Спосіб визначення каталазної активності базидіоміцетів

Спосіб визначення каталазної активності базидіоміцетів, який включає стадії утворення стійкого забарвленого комплексу перекису водню з солями молібдену, вимірювання його оптичної густини, як/.й відрізняється тим, що включає культивування штамів, гомогенізацію соматичних структур або плодових ти І макроміцетів у буферному розчині чи дистильованій воді, ліофільне центрифугування, додавання до культурального фільтрату або надосадової рідини гомогенізату мщелію розчину перекису водню, зупинку реакції" додаванням молібдату амонію. Винахід відноситься до мікробіологічної промисловості, а саме до способів визначення каталазно'і активності культур базидіоміцетів. Спосіб визначення каталазної активності культур базидіальних грибів може бути використаний у наукових мікологічних дослідах і у аналізі ферментативної активності при промисловому культивуванні макроміцетів - продуцентів біологічно активних речовин для харчової', медичної і хімічної промисловостей. Вивчення протеолізу базидіоміцетіа - перспективних об'єктів біотехнології фізіологічно активних речовин є одним з важливих напрямків розвитку сучасної біології [ 1 , 2, 9]. Ферментативна активність макроміцетів залежить від факторів навколишнього середовища |3j. Фермент катал аза широко розповсюджений у природі Каталазна активність спостерігається у рослин і мікроорганізмів, за виключенням облігатних анаеробів. Сутність каталітичної дії каталази полягає в розкладанні пероксиду водню, що утворюється при дисмутацн супероксидного аніону і при аеробному окисленні відновлених флавопротеїдів з виділенням молекулярного кисню. Каталаза відноситься до ферментів, що найбільш довго зберігають свою високу активність, майже не потребують енергії активації, швидкість реакції цього ферменту обмежується лише швидкістю дифузії субстрату до активного центру [3, 8]. Тому, каталаза поряд з іншими ензимами, у численних дослідах використовується як маркерний фермент, що адекватно відображає реакцію організмів на зміну умов (факторів) живильного чи навколишнього середовищ. Не дивлячись на високу активність ферменту, досі не існує чутливих способів ЇЇ визначення, які були б придатні до широкого використання у мікологічній лабораторній практиці і відповідали умовам наукових досліджень. Відом* способи визначення каталззної активності титруванням, Титрометричними способами визначають КІЛЬКІСТЬ розкладеного перекису зодню на протязі визначеного часу (8]. Ці методи відрізняються низькою чутливістю, вони достатньо складні і трудомісткі. Для дослідження каталазної активності рослин широко застосовується метод визначення активності ферменту у модифікації О.і. Єрмакова, заснований на вимірі об"єму кисню, що утворився після додавання до водного екс факту каталази перекису водню. Кількість утвореного КЙСЧЮ вштрюють газометричним способом ка спеціально зібраному приладі [7]. При визначенні активності ферменту у невеликих пробах рослинного матеріалу пропонується використовувати апарат Варбурга. Важливою частиною апарату є манометрична трубка, яка заповнюється забарвленою рідиною. Принцип роботи приладу - газометричний [7J. Обидва методи пристосовані до постановки у лабораторних умовах, не потребують коштовного обладнання. Недолтами цих способів є низька чутливість, що не влаштовує вимоги наукових досл'джень Не можливо враховувати достатньо точними способи визначення активності каталази за висотою утвореної піни над розчином перекису водню при внесенні проби «и за швидкістю спливання паперового диску, змоченого пробою і зануреного в розчин перекису водню [15]. со 39243 Запропоновані способи визначення каталазної активності з використанням кисневого електроду Кларку [16, 17] та полярографічні методи [12 - 14] точн1! і достатньо адекватні для клінічних і експериментальних медичних досліджень. До недоліків цих способів відноситься коштовність спеціального обладнання, не пристосованого до мікологічного матеріалу. Найбільш близьким за технічною суттю і досяжності результату є спосіб визначення активності каталази у біологічних медичних рідинах, що передбачає використання спектрофотометрів широко розповсюдженої' аналітичної' апаратури клініко-біохімічних лабораторій. Відмічається, що спосіб заснований на здатності