Пристрій для отримання і дозованої подачі оксиду азоту no і побудови кривих дисоціації оксигемоглобіну в присутності no

1 Пристрій для отримання і дозованої подачі оксиду азоту NO і побудови кривих дисоціації оксигемоглобіну в присутності NO, що містить синтезуючий вузол, який відрізняється тим, що додатково має дозуючий вузол, вузол для деоксигенацм рідин і їх вимірювання і вузол для контролю вакууму і дозованої подачі повітря, причому усі вузли з'єднані між собою скляними шліфами або вакуумними шлангами з вакуумними кранами і переходниками 2 Пристрій по п 1, який відрізняється тим, що синтезуючий вузол складається з об'єму для розчину аскорбінової кислоти і об'єму для кристалів NaNO2, з'єднаних між собою скляною трубкою, причому ко жний об'єм має завантажувальний отвір 3 Пристрій по п 1, який відрізняється тим, що дозуючий вузол має змінний об'єм за рахунок розміщення в ньому скляних кульок і за допомогою двоходового вакуумного крана з'єднаний з U-подібним скляним манометром, який заповнений забарвленою дистильованою водою, який через двоходові крани і перехідник з однієї сторони з'єднаний з триходовим краном, що пов'язаний вакуумними шлангами з вузлом для деоксигенацм рідин і вимірювання, а з іншої сторони - з вузлом для контролю вакууму і дозованої подачі повітря 4 Приспи по п 1, який відрізняється тим, що вузол деоксигенацм рідин і вимірювання містить об'єм для обміну газами і вимірювальну кварцеву кювету 5 Пристрій по п 1, який відрізняється тим, що вузол для контролю вакууму і дозованої подачі повітря складається з мембранного вакуумметра, який через перехідник і двоходовий кран з'єднаний з форвакуумним насосом Винахід відноситься до галузі медичного приладобудування і може бути використаним для визначення кисневодисоційних кривих гемоглобіну (НЬ) і міоглобіну (Mb) в присутності оксиду азоту Відомо, ЩО ОКСИД азоту в основному використовують у виробництві азотної кислоти Сучасні методи виробництва азотної кислоти можуть бути розбиті на три основні групи отримання азотної кислоти при атмосферному тиску, при підвищеному тиску, комбінованим способом [В И Атрощенко, С И Каргин "Технология азотной кислоты" Изд-во "Химия", Москва, 1970 г С 196-239] Оксид азоту можна отримати, якщо суміш аміаку з повітрям пропустити над каталізатором [К Николаев "Общая и неорганическая химия" Изд "Просвещение", Москва, 1974 г ] 4NH3 + 5 О2 = 4 N0 + 6Н2О Ця реакція широко використовується у промисловості для отримання азотної кислоти окисленням аміаку Оскільки усі етапи перетворення аміаку до оксиду азоту перебігають на поверхні каталізатора, на всіх заводах як каталізатор використовують сггку з платини або и сплави Платинову сітку попередньо нагрівають, пропускаючи через неї електричний струм, температуру и 900° С підтримують за рахунок екзотермічної реакції окислення Безпосереднє з'єднання азоту з киснем можливе лише при високих температурах, оскільки для реакції N 2 + О2 = 2NO зміна ізобарного потенціалу є від'ємною ОКСИД азоту можна отримати при взаємодії азотної кислоти з міддю, однак така реакція проходить складно і, як правило, завжди отримують суміш NO і NO2 Схематично це виглядає так 3Cu+ 8HNO3 = 2NO + 3Cu(NO3)2 + 4Н2О Чистий оксид азоту можна отримати сплавленням нггратів і нггритів з окисом хрому 3KNO2 + KNO3 + Сг2Оз = 2К2СЮ4 + 4NO Виробництво азотної кислоти потребує дорогого обладнання і належного захисту працівників, а також навколишнього середовища Найбільш близьким за технічною суттю - про 00 ю ю 45158 тотипом - є пристрій для отримання оксиду азоту і кінетики дисоціації нітрозогемоглобшу (HbNO) і карбоксигемоглобшу (НЬСО), що був описаний в 1956 році вченими By Q Н Gibson and F J W Rougnton (The kinetics of dissociation