Спосіб оцінки генотоксичних властивостей наноматеріалів

1. Спосіб оцінки генотоксичних властивостей наноматеріалів in vitro, що включає підготовку зразка для дослідження, вибір та підготовку тестової культури клітин, обробку суспензії культуральних клітин в інкубаційному середовищі досліджуваним зразком з наступним визначенням ступеня пошко 3 ких соединений // Методические рекомендации: Рос. акад. мед. наук, Рос. акад. сельскохоз. наук, М., 2006]. В основі методу лежить реєстрація відмінностей у рухливості в постійному електричному полі ДНК та можливих фрагментів ДНК клітин тестової культури, оброблених досліджуваною речовиною, а потім лізованих та іммобілізованих в агарозний гель. Рухаючись до аноду, ДНК формує електрофоретичний слід, що нагадує "хвіст комети", параметри якого залежать від рівня пошкодження молекули ДНК. Для визначення генотоксичних властивостей хімічної речовини готують зразок для дослідження, вибирають та підготовлюють тестову культуру клітин і обробляють суспензію клітин в інкубаційному середовищі досліджуваною речовиною. Потім готують мікропрепарати для проведення гельелектрофорезу: оброблені клітини заключають в агарозний гель та наносять на підготовлені гельслайди (стандартні предметні скельця, покриті агарозним гелем). Після отвердіння клітини піддають лізису, при цьому відбувається дисоціація клітинних структур і випетлювання хроматину в пори агарози. В результаті подальшої лужної денатурації (рН>13) лужно-лабільні сайти ДНК реалізуються в однониткові розриви. При електрофорезі ДНК у вигляді фрагментів та петель суперполімерних молекул рухається до аноду, формуючи "хвіст комети", ядром якої є порожнина, заповнена ДНК. Після завершення електрофорезу слайди нейтралізують, фіксують, фарбують та виконують мікроскопію з використанням флуоресцентного мікроскопа. Для оцінки ДНК-пошкоджень в клітинах тестової культури під дією досліджуваної речовини визначають параметри отриманих зображень "комет": вимірюють "довжину комети", "діаметр голови" та "довжину хвоста" за допомогою мікрометричної лінійки, або використовують комп'ютерний аналіз цифрових зображень, який дозволяє визначати вміст ДНК в "кометі", долю матеріалу в її "голові" та "хвості". Порівнюючи отримані показники ДНКпошкоджень в мікропрепаратах клітин, оброблених дослідженою речовиною, з контрольними оцінюють її генотоксичні властивості. Метод "ДНК-комет" характеризується високою чутливістю, інформативністю, не потребує великої кількості матеріалу і може бути застосований практично до любих клітин. Тому він рекомендований та застосовується для оцінки генотоксичних властивостей широкого кола природних та синтетичних сполук. Так, відомо застосування методу мікроелектрофорезу ДНК для вивчення наслідків впливу на геном солей важких металів на прикладі хлориду нікелю [В.Ю. Чернеко, Л.Л. Лукаш и др. Применение метода микроэлектрофореза ДНК для оценки генотоксических эффектов мутагенов в культуре гемопоэтических клеток человека // Цитология и генетика. - 2004. - №1. - С.31-35]. Як модельну клітинну систему для тестування однониткових розривів в ДНК вибрали первинну культуру ембріональних гемопоетичних клітин людини. Клітини із абортивного матеріалу інкубували в по 48540 4 живному середовищі, виділяли культуру гемопоетичних клітин та визначали їх життєздатність. Потім в суспензію клітин додавали хлорид нікелю у вигляді водного розчину з концентрацією 500мкг/мл і інкубували протягом 24 годин. Отриману суспензію оброблених клітин використовували для приготування мікропрепаратів та подальшого виявлення пошкоджуючої дії хлориду нікелю на клітинну ДНК методом "ДНК-комет". Вивчення отриманих комп'ютерних зображень продемонструвало наявність великої кількості клітин з пошкодженою ДНК. При цьому автори зазначають високу чутливість методу мікроелектрофорезу ДНК гемопоетичних ембріональних клітин людини по відношенню до виявлення пошкоджень ДНК окремих клітин під дією хлориду нікелю. При визначенні генотоксичності хімічних речовин відомим способом підготовка зразка для досліджень зводиться до приготування істинного розчину його в воді; в деяких випадках дозволяється застосування інших розчинників за умов їх нетоксичності. Рівень токсичності таких розчинів визначається не тільки природою хімічної речовини, але й, значною мірою, її концентрацією. Враховуючи наведені вище особливості структури і властивостей наноматеріалів, рівень їх токсичності не можна зводити до токсичності істинних розчинів речовин, що входять до їх складу. Для об'єктивної оцінки генотоксичних властивостей наноматеріалу необхідно забезпечити