Спосіб визначення антимікробної активності бактисубтіла

1. Спосіб визначення антимікробної активності бактисубтіла за умов сумісного культивування мікроорганізмів в живильному середовищі, який відрізняється тим, що сумісно культивують па тогенні та умовно патогенні ентеробактерії, стафілококи у м'ясопептонному бульйоні та з дріжджоподібними грибами роду Candida у середовищі Сабуро. 2. Спосіб по п.1, який відрізняється тим, що патогенними та умовно патогенними ентеробактеріями є штами Escherichia coli К 12, Escherichia coli Hly+, Escherichia coli О55:K59, Klebsiella freundii. 3. Спосіб по п.1, який відрізняється тим, що стафілококами є штам Stafilococcus aureus ATCE25923 та антибіотикорезистентний штам Stafilococcus aureus. 4. Спосіб по п.1, який відрізняється тим, що дріжджоподібними грибами є штами Candida albicans 7 та Candida albicans. Зоя В пробірки (4,5 мл) засівали 1,2 мільярда мікробних клітин в 1 мл (1,2 млрд/мл - 11,3 ± 0,07 lg КУО/мл) B.cereus і таку ж кількість тест-штаму. Через 24 години (добу) сумісної інкубації із пробірок відбирали по 0,1 мл інкубаційної суміші і готували 10-кратні розведення у стерильному фізрозчині. Із всіх пробірок титраційного ряду висівали по 1 мл на тверде живильне середовище (МПА і Сабуро) і інкубували впродовж доби, а на середовищі Сабуро - 2 доби. По закінченню цього періоду (13) 40901 (11) UA (бактерійний препарат фірми Hoest Marion Rassel (США). Поставлена задача досягається тим, що антимікробну активність Bacillus cereus IP5832 (мікроорганізм, що складає активний лікувальний фактор бактисубтіла) стосовно до клінічних тест-штамів ентеробактерій, стафілококів та кандид, виділених від хворих на неспецифічні захворювання легень (хронічні бронхіти, бронхіальна астма) м.Чернівці, вивчали методом сумісного культивування в м'ясопептонному бульйоні (МПБ) окремо з ентеробактеріями, стафілококами та в рідкому середовищі Сабуро - з кандидами. В роботі використовували однодобові культури мікроба-антагоніста, ентеробактерій та стафілококів. Бактеріологічним методом визначали кількість життєздатних (колонійутворюючих) клітин мікроба-антагоніста та тест-штамів у живильному середовищі. (19) Винахід відноситься до галузі медицини, а саме до мікробіології, і може бути використаним в експериментах та клініці для вивчення та лікування кишкових дисбактеріозів, які виникають у результаті інфекційних та неінфекційних захворювань. Однією із проблем сучасної клінічної гастроентерології, а також терапії інфекційних захворювань є порушення кишкового біоценозу, частота якого досягає у дітей 70-90%, а у дорослих - від 42 до 88%. У більшості випадків порушення біоценозу кишечнику є ускладнення інфекційних та неінфекційних захворювань. Дисбактеріози у всіх випадках погіршують перебіг як інфекційного, так і соматичного захворювання, порушують стан здоров'я, знижують як неспецифічну, так і специфічну імунну протиінфекційну резистентність організму людини. Одним із загальноприйнятих методів попередження та лікування порушень мікроекології кишечнику є використання пробіотиків - лікарських препаратів, що містять бактерії, які входять до складу автохтонних облігатних мікроорганізмів. В окремих випадках використовують транзиторні бактерії (бактисубтіл та інші). Саме останні привертають до себе на сьогодні увагу лікарів, оскільки бактисубтіл містить B.cereus, що продукують рекомбінантний інтерферон. Задачею запропонованого винаходу є спосіб визначення антимікробної активності бактисубтілу А ____________________ 40901 інкубації підрахували колонії тест-штамів, що виросли на відповідному середовищі. Вихідний популяційний рівень життєздатних (колонійутворюючих) еталонних музейних (S.aurerus ATCE 25923, C.albicans 