Спосіб визначення антиокисної активності культур базидіоміцетів

Спосіб визначення антиокисної активності культур базидіоміцетів, що містить підготовку суспензії ліпопротеїдів жовтка курячих яєць, який відрізняє ться тим, що включає культивування штамів, підготовку культурального фільтрату до аналізу, гомогенізації грибних тканин - соматичних 40415 речовин, які мають антиокисну активність та обмежують розвиток надмірного ПОЛ в міцелії [2, 1416]. У зв'язку з вище зазначеним, питання опрацювання надійного, легко відтворюваного в лабораторних умовах способу визначення антиокисної активності (АОА) базидіальних грибів є актуальним. Відомі багаточисельні модифікації методу визначення рівню перекисного окислення ліпідів в медичних рідинах, головним чином в сироватці крові хворих. Це прості і адекватні тести з тіобарбітуровою кислотою (ТБК) оцінки підвищеного рівня ПОЛ. На жаль, ці тести не дозволяють виявити всі продукти, що реагують з ТБК, або ведуть до великої похибки при визначенні із-за розвитку неспецифічного забарвлення. Відомо, що ТБК може реагувати з ліпідами, амінокислотами, вуглеводами, однак основним продуктом, що реагує з ТБК є малоновий діальдегід (МДА). МДА утворюється при переокисленні поліненасичених жирних кислот, які мають у складі 2-3 дієнові зв'язки. Дві молекули ТБК реагують з однією молекулою МДА [1]. З початку, вміст МДА дуже незначний і 98% його утворюється в процесі проведення ТБК - тесту при розкладанні гідроперекисів [1, 17]. В залежності від умов реакції (способу обробки біологічного матеріалу, часу кип'ятіння проби, величини рН, наявності іонів металів) оцінка вмісту продуктів ПОЛ, які реагують з ТБК, може значно варіювати, що є значним недоліком способів [1]. На основі аналізу методичних підходів до визначення перекисів ліпідів в тесті з ТБК, запропоновано модифікацію цього методу [1]. Його ефективність підтверджено в медичних експериментах і в ході клінічних досліджень. До недоліків зазначеної модифікації відноситься висока специфічність аналізу, розробленого для сироватки і плазми крові. Найбільш близьким за технічною суттю і досяжності результату є спосіб визначення антиокисної активності плазми крові, який передбачає уживання модельної системи, що представляє собою суспензію жовткових ліпопротеїдів (ЖЛП) курячих яєць. Обрана модель має переваги: вона доступна, виділення ліпопротеїдів здійснюється легко, модель стабільна при зберіганні і разом з тим має високу здатність до окислення. Використання у аналізі спектрофотометрів, широко розповсюдженої аналітичної апаратури клініко-біохімічних лабораторій, робить цей спосіб достатньо науковим, доступним і адекватним поставленим цілям. Проте, даний спосіб визначення антиокисної активності плазми крові не влаштовує вимогам проведення досліду з мікологічним матеріалом і не відповідає характеристиці об'єкту досліджень [17]. В основу винаходу поставлено завдання розробки способу визначення антиокисної активності культур базидіоміцетів шляхом модифікації метода оцінки АОА плазми крові з використанням жовткових ліпопротеїдів, за рахунок чого він є більш доступний у мікологічному лабораторному аналізі, розширюються можливості дослідів, зменшується похибка аналізу. Поставлене завдання вирішується тим, що спосіб визначення антиокисної активності культур базидіоміцетів, який містить підготовку суспензії ліпопротеїдів жовтка курячих яєць згідно з прототипом, включає етапи культивування штамів мак роміцетів, підготовку культурального фільтрату (КФ) до аналізу, гомогенізації грибних тканин - соматичних