of the first Hgand molecule from fully saturated carboxyhaemoglobm and nitric oxide haemoglobin in sheep blood solutions Proceedings of the royal society Biological Sciences Series В Vol 147 № 926 1956) Для отримання оксиду азоту N0 у пристрої використана реакція дії концентрованої сірчаної кислоти на нітрит натрію, внаслідок якої отримували суміш двооксиду азоту NO2 і оксиду азоту N0 з наступним доочищенням суміші продуктів реакції, що вимагає складної і дорогої апаратури Цей пристрій складається з реакційної колби, крапельної лійки, реометра, склянки з КОН, склянки з концентрованою H2SO4 пастки, посудини Дюара, колонки з п'ятиокислом фосфору, конденсаторів і скляних фільтрів (рис 1) Отриманий і очищений N0 у даному пристрої подається у тонометр за допомогою спеціального крану і в подальшому дозовано через систему кранів подається в сатуратор з кюветою для спектрофотометри лігандних форм гемоглобіну Недоліком цього пристрою є те, що він громіздкий по відношенню цілої низки складових цієї системи В пристрої застосовуються агресивні луги і концентровані кислотиВін вимагає додаткового доочищення оксиду азоту від різних домішок В основу винаходу поставлено задачу вдосконалити пристрій для отримання і дозованої подачі оксиду азоту і побудови кривих оксигемоглобіну в присутності N0 шляхом використання нових конструктивних рішень і технологій, що дозволить забезпечити швидке і якісне отримання кисневодисоційних кривих оксигемоглобіну і оксимюглобіну в присутності N0 Поставлена задача вирішується так - у пристрої, який містить синтезуючий вузол, додатково є дозуючий вузол, вузол для оксигенацм рідин і вимірювання, а також вузол для контролю вакууму і дозованої подачі повітря, причому усі з'єднані між собою скляними шліфами або вакуумними шлангами, вакуумними кранами і перехідниками синтезуючий вузол складається з об'єму для розчину аскорбінової кислоти і об'єму для кристалів NaN02, з'єднаних між собою скляною трубкою, причому кожний об'єм має завантажувальний отвір, дозуючий вузол має змінний об'єм за рахунок розміщення в ньому скляних кульок і за допомогою двохходового вакуумного крану з'єднаний з U- подібним скляним манометром, який заповнений забарвленою дистильованою водою, який через двохходові крани і переходник з однієї сторони з'єднаний з трьохходовим краном, що пов'язаний вакуумними шлангами з вузлом для деоксигенацм рідин і вимірювання, а з іншої сторони - з вузлом для контролю вакууму і дозованої подачі повггря, вузол деоксигенацм рідин і вимірювання містить об'єм для обміну газами і вимірювальну кварцеву кювету, вузол для контролю вакууму і дозованої подачі повітря складається з мембранного вакуометра, який через перехідник і двохходовий кран з'єднаний з фор-вакумним насосом Авторами вперше запропоновано використовувати N0 для побудови кривих дисоціації оксигемоглобіну Аналізуючи характер розташування КДО гемоглобіну при 25, 50, 75% насиченні крові киснем автори зауважили, що нахил кривих оксигинацм збільшувався зі зменшенням насичення крові киснем Це свідчить про те, що підсилюючи ефект Hb-NO на від'єднання кисню від молекули, гемоглобін стає сильнішим у периферичних ділянках кровотоку, де рОг низький При збільшенні рОг в альвеолах відбувається зміцнення шостого координаційного зв'язку і спорідненість гемоглобіну до кисню збільшується Таким чином N0 додатково до вазоделататорної функції виконує роль регулятора транспортної функції кисню у дихаючі тканини через послаблення зв'язку атома заліза з проксимальним гістидином субодинидь Разом з тим, киснево-зв'язуюча функція гемоглобіну зберігається у зв'язку з можливістю зміцнення Fe-HIS зв'язку при підвищенні парціального тиску кисню у легенях Наявність нггрозо-протеїнів