічної багатошарової плівки амінопентацианоферату міді для орієнтованої іммобілізації активних біологічних молекул (товщина покриття становить десятки ангстрем). Через призму на металеву поверхню падає промінь (фіг. 1-1) р-поляризованого лазерного світла (633 нм). Сканування зразків у необхідному діапазоні кутів здійснюється на платформі, що обертається за допомогою крокового двигуна(фіг. 1-3). Для контактування робочої сторони металевої плівки з рідкою пробою передбачена проточна кювета з герметизуючим шаром силіконової гуми обсягом 100 mл. Подача проби здійснюється перистальтичним насосом (фіг. 1-4). Сигнал, відбитий від металевої поверхні фіксується фотодіодом (фіг. 15). Аналіз кутового положення і форми резонансної кривої реєструється керуючою програмою (фіг.1-6), що дозволяє одержувати в реальному масштабі часу кінетичну криву або сенсорограму (фіг. 3), що відображує процеси адсорбції і взаємодії біологічних молекул, присутніх у досліджуваній рідкій пробі. Результати вимірів математично опрацьовуються по спеціально розробленому алгоритму. Роздивимося один із прикладів практичного використання винаходу. Отримання і властивості неорганічних багатошарових плівок амінопентацианоферату міді описані у: Г. Брауэр, Руководство по препаративной неорганической химии. - Москва, Издательство иностранная литература, 1956. - С. 692; А.А. Карякин, Е.Е. Карякина. Амперометрические биосенсоры на основе поликристаллов берлинской лазури, Российский химический журнал, том 42, № 1-2, 1998. - С. 86-95; V. В. Nechitayilo, V. I. Styopkin, Z. A. Tkachenko, Yu. G. Goltsov, V. P. Sherstyuk, V. V. Zhilinskaya, Stmcture and electrochromic properties of ferric aquapentacyanoferrate - a new analogue ofpmssian blue, Electrochimica Acta, v. 40, № 15, 1995, pp. 2501-2504. Модифікація металевої поверхні біологічного оптоелектронного перетворювача на поверхневому плазмонному резонансі складалася з таких операцій: 1. Формування самоорганізованої моношарової плівки алкантіола, що закінчується функціональною групою - СООН, на металевій поверхні перетворювача шляхом занурення призми з металевою плівкою в 1 mM розчин HS(CH2)15COOH у етиловому спирті на 24 години з наступним промиванням у чистому етанолі та сушінням у потоці чистого повітря. 2. Формування на плівці алкантіола багатошарової плівки амінопентацианоферату міді - Сu3[Fe(CN)5NH3]2 почерговим витримуванням призми у водяних розчинах, що містять іони Сu2+ і [Fe(CN)5NH3]3+: а) Занурення призми у розчин CuS04 (5-10-4 М) для формування шару міді. Термін контакту з поверхнею - 10 хвилин з наступним промиванням у дистильованій воді. б) Занурення призми у розчин Na3[Fe(CN)5NH3] (5-10-4 М) для формування шару амінопентацианоферату міді. Термін контакту - 1 хвилина з наступним промиванням у дистильованій воді. У такий спосіб одержують плівку що містить 510 шарів амінопентацианоферату міді на поверхні оптоелектронного перетворювача. Кількість шарів визначено експериментальне виходячи з умови оптимальної роботи перетворювача. Такий перетворювач використовують для орієнтованої іммобілізації імуноглобулінів, наприклад антитіла кози поти фібриногену людини, із метою проведення специфічної імунної реакції з фібриногеном людини. На фіг. 3 приведені сенсорограми кінетики адсорбції антитіла кози проти фібриногену людини (Б-момент інжекції розчину з концентрацією 100 мкг/мл) і його взаємодії з фібриногеном людини (Вмомент інжекції розчину з концентрацією 100 мкг/мл) на вільній поверхні золота (І) і на поверхні, що містить орієнтуючу неорганічну багатошарову плівку амінопентацианоферату міді. Значне збільшення у відгуку для модифікованої поверхні свідчить про те, що імуноглобулін адсорбується на поверхні в щільнозапакований шар, а його контрольована орієнтація призводить до специфічної взаємодії один - до одного. 3 37078 Фіг. 1 Фіг. 2 4 37078 Фіг. 3 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 5