Ізолят єн-5/2, як продуцент антигену парвовірусу собак (родина parvoviridae, рід parvovirus)

Ізолят ЄН-5/2, як продуцент антигену парвовірусу собак (родина Parvoviridae, рід Parvovirus), 3 44402 4 ної ланцюгової реакції (ПЛР), електронної мікрозміни культури проявлялися заокругленням клітин скопії, реакції гемаглютинації (РГА) з 1% завіссю та збільшенням цитоплазматичних відростків. Кліеритроцитів півня, морської свинки, свині, кішки, тини набували зернистості, а потім відшаровувареакції нейтралізації (РН) зі специфічною сироватлись від скла. Через 120 годин після інфікування кою щодо ізоляту парвовірусу ЄН-5/2 та у РІД, частина клітин моношару містила внутрішньоядевраховували основні патологоанатомічні зміни у рні тільця -включення, у вигляді цільних гранул, інфікованих курячих зародках, цитопатогенну дію серповидної або сферичної форми з чіткими та ізоляту на культури клітин Vero та ФКЕ. рівними межами, що заповнювали майже все ядро Морфологічні особливості вірусу. Ізолят ЄН(Фіг.1). Внутрішньоядерні тільця - включення у 5/2 представлений віріонами округлої форми без культурі Vero (об.х10, ок. х100). Поступово почизовнішньої мембрани, типовий представник родинаючи з 6 доби після зараження, тільця - включенни Parvoviridae. За умов негативного контрастуня виділялися із клітини, а на їх місці утворювавання в екстраембріональної рідини курячих емблись вакуолі. В ядрах відмічали збільшення ріонів вірус має діаметр від 22 до 30 нм. кількості ядерець, які знаходились по периферії. Культуральні властивості. Ізолят ЄН-5/2 реЛокальну деструкцію моношару та вакуолізацію продукується у курячих ембріонах (КЕ), первинноспостерігали на 6 добу (Фіг.2.). Цитопатогенні змітрипсинізованій культурі фібробластів курячих ни культури Vero на 6 добу після інфікування ізоембріонів (ФКЕ) та перещеплюваній культурі нирки лятом парвовірусу ЄН-5/2. Округлення та вакуолізеленої мавпи (Vero). У культурі клітин Vero цитозація окремих клітин (об.х7, 10). Цитопатичний патогенна дія (ЦПД) ізоляту ЄН-5/2 проявляється ефект, викликаний ізолятом ЄН-5/2 с характерним деструктивними змінами клітинного моношару для розмноження парвовірусу собак у культурі через 24 год. після інфікування у вигляді значного клітин. заокруглення, вакуолізації клітин та появою внутПриклад 3. Ізолят парвовірусу ЄН-5/2 стабільрішньоядерних тілець-включень. У культурі ФКЕ но культивується у первинній культурі клітин ФКЕ. повну дегенерацію моношару спостерігали через Цитопатичну дію, що проявлялась деструкцією 72 год. після інфікування. Інфекційна активність моношару, значним заокругленням та зернистістю вірусу у культурі ФКЕ становить 105,25ТЦД50/0,5см3 клітин спостерігали вже через 24 години після інСерологічні властивості. Вірус має гемаглютифікування. Повну дегенерацію моношару реєстрували через 72 години після зараження (Фіг.З.) Цинуючу активність по відношенню до еритроцитів топатична дія ізоляту парвовірусу ЄН-5/2 у свині й кішки та не аглютинує еритроцити морської культурі клітин ФКЕ (об.х10, ок. х100). Титр у кульсвинки та півня. Володіє преципітуючою активністурі клітин ФКЕ становив 105,25ТЦД50/0,5см3. тю у реакції імунодифузії (РІД) зі специфічними Приклад 4. Гемаглютинаційну активність ізогіперімунними сироватками. Основні умови зберігання. Ізолят зберігається ляту ЄН-5/2 визначали по відношенню до 1 % завісі еритроцитів півня, морської свинки, свині та у морозильних шафах при температурі -20 °С у кішки. Дворазові розведення вірусу готували на лабораторії вірусології науково-виробничого фізіологічному розчині (рН=6,0) для визначення центру ветеринарної медицини птахівництва Лурівня гемаглютининів з еритроцитами свині та кішганського національного аграрного університету. ки. Реакцію проводили за температури + 4°С. Вірусний ізолят ЄН-5/2 відноситься до родини Встановлено титр гемаглютининів до еритроцитів Parvoviridae, рід Parvovirus. свині 1:64, кішки 1:8. Впродовж пасажів титр гемаПідтримання штаму проводять шляхом репроглютииинів із еритроцитами свині знижується до дукції на курячих ембріонах та чутливих культурах 1:16. Для гемаглютинації із еритроцитами півня та клітин. морської свинки використовували фіз. розчин рН Ізолят ЄН-5/2 парвовірусу собак має слідуючи 7,2, t +37,2°C. Ізолят ЄН-5/2 не аглютинував еритбіологічні властивості. роцити морської свинки та півня, що також підтвеПриклад 1. Патологічні зміни в заражених курджує його належність до парвовірусу собак. рячих ембріонах (КЕ) 9 - добової інкубації патолоПриклад 5. Ідентифікацію ембріонального та гічним матеріалом з метою ізоляції парвовірусу, культурального матеріалу ізоляту ЄН-5/2 та встасупроводжувалися: потовщенням, гіперемією, кроновлення аутентичності щодо парвовірусу