можливість взаємодії з клітиною безпосередньо частинок наноматеріалу та враховувати те, що наслідки такої взаємодії будуть залежати не стільки від кількості введеного в суспензію клітин наноматеріалу, скільки від особливостей його частинок і, насамперед, від їх розміру. Автори корисної моделі, що пропонується, вирішували завдання вдосконалення, заснованого на методі "ДНК-комет" способу визначення генотоксичності, з метою його застосування для об'єктивної оцінки генотоксичних властивостей наноматеріалів з необхідною достовірністю. Поставлене завдання вирішене тим, що у відомому способі оцінки генотоксичності in vitro, що включає підготовку зразка для дослідження, вибір і підготовку тестової культури клітин, обробку суспензії культуральних клітин в інкубаційному середовищі досліджуваним зразком та подальше визначення рівня пошкодження ДНК методом "ДНКкомет", у випадку визначення генотоксичних властивостей наноматеріалів відповідно до корисної моделі, що заявляється, зразок для досліджень готують у формі водної дисперсії частинок наноматеріалу шляхом диспергування його в воді, або отриманого шляхом синтезу частинок наноматеріалу за хімічною природою і розміром ідентичних частинкам, що входять до складу наноматеріалу, як тестову культуру клітин використовують культуру клітин яєчника китайського хом'ячка СНО-К1 і обробку суспензії клітин підготовленою дисперсією частинок проводять інкубуванням протягом 0,3-48 годин. При визначенні генотоксичних властивостей наноматеріалу способом, який заявляється, тестову культуру клітин необхідно обробляти безпосе 5 48540 редньо наночастинками, що входять до його складу, тому підготовка відповідного зразка наноматеріалу для дослідження має дуже велике значення для отримання об'єктивних та достовірних результатів. Підготовка зразка для дослідження може заключатися у диспергуванні, якщо це можливо, наноматеріалу у воді відомими способами та при умові його однорідності за складом та розміром частинок. За умов значної неоднорідності частинок наноматеріалу за розмірами, необхідно попередньо виділити основну фракцію частинок та приготувати з неї водну дисперсію. Для визначення генотоксичності наноматеріалу, який складається з двох чи більше видів наночастинок різної хімічної природи, можна приготувати водні дисперсії частинок кожного виду, або частинок, які складають його основу, а також частинок, які можуть значною мірою визначати генотоксичність, виділивши їх із складу наноматеріалу. В деяких випадках можливо вивчати генотоксичні властивості наноматеріалу з використанням в якості зразків спеціально отриманих з цією метою водних дисперсій частинок, які за хімічним складом та розмірами ідентичні частинкам наноматеріалу. Як тест-об'єкт вибрали стандартизовану культуру клітин яєчника китайського хом'ячка СНО-К1, яка за результатами випробувань виявила високу чутливість до дії наноматеріалів як органічної так і неорганічної природи. Стандартизована культура клітин СНО-К1 є доступною для дослідників і зазвичай є наявною в банках культур лабораторій, що займаються проблемами генотоксикології. Час обробки тестової культури клітин дисперсією частинок наноматеріалу вибирають в діапазоні 0,3-48 годин. В кожному конкретному випадку необхідний час контакту визначають експериментально, встановлюючи час досягнення максимального рівня акумуляції частинок клітинами за результатами вивчення кінетики цього процесу. У випадку наноматеріалів медичного (ветеринарного) призначення при визначенні тривалості контакту клітин тест-об'єкту з дисперсією частинок досліджуваного зразка приймають до уваги час їх терапевтичної дії при лікуванні, або більш тривалий час у відповідності з періодом знаходження в організмі препаратів іншого призначення (зазвичай це 24-48 годин). Кількість досліджуваного матеріалу для введення у контакт із суспензією клітин, обирають, виходячи з відомої чи попередньо визначеної цитотоксичності in vitro або, беручи до уваги рекомендовану дозу чи величину добового споживання 6 наноматеріалу при його використанні. При цьому за максимальну кількість наноматеріалу, що вводиться, можна прийняти значення ½ LC50 (із урахуванням впливу на осмотичний тиск інкубаційного середовища), а за мінімальну кількість прийняти, наприклад, добову терапевтичну дозу із розрахунку на 1кг маси тіла в перерахунку на 1л інкубаційного середовища. Інші значення цього параметру можна вибрати в 10 і 100 раз меншими за максимальне значення, або в 10 та 100 раз більшими за мінімальне. Можливо застосовувати також інший підхід до вибору адекватних кількісних параметрів (кількість