Спосіб визначення генерації супероксидного аніон-радикалу фагоцитуючими клітинами крові

Спосіб визначення рівня генерації супероксидного анюн-рад икала фагоцитуючими клітинами крові, що полягає у розділенні фагоцитуючих клітин крові на моноцити та поліморфно-ядерні лейкоцити за допомогою градієнта ЩІЛЬНОСТІ фікол-трюмбраста, додаванні до фагоцитуючих клітин крові 0,2 % розчину нітросинього тетразолію, додаванні до реакційної суміші 2 М розчину гідроксиду калію та д и мети л сульфоксид у, вимірюванні оптичної ЩІЛЬНОСТІ розчину формазану за допомогою спектрофотометра та визначенні КІЛЬКОСТІ формазану, який відрізняється тим, що паралельно аналізують суспензію моноцитів та поліморфно-ядерних лейкоцитів, шкубують реакційну суміш 20 хвилин, вимірюють оптичну ЩІЛЬНІСТЬ розчину формазану при 540 нм та визначають рівень генерації супероксидного анюнрад икала фагоцитуючими клітинами крові за формулою Х= А/Вх2хЮ3, де, X - рівень супероксидного анюн-радикала (мкМ на 103 фагоцитуючих клітин крові), А - КІЛЬКІСТЬ формазану у пробі (мкМ), В - абсолютний вміст фагоцитуючих клітин крові у пробі, 2, 103 - алгебраїчні коефіцієнти 1 Винахід стосується медицини, а саме лабораторної діагностики і може бути використаний для визначення рівня генерації супероксидного анюн-рад икала фагоцитуючими клітинами крові, як у нормі, так і при різних захворюваннях внутрішніх органів Фагоцитуючі клітини крові і органів людини є основним джерелом вільних радикалів в організмі При цьому, супероксид ний анюн-радикал, як первинний радикал, дає початок іншим вторинним радикалам, які характеризуються значною реакційною спроможністю ВІЛЬНІ радикали, як фактори неспецифічного захисту, беруть активну участь у бактерицидній та цитотоксичній активності фагоцитуючих клітин, здійснюючи деструкцію макромолекул (мембранних білків та ЛІПІДІВ, ферментів і нуклеїнових кислот) бактеріальних клітин і пухлинних клітин власного організму Важлива бактерицидна і цитотоксична активність вільних (О радикалів дещо затьмарюється їхнім руйнівним впливом на аутолопчні макромолекули та клітини в основному у тих тканинах, де відбувається надмірна їх генерація при будь-якому запальному процесі Тому, контроль за рівнем вільних радикалів в організмі, І насамперед - за рівнем генерації супероксидного анюн-рад икала фагоцитуючими клітинами при захворюваннях внутрішніх органів, дозволить вчасно вжити терапевтичних заходів щодо регуляції їх низького або надто високого рівня в організмі Відомий спосіб визначення генерації супероксидного анюн-рад икала фагоцитуючими клітинами, що полягає у наступному 1 Отримують кров, стабілізовану гепарином (20Од/мл), стандартним способом 2 0,1мл крові змішують з 0,1мл 0,1% розчину нітросинього тетразолія 3 Інкубують реакційну суміш ЗО хвилин при 37 С ю о ю 50567 4 Із реакційної суміші готують мазки середньої густини, шляхом розподілення її на предметному СКЛІ 5 Мазки фіксують стандартним способом 6 Мазки фарбують нейтральним червоним стандартним способом 7 Підраховують 100 нейтрофілів під імерсією, за допомогою світового мікроскопу 8 Нейтрофіли, що містять гранули формазану розподіляють по ступеням в залежності від об'єму, який займають гранули відносно цитоплазми клітин 9 Розраховують середній ЦИТОХІМІЧНИЙ індекс вмісту формазану у нейтрофілах, стандартним способом 10 Визначають рівень генерації супероксидного анюн-рад икала фагоцитуючими клітинами крові за показником їх ЦИТОХІМІЧНОГО індекса (Герасимов И Г, Игнатов ДЮ Функциональная неравнозначность нейтрофилов крови человека генерация активных форм кислорода // Цитология -2001 -Т 43 -К 5 -С 432 436 ) Суттєвими ознаками аналогу і винаходу, що збігаються є такі 1 Проведення лабораторного дослідження 2 Додавання до реакційної суміші розчину нітросинього тетразолія Незважаючи на технічну простоту виконання вказаного способу визначення генерації супероксидного анюн-рад икала фагоцитуючими клітинами крові, існує значна імовірність хибного визначення рівня генерації супероксидного анюнрад икала фагоцитуючими клітинами крові Це відбувається через те, що визначення рівня генерації супероксидного анюн-рад икалу фагоцитуючими клітинами крові, через облік