собак вовиливами, та утворенням тяжів на хоріоналантопроводили у ПЛР. Ізоляцію сумарної ДНК провоісній оболонці (ХАО), а також неправильним полодили за допомогою набору для екстракції ДНК женням зародків й крововиливами на його тілі. При виробництва фірми АмпліСенс, Москва, Російська розтині ембріонів реєстрували гіперемію легень та Федерація. Реакцію ампліфікації з визначенням серця, глинистий колір печінки. Із збільшенням належності ДНК збудника до парвовірусу собак кількості пасажів у КЕ деякі патологічні зміни стапроводили за допомогою комерційних наборів вали менш інтенсивними. Титр ізоляту ЄН-5/2 піспраймерів виробництва фірми АмпліСенс «Парволя 1-го пасажу па курячих ембріонах становив Вір» (довжина амплікону 385 п.н.), що фланкують 104,25ЕІД50/0,2см3 ділянку NS1 або VP2 генів. Ампліфікаційний режим Приклад 2. У перещеплюваній культурі клітин включав слідуючи цикли: ініціальну денатурацію, Vero ізоляї ЄН-5/2 викликав цитопатичний ефект денатурацію, віджиг праймерів, і елонгацію, фіна(ЦПЕ) через 24 години після інфікування. Клітини льну елонгацію. Електрофоретичний аналіз ампVero впродовж 10 - 13 пасажів вирощували на селіфіконів проведений за допомогою набору для редовищі 199 та Ігла (50:50) з додаванням плазелектрофорезу виробництва НВО Нарвак, Москва, мозамінюючого розчину геосену (10%) та антибіоРосійська Федерація. Концентрація агарози в гелі тиків: натрієва сіль бензилпеніциліну та сульфату 1,5 %, сила струму 120 В. стрептоміцину по 100 ОД/см3. Перші морфологічні 5 44402 6 За результатами ПЛР встановлено, що досліантитіл 2 log2 у РІД до ізоляту ЄН-5/2 на 100% джувальиа ДНК ізоляту ЄН- 5/2 специфічно реагує нейтралізувала інфекційну активність вірусу у перз системою праймерів генів парвовірусу собак. винній культурі клітин ФКЕ у розведенні 1:4. У розНа Фіг.4 зображені результати ампліфікації веденні 1:8 - тільки у 75% тест - об'єктів, а від 1:16 проб ДНК польового ізоляту ЄН-5/2 (1,2), К+- позидо 1:64 блокувала прояв цитопатичної дії у 25%. тивний контроль, К~- негативний контроль. Титр віруснейтралізуючих антитіл специфічної Приклад 6. Первинну детекцію вірусвміщуючосироватки становив 1:27,7. го матеріалу СН-5/2 проводили з гіперімунною Приклад 8. Визначення морфологічних особсироваткою від кролів щодо референтного штаму ливостей ембріонального матеріалу ЄН-5/2 І папарвовірусу собак (вакцина „Біовак РА") у РІД. Відсажу проводили за допомогою електронної мікросутність аденовірусної інфекції контролювали у скопії методом негативного контрастування. В РГА щодо еритроцитів морської свинки. Подальшу якості плівки-підложки застосовували 0,3% розчин індикацію ізоляту парвовірусу ЄП-5/2 проводили за формвару, розчиненого у хлороформі. Після нанедопомогою специфічних гіперімунних сироваток, сення контрастуючого розчину (4% водний розчин отриманих до ізоляту парвовірусу собак ЄН-5/2 від фосфорно-вольфрамової кислоти, рН 6,7-6,8) сітку досліджували в електронному мікроскопі ПЕМкролів з преципітуючою активністю 2,04±0 log2; 125К у прискореній напрузі 75 кВ. 3,5±0,5 log2; 4,5±0,5 log2 у РІД методом ОухгерлоЗа умов негативного контрастування встаноні. Використовували агар 1,5% пофарбований мевили характерні для парвовірусу собак вірусні частилоранжем та консервований мерііолятом натрію. тки без зовнішньої мембрани, округлої форми, При дослідженні ембріонального (І пасаж) та кульрозміром 22-25 нм. У полі зору віріони розташовутурального (II пасаж) матеріалу встановлена конвалися групами попарно. Зустрічалися віріони центрація антигену на рівні 7 log2 та 6 log2 відповіовальної форми довжиною 30 нм, шириною 27 нм. дно. На Фіг.5. представлені результати титрування На і Фіг.6. зображені віріони ізоляту парвовірусу ізоляту парвовірусу ЄН-5/2 за методом Оухтерлоні собак СН-5/2. Негативний контраст (збільш, х з використанням специфічної сироватки з активні100000). стю 4,5 log2. Вірусний ізолят ЄН-5/2 парвовірусу собак усПриклад 7. Ідентифікацію ізоляту парвовірусу пішно культивується в 9-добових курячих зародЄН-5/2 та визначення віруснейтралізуючих антитіл ках, адаптується до культури клітин Vero та перу сироватці проводили у реакції нейтралізації (РН) винної культури ФКЕ, може бути використаний для із постійною дозою антигену та дворазовим послінакопичення біомаси, для виробництва діагностидовним розведенням специфічної сироватки у печних антигенів та вакцинних препаратів, отриманрвинній культурі клітин ФКЕ. ня гіперімунних сироваток від тварин-донорів. Результати РН парвовірусу ЄН-5/2 свідчать, що гіперімунна сироватка з титром преципітуючих 7 44402 8 9 Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков 44402 Підписне 10 Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601