у крові забезпечує депонування N0 що при певних критичних умовах виступає в ролі локального регулятора потоку Ог в тканині Регуляторна роль N0 можлива лише при екзогенному утворенні його в КІЛЬКОСТІ менше одного проценту від загального гемоглобіну Надмірне утворення N0 небезпечне і негативно впливає на газотранспортну функцію крові, оскільки приєднання його до р-ланцюпв значно збільшує спорідненість гемоглобіну до кисню, одночасно накопичується метНЬ, що обмежує постачання кисню до тканин, що призводить до розвитку ппоксичних станів і загибелі клггин Утворення N0 в надлишку може привести до продукції N02, при збільшенні рОг- Це пов'язано з тим, що N0 окислюється киснем до NO2 2N0 + Ог -> 2NO2, який при надлишку N0 утворює 2N0 + О2 -> 2N2O3 і N2O3 При взаємодії з водою утворює нггрит-юни 2N2O3 + 2Н2О -» 2NO2 + 4Н + Утворений NO2 може бути використаний мггохондріями в якості акцептора електронів, тобто клітини переходять з кисневого на нітратно-нітритне дихання Можливість переходу мггохондрій на такий тип дихання обговорюється в огляді Реутова В П Гемоглобін і міоглобін мають властивість відновлювати нітрит іони до окису азоту, вони замикають ланцюжок L-арпнін -> NO -> NC2/NO3 -> N0 в один цикл Властивість гемопротеїдів відновлювати нітрит-юни до N0 проявляється лише в відновленому стані (цьому сприяє дефіцит кисню) Кисень інгібує нітритредуктазну активність цих білків При гіпоксії нггритредуктазна активність гемопротеїнів збільшується, підсилюється також генерація N0 з L-арпніну вміст якого в сироватці крові зменшується Особливе фізіологічне значення в системі депо N0 має місце гемоглобін Утворення Hb-NO комплексів має такі шляхи утворення або в результаті взаємодії з швидко проникаючим N0 утвореного в L-аргеніновому шляху, або в результаті перетворення N02 самим дезоксигемоглобіном в N0 Властивість гемоглобіну зв'язувати N0 дає можливість транспорту цього газу на значні віддалі Важливо, що в цьому випадку N0 може бути ви 45158 користане в системі міжорганних взаємодій Вивільняючи в умовах гіпоксії з комплексу HbNO оксид азоту, який може досягати мозку, міокарду і інших тканин, які потребують його в якості регулятора внутрішньоклггинної концентрації Са 2+ Відомо, що поступлення Са 2+ в клггини кровоносних судин при гіпоксії пригнічується Це призводить до інгібування Са 2+ залежної NOS в ендотеліальних клітинах Очевидно, в такому випадку локальна вазодилатація судин можливо проходить за рахунок N0, який поступив з еритроцитів крові Рис 1 Принципова схема прототипу 1 - реакційна колба, 2 - капельна воронка, 3 - реометр, 4 - склянки з розчином КОН, 5 - склянка з концентрованою сірчаною кислотою, 6 - пастка, 7, 10, 11 - посудина Дюара, 8 - колонка з п'ятиокисом фосфору, 9 - конденсатори, 12 - скляні фільтри Рис 2 Принципова схема пристрою для побудови кривих спорідненості дезоксигемоглобшу і міоглобіну до дії оксиду азоту Де 1 - секція для розчину аскорбінової кислоти, 2 - секція для кристалів NaNC^, З, 4, 5, 6, 7 - двоходові вакуумні крани, 8 — кварцева кювета, 9 - трьохходовий кран (з отворами а, в, с) і відводом для вакуумного насоса, 10 - дозатор, вузол з'єднання, 11 - завантажувальні отвори, 12 - U-подібний манометр, 13,14 - перехідники, 15 - обмінник для деоксигенацм, 16 - ВІДВІД для вакуумного насоса, 17 - мембранний вакуометр, 18 - ВІДВІД для U-подібного манометра Використавши вище описані властивості N0 авторами розроблений пристрій для отримання і дозованої подачі оксиду азоту і побудови кривих дисоціації оксигемоглобіну в присутності N0 Прилад складається з чотирьох частин NO-синтезуючого вузла, дозуючого вузла, вузла для деоксигенацм і виміру оптичної густини, вузла контролю вакууму і дозовавної подачі