структур чи плодових тіл макроміцетів і ліофільного центрифугування міцеліальної суспензії, а також додаванням до суспензії ЖЛП культурального фільтрату чи надосадової рідини міцеліального гомогенату (МГ) у фосфатному буфері, ініціації ПОЛ додаванням до проб розчину сірчанокислого заліза, після інкубації доливанням до суміші трихлороцтової кислоти (ТХО) і розчину іонолу в етанолі, центрифугування, додавання до супернатанту ТБК -реагенту, витримування суміші в киплячий водяній бані, після охолодження додавання хлороформу і центрифугування, після цього вимірювання оптичної густини у водній фазі контрольної і дослідних пробах. Приклад конкретного виконання. Визначити антиокисну активність культурального фільтрату, вегетативного міцелію або плодових тіл базидіоміцету, наприклад, Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. В аналізі використовують плодові тіла грибів, зібрані в природних умовах або вирощені штучно. Для отримання плодових тіл в штучних умовах, обрані штами зимового гриба - Flammulina velutipes - культивують на зволожених нехарчових лігно-целюлозних відхода х сільськогосподарського виробництва або деревопереробної промисловості. З метою отримання вегетативного міцелію, гриб вирощують на рідкому живильному середовищі у колбах. Культивування проводять при оптимальних, попередньо визначених для обраного штаму, значеннях рН, температури, вологості та ін. [5, 7, 10-12]. Після встановленого часу росту, міцелій виймають з культиваційних колб мікологічним списом, промивають дистильованою водою і просушують на фільтрувальному папері. Плодові тіла гриба зрізають з субстрату, фіксують їх вік і штам зимового гриба, до якого вони належать. Культуральну рідину, у випадку культивування на рідкому живильному середовищу, фільтрують на фільтрувальному папері. Окремо звішують плодові тіла і міцелій. Заморожують при температурі -5°С. Готують фосфатний буфер (рН 7,45). Міцеліальний гомогенат (МГ) готують наступним чином: у фарфоровій ступці розтирають 1 г міцелію чи плодового тіла у 2 мл фосфатного буферу. Якщо маса міцелію мала, роблять розведення фосфатним буфером у потрібну кількість раз; розведення гомогенату враховують при остаточному підрахунку антиокисної активності. Гомогенат ліофільне центрифугують 5 - 7 хвилин при 500 g. Надосадову рідину МГ зливають у відповідно підписані пробірки. Готують суспензію жовткових ліпопротеїдів. Вміст курячого яйця кладуть у стаканчик з харчового пластику, обережно зливають білок, стежачи за тим, щоб жовток залишався цілим. Піпеткою на 5 мл обережно проколюють поверхню жовтка і відбирають 5 мл його умісту. Жовток виливають в колбу, залишив піпетку носиком до низу, поки жовток не стече з її стінок. Тією ж піпеткою набирають 5 мл фосфатного буфер у і додають до жовтка, ретельно перемішують. Суспензію зберігають при температурі 2-4°С не більше тижня. Перед засто 2 40415 суванням, суспензію розбавляють тим же буфером в 25 разів. Готують реактив з тіобарбітуровою кислотою (ТБК - реактив). До 0,15 г тіобарбітурової кислоти та 0,09 г додецилсульфату натрію додають дистильовану воду об'ємом 29,76 мл. Суміш підігрівають на водяній бані температурою +90°С, постійно перемішуючи до повного розчинення компонентів. Для приготування розчину сірчанокислого заліза беруть 0,695 г солі FeS04 і розчиняють дистильованою водою в мірній колбі на 100 мл, доводячи об'єм розчину до позначки. Для двох штамів, за умови проведення досліду у трьох повторностях, потрібно 8 чистих сухих пробірок об'ємом по 10 мл, які маркіруються наступним чином: І -(1 штам), II - (2 штам). І1 , І 2, І3 повторності, К - контроль, 0 - нульова проба. В кожну пробірку, крім 0, вливають по 1 мл ЖЛП. В дослідні пробірки додають по 1 мл КФ або МГ, в контрольну - фосфатний буфер; потім в кожну пробірку додають по 7 мл , а в нульову - 9 мл, фосфа тного буферу. Всі пробірки ставлять на водяну баню при температурі 37°С. Туди ж ставлять 10 чистих сухих пробірок об'ємом по 10 мл. У всі пробірки з реакційною сумішшю додають по 1 мл розчину сірчанокислого заліза, починаючи з першої, з проміжком в 15 секунд. Суміш перемішують. З кожної пробірки, крім нульової, відбирають по 2 мл суміші і вливають у чисті пробірки. Постійно і ретельно піпетку промивають фосфатним буфером. У нові пробірки додають по 1 мл ТХО з проміжком часу в 15 секунд. Починаючи з першої пробірки відраховують 15 хвилин з початку реакції. Нові пробірки маркірують, як і попередні з додаванням знаку "°" : І1° - що є нульовий рівень окислення. Витримують пробірки у водяній бані при t=37°С, перемішуючи уміст реакційних пробірок. Через 11 хвилин, з усіх пробірок відбирають і переносять по 2 мл суміші в 8 чистих пробірок; а через 15 хвилин додають по 1 мл ТХО, починаючи з 1-ї і з перервою в 15 секунд. Ці пробірки маркірують, як і попередні, додаючи знак t. Уміст пробірок переносять в центрифужні пробірки. Центрифугують 15 хв., при 1500 g. Після центрифугування, з центрифужних пробірок відбирають по 2 мл розчину і переносять в чисті пробірки. В кожну пробірку додають по 1,8 мл ТБК - реактиву і кип'ятять в водяній бані на протязі 15 хвилин. Пробірки охолоджують і в кожну додають по 2 мл хлороформу, ретельно перемішуючи. Суміш центрифугують 10 хвилин при 2000 g, обережно відбирають верхню водневу фаз у рідини у чисті пробірки. Далі на спектрофотометрі в водній фазі вимірюють оптичну густину контрольної та дослідних проб проти нульової проби при довжині хвилі 532 нм. Антиокисну активність мікологічного матеріалу розраховували за модифікованою формулою [17]: AOA = D DК - D DКФ (МГ ) DDК × р × 100%, де: DDК = DtК – D 0К, DDКФ(МГ) = DtКФ(МГ) – D 0КФ(МГ); D0К, D0КФ(МГ) - оптична густина, виміряна в суспензії ЖЛП (контрольній пробі) і в суспензії ЖЛП з культуральним фільтратом (міцеліальним гомогенатом) до інкубації; DtК, DКФ(МГ) - оптична густина, виміряна в тих же зразках в момент часу t ( після 15 хвилин інкубації); р - коефіцієнт розведення. Визначення DDК, DDКФ - потрібно для того, щоб врахува ти ви хідний рівень окислення суспензії ЖЛП та культурального фільтрату чи міцеліального гомогенату. При визначенні та розрахунку антиокисної активності мікологічного матеріалу можливі як позитивні так і негативні значення. Від'ємна АОА співпадає за абсолютним значенням з позитивною окисною активністю. Таким чином, спосіб визначення антиокисної активності культур базидіоміцетів, який пристосовано до мікологічного матеріалу з включенням операцій по фільтрації культуральної рідини, гомогенізації соматичних структур чи плодових тіл макроміцетів і ліофільного центрифугування міцеліальної суспензії дозволяє застосовувати його у лабораторних мікологічних дослідженнях з залученням сучасної апаратури, за рахунок чого розширюються можливості аналізу антиокисної активності, зменшується похибка аналізу як при промисловому культивуванні макроміцетів - продуцентів біологічно активних речовин для медичної, харчової і хімічної промисловостей так і в наукових мікологічних дослідженнях. Джерела інформації. 1. Андреева Л.И., Кожемякин Л.А., Кишк ун А.А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой // Лаб.