наноматеріалу в одиниці об'єму інкубаційного середовища, маса наночастинок в одиниці об'єму дисперсії) процесу обробки культур клітин дисперсією частинок досліджуваного наноматеріалу. Нижче приведені приклади застосування способу, що заявляється, для визначення генотоксичних властивостей наноматеріалів органічної та неорганічної природи. Приклад 1. Визначали генотоксичні властивості наноматеріалів, що містять наночастинки золота, які є основою наноматеріалу або компонентом, що може обумовлювати його токсичність. До таких матеріалів відносяться як монопрепарати складені тільки з наночастинок золота, так і комплексні нанопрепарати, наприклад, біопрепарати та біодобавки медичного (ветеринарного) призначення, які поряд з компонентами білкової або іншої органічної природи містять наночастинки золота. Генотоксичні властивості таких наноматеріалів можна визначати за результатами дослідження генотоксичності насамперед наночастинок золота. Зразки для дослідження готували у формі колоїдного водного розчину металевого золота [Методические разработки к практикуму по коллоидной химии / под ред. А.В. Перцова. - Москва: Издво МГУ, 1976. - С.128]. Методика дозволяє одержувати колоїдні розчини з однорідними за розміром частинками золота, варіюючи їх розмір у нанодіапазоні. За цією методикою одержували серію колоїдних розчинів з розміром частинок золота 10, 20, 30 та 45нм. Розмір наночастинок в кожному отриманому колоїдному розчині вимірювали за допомогою лазерно-кореляційного спектрометра Zetasizer-3 ("Malvern Instrument Ltd", Великобританія). В таблиці наведено характеристику зразків для дослідження, що були отримані на основі вищезазначених колоїдних розчинів та розрізняються розміром частинок і концентрацією. Таблиця Характеристика Розмір частинок, нм Концентрація, мкг/мл 1 10 11,06 1р 10 -5 11,06·10 2 20 11,0 Як тестову культуру клітин використовували культуру клітин яєчника китайського хом'ячка СНО-К1 із колекції Державного науково Позначення зразка 2р 3 3р 20 30 30 -5 -5 11,0·10 14,0 14,0·10 4 45 38,6 4р 45 -5 38,6·10 контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів (Київ, Україна). Клітини культури СНО-К1 нарощували на середовищі F10 ("Sigma", 7 США), що містило 5% ембріональної сироватки великої рогатої худоби ("Gibco", США) в атмосфері, що містить 5% СО2, при 37°С до титру 5 5·10 кл/мл. Кількість живих клітин, визначених за допомогою фарбування 0,3% розчином трипанового синього, складала не менш ніж 90%. Визначення генотоксичності частинок золота в зразках, характеристику яких наведено у таблиці, здійснювали змішуючи 67мкл суспензії клітин СНО-К1 і 33мкл кожного зразка нанопрепарату при 37°С з наступним інкубуванням протягом 30 хвилин. Час обробки був визначений за результатами попередніх досліджень кінетики процесів акумуляції частинок золота клітинами тестової культури. В експериментах із зразками 3 і 4 застосовували також метаболічну активацію з використанням мікросомальної фракції S9 печінки щурів, вміст якої в інкубаційній суміші складав 5%. Час інкубації - 3 години при температурі 37°С. Позитивним контролем слугували клітини культури СНО-К1, оброблені Nнітрозометилсечовиною в концентрації 1мМ протягом 48 годин. В якості негативного контролю були клітини в розчині диметилсульфоксиду. Приготування мікропрепаратів клітин, оброблених досліджуваними зразками, а також клітин позитивного і негативного контролів, та їх дослідження проводили за звичайною схемою методу ДНК-комет: отримання гель-слайду, формування мікропрепарату, лізис, лужна денатурація, проведення електрофорезу, нейтралізація/фіксація, фарбування препарату, мікроскопічний аналіз. Мікроскопію мікропрепаратів здійснювали за допомогою флуоресцентного мікроскопа ("ЛЮМАМ Р8", Росія). На кожен мікропрепарат аналізували не менш ніж 200 "ДНК-комет". Комп'ютерну обробку отриманих цифрових зображень здійснювали за допомогою програми "COMET-CASP". При цьому визначали наступні параметри "комет": "довжина хвоста","% ДНК в хвості", "момент хвоста". Статистичну обробку результатів проводили по кожній експериментальній точці шляхом порівняння показників ушкодження ДНК в дослідній та контрольних групах. Критерієм позитивного результату слугував статистично достовірний відтворюваний ефект. Отримані результати свідчать про те, що генотоксичність досліджуваних зразків препаратів золота дуже залежить від розмірів наночастинок і значно меншою мірою визначається кількістю наноматеріала, що контактує з клітинами при їх обробці. Нижче на діаграмі (див. фігуру) наведені дані про величину ДНК-руйнуючої активності наночастинок в зразках 