перекису водню утворювати з солями молібдену стійкий забарвлений комплекс [б, 11]. Проте, запропонований спосіб визначення каталазної активності розглядається з умов аналізу активності сироватки крові або гомогенату тканин внутрішніх органів людини, що не влаштовує вимоги проведення наукового досліду з мікологічним матеріалом [6]. В основу винаходу поставлено завдання розробки способу визначення каталазної активності культур базидіоміцетів, у якому завдяки модифікації метода і включення до його гомогенізації соматичних структур чи плодових тіл макроміцетів і ліофільного центрифугування водної мщеліальної суспензії" він є придатним до застосування у лабораторних мікологічних дослідженнях з залученням сучасної апаратури, за рахунок чого розширюються можливості аналізу і експериментів. Поставлене завдання вирішується тим, що спосіб визначення каталазної активності базидіоміцетів, який містить стадії утворення стійкого забарвленого комплексу перекису водню з солями молібдену, вимірювання його оптичної густини, згідно винаходу включає культивування штамів, гомогенізацію соматичних структур або плодових тіл макроміцетів у буферному розчині чи дистильованій воді, ліофільне центрифугування, додавання до культурального фільтрату або надосадовоі рідини гомогенізату міцелію розчину перекису водню, зупинку реакції додаванням молібдату амонію. Приклад конкретного виконання. Визначити каталазну активність культурального фільтрату, вегетативного міцелію або плодових тіл базидіоміцету, наприклад Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. Для отримання плодових тіл, обрані штами гриба Flammulina velutipes культивують на зволоженому лігно-целюлозному субстрат», а з метою отримання вегетативного міцелію - на рідкому живильному середовищі у колбах при оптимальних, попередньо визначених для обраного штаму, значеннях рН, температури, вологості та ін. [4, 5]. Після встановленого часу росту, міцелій мікологічним списом виймають з культиваційних колб, промивають дистильованою водою і просушують на фільтрувальному папері. Плодові тіла гриба зрізають з субстрату, фіксують вік і штам Flammulina velutipes, до якого вони належать. Звішують окремо міцелій і плодові тіла. Готують міцеліальний гомогенат (МГ): у фарфоровій ступці розтирають 100 мг міцелію чи плодового тіла з битим склом у 1 мл трис-НСІ буферу (0.05 М, рН 7,8) або дистильованою водою. Враховуючи те, що дія каталази мало залежить від температурного і рН факторів, МГ можна готувати у фарфоровій ступці розтираючи 1 г міцелію (плодового тіла) охолодженого до температури не вище +5°С з 1 мл дистильованої води. Якщо маса міцелію мала, роблять розведення у потрібну кількість раз; розведення гомогенату враховують при остаточному підрахунку ферментативної активності. Гомогенат ліофільно центрифугують 5-7 хвилин при 500д. Надосадову рідину МГ зливають у відповідно підписані пробірки. В чисту суху пробірку наливають 0,1 мл культурального фільтрату (КФ) або надосадової рідини центрифугованого МГ, додають 2 мл 0,03% розчину перекису водню, який готують безпосередньо перед дослідом. В контрольну пробу замість КФ чи МГ наливають 0,1 мл дистильованої води. Дія каталази мало залежить від температурного фактору, але бажано дослідні пробірки витримувати при температурі +25°С. Через 10 хвилин реакцію зупиняють додаючи 1 мл 4% розчину молібдату амонію. Кількість солі молібдену пропорційна початковому вмісту перекису водню. В дослідних і контрольній пробірках спостерігають утворення стійкого жовтого забарвлення. Забарвлення може бути відсутнє в дослідних пробах, як наслідок повного розкладу НгО г під дією ферменту. Інтенсивність забарвлення дослідних і контрольного розчинів вимірюють проти дистильованої води на спектрофотометрі при довжині хвилі 410 нм. Активність каталази розраховують за формулою: Е = (Ак - Ad) V • t • к р (мкат/л) [6], де Е - активність каталази - стандартна одиниця ферментативної активносте (мкат/л), Ак і Ad - екстинкція контрольної та дослідних проб, V - об'єм проби, що вносили (0,1 мл), t - час інкубації (600 с), к - коефіцієнт мілімолярної екстинкції перекису 3 1 водню, який дорівнює 22,2 • 10 мМ' , р - коефіцієнт розведення. Розрахунок каталазної активності вегетативного міцелію. Екстинкція дослідної проби дорівнює: А