атмосферного повітря Вузли з'єднані між собою скляними шліфами, вакуумними шлангами з вакуумними кранами, перехідниками як гарантують герметичність вузлів Розрідження повітря в сатураторі відбувається за допомогою фор-вакуумного насосу Синтезуючий вузол складається з двох об'ємів (рис 2) 1 - об'єм для розчину аскорбінової кислоти і для кристалів NaNO2 (2), які з'єднані між собою скляною трубкою, яка дозволяє змішувати ці компоненти після деоксигенацм системи Кожний об'єм має завантажувальний отвір (11) Синтезуючий вузол з'єднаний з дозуючим вузлом за допомогою вакуумного крану (3), який запаяний в скло Дозуючий вузол складається з власне дозуючого об'єму (10), який можна змінювати за допомогою скляних кульок, виводу до манометра (18), U-подібного скляного манометра заповненого забарвленою дистильова вною водою (12), трьох двоходових вакуумних кранів (4, 5, 6), переходника (13) Система з'єднана вакуумними шлангами Дозуючий вузол з'єднаний з вузлом для виміру через складний трьохходовий кран (9), який має ВІДВІД ДЛЯ вакуумного насоса Крім цього є об'єм для обміну газами (7) і вимірювальна кварцева кювета (8) Вузол для контролю вакууму і дозованої подачі повітря складається з мембранного вакуометра (17), вакуумного крану (7) і виводу для фор-вакуумного насоса (16) Складання приладу здійснюють наступним чином в об'єм (1) поміщають розчин аскорбінової кислоти - 15 мл і закривають завантажувальний отвір, об'єм - (2) заповнюють пізніше, збирають вузол (10), приєднують вакуумні крани і манометри після завантаження об'єму (7) досліджуваним розчином, за допомогою модифікованого шприца, збирають кран (9), який під'єднують до мембранного манометра (17), вакумного крану (7) і вакуумного насосу Для проведення вимірів параметрів NO-зв'язуючих властивостей гемоглобіну останній отримують з попередньо відмитих еритроцитів, які гемолізують у K/Na-фосфатному буфері 33мм, рН-7,36 і поміщають в обмінник (7) Приєднують вузли до вакуумного насоса, попередньо перевіривши чи закриті усі крани Після включення насосу, відкривають кран (7) і поступово відкривають кран (6), при чому у крані (9) отвір "а" знаходиться напроти отвору "в", і в дальнішому поступово відкривають кран (3) Ця система відкривання кранів дозволяє здійснювати деоксигенування розчину гемоглобіну і розчину аскорбінової кислоти без денатурації, а також дозволяє звільнити систему від кисню Деоксигенацію проводять впродовж 10 - 15хв, підтримуючи температуру розчинів 37°С, постійно перемішуючи їх Після деоксигенацм гемоглобіну яку контролюють спекрофотометрично при 560нм, закривають кран (9) так, щоб отвір "с" був направлений в сторону дозатора (10), закривають крани (6, 7, 3) Далі відкривають об'єм (2), не збовтуючи об'єм (1), витирають його фільтрувальним папером, завантажують кристали NaNCb зверху яких поміщають фільтрувальний папір, закривавють вузол Все це проводять для запобігання передчасного реагування NaNCb з розчином аскорбінової кислоти, тобто передчасного синтезу N0 Підключають вузол до вакуумного насосу, відкривають крани (7, 6, 3), проводять вакуумізацію впродовж Зхв Обережно почергово відкривають крани (4, 5), запобігаючи різким перепадам, тиску в системі Uподібного манометра, щоб спричинювало втрату рідини з манометра внаслідок відсмоктування м у вакуумні трубки Відкачування проводять до того часу, поки не перестануть виділятися міхурці газу з рідини манометра В дальнішому не рекомендується залишати крани (5, 4) відкритими при розібраному приладі Після завершення процесу закривають кран (7, 3) і одночасно закривають кран (5, 6) Поміщають розчин гемоглобіну в кювету в пристосований вимірювальний ВІДСІК спектрофотометра і записують електронний спектр в області 400 - 750нм RHb