1, 1р, 2, 2р, 3, 3р, 4 і 4р порівняно з контрольними зразками негативним (к-) і позитивним (к+) за показником "% ДНК в хвості". Наведені також результати обробки клітин зразками 3 і 4 з використанням метаболічної активації (на діаграмі позначені як 3* і 4*). Аналіз показників діаграми доводить, що за допомогою запропонованого способу можна визначати кількісні показники генотоксичних властивостей нанопрепаратів на основі золота з різним 48540 8 розміром частинок в широкому діапазоні концентрацій. Зразки з розміром частинок золота 30 і 45нм не виявляли генотоксичності, в тому числі і в дослідах з метаболічною активацією (їх показники є близькими до негативного контролю), в той же час для зразків з розміром частинок 10 і 20нм виявлено ефект генотоксичності для усіх досліджених концентрацій. Приклад 2. Визначали генотоксичні властивості інактивованої вакцини проти сказу та лептоспірозу собак. Доза такої вакцини рекомендується виробником і є строго індивідуальною для собак різного віку та маси тіла. Вказана інактивована вакцина є продуктом деструкції клітин збудників хвороб і являє собою суміш частинок білкової природи (макромолекул білків та їх фрагментів) з середнім розміром 7-10нм. Тобто досліджувана вакцина є наноматеріалом ветеринарного призначення (нанопрепаратом). Для визначення біобезпеки інактивованої вакцини актуальною є оцінка її генотоксичних властивостей в імунізуючих дозах, тому вміст її у зразку для дослідження визначали, виходячи з дози в розрахунку на 1кг маси тіла тварини, забезпечуючи такий же вміст в 1л інкубаційного середовища при обробці клітин тестової культури. Досліджували вакцину у товарній формі, пакувальна одиниця якої містила 1 дозу. 10мл суспензії тестової культури клітин яєчника китайського хом'ячка СНО-К1 в інкубаційному середовищі, характеристика та порядок підготовки якої наведені у Прикладі 1, змішували з 0,01мл зразка вакцини в концентрації, яка забезпечувала імунізуючу дозу, та витримували 24 години при 37ºС. Тривалість контакту визначали за показником часу імунізуючої дії вакцини (24 години), який застосовують у ветеринарній практиці. Кількість живих клітин, визначених за допомогою фарбування 0,3% розчином трипанового синього, складала 93%. Позитивним контролем слугували клітини культури СНО-К1, оброблені розчином Nнітрозометилсечовини в концентрації 1мМ та інкубовані протягом 24 годин при 37°С до титру 5 5·10 кл/мл. Кількість живих клітин позитивного контролю, визначених за допомогою фарбування 0,3% розчином трипанового синього, складала 85%. В якості негативного контролю виступали інтактні (не оброблені) клітини культури СНО-К1, нарощені при температурі 37°С протягом 24 годин до 5 титру 5·10 кл/мл. Кількість живих клітин негативного контролю, визначених за допомогою фарбування 0,3% розчином трипанового синього, складала 96%. В експериментах з метаболічною активацією використовували мікросомальну фракцію S9 печінки щурів, вміст якої в інкубаційній суміші при обробці тестових клітин зразком вакцини складав 5%. Час інкубації - 3 години, що було достатнім для прояву генотоксичних властивостей в цих умовах. Кількість живих клітин, визначених за допомогою фарбування 0,3% розчином трипанового 9 48540 синього, складала 94%. Одержання мікропрепаратів клітин тестової культури, оброблених досліджуваним зразком інактивованої вакцини, а також клітин позитивного і негативного контролів, їх дослідження та обробку результатів проводили як описано в Прикладі 1. Як і у Прикладі 1, було одержано статистично достовірні відтворювані результати (аналізували до 200 "ДНК-комет"), які свідчать про те, що досліджувана інактивована вакцина проти сказу та лептоспірозу собак у імунізуючій дозі не проявляє генотоксичних властивостей: величина показника "% ДНК в хвості" складала 0,07% та 0,08% у дослідах з метаболічною активацією, що майже співпадає з аналогічною величиною негативного контролю Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська 10 (0,014%) та є значно нижчою за показник "% ДНК в хвості" позитивного контролю (7,1%). За такою схемою нами було також виконано дослідження більш ніж 10 ветеринарних вакцин. Таким чином, наведені приклади застосування способу, що заявляється, демонструють можливість достовірного визначення генотоксичних властивостей наноматеріалів органічної та неорганічної природи. Спосіб, що заявляється, є високоінформативним, експресним, достовірним та гуманним, оскільки не потребує використання лабораторних тварин, а реалізується в умовах in vitro на тестовій культурі клітин. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601