7, E.coli К 12) та клінічних тест-штамів мікроорганізмів в дослідних пробірках не відрізнявся від популяційного рівня в контрольних пробірках, куди не вносився мікробантагоніст (р>0,05) (таблиця 1). Через 24 години сумісного інкубування мікроба-антагоніста і тест-штамів різних видів музейних та клінічних штамів мікроорганізмів визначено, що мікроб-антагоніст (B.cereus) призводить до зниження популяційного рівня як музейного штаму золотистого стафілокока. Найбільш виражена інгібуюча активність бактисубтіла через 24 години встановлена стосовно музейного штаму ешерихій, а також гемолітичних та ентеропатогенних клінічних варіантів кишкових паличок та умовно патогенних ентеробактерій (цитробактера і клебсієл), які найчастіше виявляються у хворих на кишковий дисбактеріоз. Бактисубтіл через 24 години практично не впливає на популяційний рівень дріжджеподібних грибів роду Candida. Сумісне культивування мікроба-антагоніста з тест-штамами впродовж 2-х діб визначило посилення антагоністичної дії мікроба-антагоніста (бактисубтіла) на стафілококи та ентеробактерії. Більш інтенсивна інгібуюча дія бактисубтіла на популяційний рівень патогенних та умовно патогенних ентеробактерій встановлена через 48 годин. Сумісне культивування впродовж 2 діб бактерійного препарату і дріжджеподібних грибів стимулює розвиток останніх, і їх популяційний рівень при цьому зростає. При сумісному культивуванні бактисубтіла з клінічними та музейними тест-штамами впродовж 3 діб продовжував зменшуватися популяційний рівень клінічних та музейних штамів стафілокока. Популяційний рівень контрольних культур клінічного та музейного штамів ентеробактерій залишається на рівні 3-х добового періоду. Популяційний рівень цих же тест-ентеробактерій продовжує знижуватися. Популяційний рівень кандид, що культивуються впродовж 72 годин разом із бактисубтілом, ідентичний такому ж показнику контрольних дослідів. Продовження сумісного культивування бактисубтіла з музейними та клінічними штамами стафілококів, ентеробактерій та кандид упродовж 96 годин (4 доби) показало, що B.cereus продовжує значно знижувати популяційний рівень музейних та клінічних антибіотикорезистентних штамів стафілококів, особливо патогенних та умовно патогенних ентеробактерій. В цей період спостерігається незначне зниження популяційного рівня кандид. Через 7 днів бактисубтіл не впливає на популяційний рівень стафілококів, особливо на клінічні штами, але продовжується значне (майже в 2 рази) зниження популяційного рівня патогенних та умовно патогенних ентеробактерій (гемолітичних та ентеропатогенних ешерихій, цитробактера і клебсієл). При цьому значно підсилюється вплив бактисубтіла на популяційний рівень кандид (8,85±0,08 lg КУО/мл проти 11,89±0,06 lg КУО/мл в контролі). Тобто, бактисубтіл за сумісного культивування починає знижувати популяційний рівень умовно патогенних стафілококів вже через 24 години і такий вплив зберігається до 4-х діб. Після цього інгібуюча дія на популяційний рівень поступово знижується і через 7 діб її дія призупиняється, тобто бактисубтіл ефективний тільки впродовж перших 4-х діб. Таким чином, застосування даної методики дозволяє встановити антимікробну активність бактисубтілу стосовно патогенних та умовно патогенних ентеробактерій, стафілококів та дріжджеподібних грибів роду Candida. Це вказує на відповідність даного винаходу критерію "позитивний ефект". Вплив бактисубтіла на популяційний рівень патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів Мікроорганізми К-ть штамів Популяційний рівень (в Іg КУО/мл) Контроль Дослід 2 р 40901 Продовження таблиці Мікроорганізми K.pneumoniae К-ть штамів 3 Популяційний рівень (в Іg КУО/мл) Контроль Дослід 14,09±0,04 3 11,17±0,03 р