Далі змішують NaNO2 з розчином аскорбінової кислоти при закритому крані (3) Через 1хв поступово відкривають кран (3) і вводять 8 45158 0,5г У верхній сектор поміщали гемоглобін в дезоксиформі, отриманий за допомогою дтонггу (Na2S2O4) Прилад залишали на інкубування на 2год при t = 6°С Повітряна шапка між двома целофановими мембранами запобігає проникненню ІОНІВ NO 2 , безпосередньо в розчин дезоксигемоглобшу, сухий ДІТІОНІТ позбавляє атмосферу повітряної шапки від надлишку кисню Целофанові мембрани пропускають газ, який проходячи в розчин з дезоксигемоглобтом перетворює його в нітрозогемоглобін Приклад 2 Вплив оксиду азоту N0 на кмсневоДИСОЦІЙНІ криві дихальних гемопротеїдів При дослідженні впливу оксиду азоту на кисневодисоціативні криві працюють аналогічно Після зв'язування потрібної дози N0, проводять додаткове відкачування залишків газу при закритих кранах (5, 4, 3), кран (9) відкритий так, щоб отвір "а" був напроти отвору "в" Запускання атмосферного повітря проводять відкриваючи кран (7) при відкритому крані (6) і при закритих кранах (3, 4, 5) Дозування атмосферного повітря проводять за допомогою мемранного вакуометра (17) Покази оптичної густини знімають при 480нм Збільшуючи парціальний тиск кисню в кюветі і визначають покази оптичної густини (D) при даній довжині хвилі, отримують 5 - 6 показів, за якими будують КДО досліджуРоботу пристрою можна проілюструвати наваного розчину Будують графіки залежності проступними прикладами центного вмісту оксигемоглобіну від парціального Приклад 1 Отримання оксиду азоту NO m тиску кисню поданого в кювету vitro певну дозу NO Дозу NO регулюють за допомогою монометра (12) Відкривають кран (9) так, щоб отвір "а" був напроти отвору "в", тим самим запускають N0 до розчину гемоглобіну, інтенсивно перемішують 10 - 12сек і записують спектр поглинання в згаданій ДІЛЯНЦІ спектру Цю процедуру проводять до повного насичення Виміри проводять при 480 нм Будують графіки залежності вмісту нітрозо гемоглобіну в процентах від тиску N0 поданого в сатуратор При дослідженні впливу оксиду азоту на киснеВОДИСОЦІЙНІ криві процедуру проводять аналогічно Лише після зв'язування потрібної дози N0, проводять додаткове відкачування залишків газу при закритих кранах (5, 4, 3), кран (9) відкритий так, щоб отвір "а" був напроти отвору "в" Запускання атмосферного повітря проводять відкриваючи кран (7) при відкритому крані (6) і закритих кранах (3, 4, 5) Дозування атмосферного повітря проводять за допомогою мембранного вакуометра (17) Покази оптичної густини вимірюють при 480 нм Збільшуючи парціальний тиск кисню в кюветі і знімаючи покази оптичної густини (D) при даній довжині хвилі, отримують 5-6 показів, за якими будують КДО досліджуваного розчину Будують графіки залежності процентного вмісту оксигемоглобіну від парціального тиску кисню поданого в кювету Для генерації N0 використовували властивість розчину аскорбінової кислоти відновлювати NO 2 до N0 Для підтвердження того, що це справді окис азоту (N0), була сконструйована система, яка складається з двох секцій з'єднаних між собою за допомогою гайок Для генерації газу в нижній сектор поміщали концентрований розчин аскорбінової кислоти до якої додавали NaN02 (кристалічний) Розроблений авторами пристрій є неадекватним за своєю простотою вище описаному пристрою Він Є надійним і ефективним за швидкістю і чистотою отримання оксиду азоту в цій системі і не вимагає додаткових економічних затрат У запропонованому пристрої лише один вузол-синтезуючий виконує функцію отримання оксиду азоту замість складного пристрою прототипу Рис. 1 45158 10 Рис. 2 ДП "Український інститут промислової власності "(Укрпатент) Україна, 04119, Киів-119, вул сім'ї Хохлових,15 (044) 456-20-90