дело. – 1988. - № 11. - С. 41-43. 2. Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Осадчая О.В. Антиокислительная активность некоторых микро- и макромицетов - деструкторов лигноцеллюлозных субстратов // Прикладная биохимия и микробиология. - 1997. - 33, № 5. - С. 559-563. 3. Бараненко В.В., Жадько C.I., Сиваш О.О. Перекисне окислення ліпідів та антиоксидантна активність Alisma plantago-aquatica L. (Alismataceae vent.) в різних природних умовах водозабезпечення // Укр. ботан. журн. - 1999. - 56, № 4. - С. 347351. 4. Белова Н.В., Ефремова И.Я. Препараты из высших грибов - объект патентно-правовой охраны // Микология и фитопатология. - 1992. -26, вып. 4. С. 321-324. 5. Бисько Н.А., Бухало А.С., Вассер С.П. и др. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. - Киев: Наук. думка, 1988. - 144 с. 6. Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Перекисное окисление липидов мембран и природные антиоксиданты // Успехи химии. - 1985.- 54, № 9. - С. 15401558. 7. Бухало А.С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. - Киев: Наук. думка, 1988. 144 с. 8. Бухало А.С., Соломко Е.Ф., Митропольская Н.Ю. Базидіальні макроміцети з лікарськими властивос 3 40415 тями // Укр. ботан. журн. - 1996. - 53, № 3. - С. 192201. 9. Дорофеев А.Н., Акимов Ю.А., Русина И.Ф. Природные антиоксиданты: поиски перспективы применения // Тез. докл. III Всесоюз. конф. "Биоантиоксидант". - М. - 1989. - С.252. 10. Дудка И.А., Вассер С.П., Бухало А.С. и др. Промышленное культивирование съедобных грибов. Киев: Наук. думка, 1978. - 264 с. 11. Дудка И.А., Вассер С.П., Элланская И.А. Методы экспериментальной микологии. Справочник. Киев: Наук. думка, 1982. - 550 с. 12. Дудка И.А., Бисько Н.А., Билай В.Г. Культивирование съедобных грибов. - Киев: Урожай, 1992. 160 с. 13. Иевлева Н.Р., Белова М.В., Брагинцева Л.М., Осипов Г.А. Устойчивость липидов гриба Fusarium sambucinum Fckl. к окислению в процессе хранения // Микол. и фитопатол. - 1984. - 18, № 6. - С. 474 - 478. 14. Капич А.Н. Биосинтетическая активность дереворазрушающих базидиомицетов при глубинном культивировании // Микол. и фитопатол. – 1990. 24, № 5. - С. 377 - 384. 15. Капич А.Н., Шишкина Л.Н. Антиоксидантные свойства дереворазрушающи х базидиомицетов // Микол. и фитопатол. - 1992. - 26, № 6. - С. 486 492. 16. Капич А.Н. Антиокислительная активность экстрактов мицелия ксилотрофных базидиомицетов // Микол, и фитопатол.-1995. - 29, № 5-6. С. 35-40. 17. Клебанов Г.И., Бабенкова И.В., Теселкин Ю.О., Комаров О.С., Владимиров Ю.А. Оценка антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных липопротеидов // Лаб. дело. 1988, № 5. - С. 59-62. (прототип). 18. Машковский М.Д. Лекарственные средства .Харьков "Торгсинг". - 1997. - изд. 13. - Т. 2. - 590 с. 19. Сейфулла Р.Д., Борисова И.Г. Проблемы фармакологии антиоксидантов // Фармакол. и токсикол. - 1990. - 53, № 6. - С. 3 - 10. 20. Соломко Э.Ф., Дудка И.А. Перспективы использования высших базидиомицетов в микробиологической промышленности // ВНИСЭТИ: Обзорная информация, сер. 3. - М.,1985. - 48 с. 21. Aоуаmа Т., Nakakita I., Nakagawa M., Sakai H. Screening for antioxidants of microbial origin // Agric. Biol. Chem. - 1982. - 46, № 9. - P. 2369-2371. 22. Eriksson К.-E., Blanchette R.A., Ander P. Microbial and enzymatic degradation of wood and wood components. Berlin, Heidelberg: Springier-Verlag, 1990. 23. Harvey P.I. Recent developments in the understanding of lignin biodegradation // J. Biol. Educ. 1986. - 20, № 3. - P. 169-174. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 4