результату безпосередньо у мазку, не завжди дає змогу чітко розрізнити між собою нейтрофіли і моноцити Відомо, ЩО МОНОЦИТИ здатні до генерації супероксидного анюн-радикалу у значній КІЛЬКОСТІ і тому, їх присутність у мазку може призводити до виникнення хибнозавищених результатів визначення рівня генерації супероксидного анюн-рад икала фагоцитуючими клітинами крові Крім того, наявність суб'єктивності при розрахунку результатів є додатковим негативним фактором, що значно погіршує точність і достовірність оцінки рівня генерації супероксидного анюн-рад икала фагоцитуючими клітинами крові, а також негативно впливає на відображення результатів дослідження Найбільш близьким за технічною суттєвістю та досягаємим результатом є спосіб визначення генерації супероксидного анюн-рад икала фагоцитуючими клітинами крові, що полягає у наступному 1 Отримують Змл крові, стабілізованої цитратом натрію стандартним способом 2 Розділяють фагоцитуючі клітини крові на моноцити та поліморфно-ядерні лейкоцити, за допомогою градієнта ЩІЛЬНОСТІ фікол-трюмбраст (ЩІЛЬНІСТЬ 1,080Г/СМ3) стандартним способом 3 Відмивають суспензію моноцитів тричі у фосфатно-сольовому буфері (рН-7,4) стандартним способом 4 Підраховують КІЛЬКІСТЬ МОНОЦИТІВ у суспензії стандартним способом 5 Вносять у пробірку 1мл суспензії з відомою КІЛЬКІСТЮ МОНОЦИТІВ 6 Центрифугуванням осаджають моноцити, надосадову рідину видбирають 7 До моноцитів додають 0,1 мл 0,2% розчину нітросинього тетразолія 8 Додають до реакційної суміші 0,1 мл фосфатно-сольового буферного розчину 9 Інкубують пробірку з реакційною сумішшю 1 годину при 37°С 10 Центрифугують реакційну суміш, надосадову рідину відбирають 11 Осад клітин фіксують метанолом 10 хвилин 12 Осад ДВІЧІ промивають фосфатносольовим буфером 13 До реакційної суміші додають 1,38мл 2М розчину гідроксиду калію і 1,62мл диметилсульфоксиду 14 Вимірюють оптичну ЩІЛЬНІСТЬ розчину формазану при 492нм у кюветі товщиною 1см за допомогою спектрофотометра 15 Визначають КІЛЬКІСТЬ формазану за калібровочним графіком, побудованим на основі даних оптичної ЩІЛЬНОСТІ, отриманих при відновленні стандартних розчинів нітросинього тетразолію різних концентрацій у суміші розчинів гідроксиду калію і диметилсульфоксиду 16 Визначають рівень генерації супероксидного анюн-рад икала фагоцитуючими клітинами крові (моноцитами) за КІЛЬКІСТТЮ формазану (Мельников ВП Тест восстановления нитросинего тетразолия мононуклеарньши фагоцитами // Лабораторное дело -1991 -N 8 С 51 - 53) Суттєвими ознаками прототипу і винаходу, що збігаються, є такі 1 Розділення фагоцитуючих клітин крові на моноцити та поліморфно-ядерні лейкоцити за допомогою градієнта ЩІЛЬНОСТІ фікол-трюмбраст 2 Додавання до фагоцитуючих клітин крові 0,2% розчину нітросинього тетразолію 3 Додавання до реакційної суміші 2М розчину гідроксиду калію та диметилсульфоксиду 4 Вимірювання оптичної ЩІЛЬНОСТІ розчину формазану за допомогою спектрофотометра 5 Визначення КІЛЬКОСТІ формазану Не зменшуючи значення вказаного способу, слід зауважити, що проводячи розділення фагоцитуючих клітин крові на моноцити та поліморфно-ядерні лейкоцити, у способі визначають рівень генерації супероксидного анюнрадикалу тільки моноцитами Здатність поліморфно-ядерних лейкоцитів до генерації супероксидного анюн-радикалу залишається у цьому способі без уваги, що зменшує інформативність даного способу КІЛЬКІСТЬ виділених моноцитів у суспензії підраховується у камері Горяєва загально прийнятим способом, при якому можливе визначення моноцитів тільки за їх розмірами, без оцінки морфології ядра клітин, що робить їх підрахунок недостатньо точним До того ж, при розрахунку кінцевого результату рівня 50567 продукції супероксидного анюн-рад икала на про інтенсивність генерації вільних радикалів та їх мільйон моноцитів, імовірність хибно-завищєного джерела в організмі людини Тому паралельне результату значно зростає Все це призводить до визначення здатності поліморфно-ядерних зменшення достовірності результатів дослідження лейкоцитів і моноцитів крові до генерації вказаного Крім того, інкубація суспензії моноцитів з розчином радикала, дозволяє достатньо точно визначити нітросинього тетразолію триває одну годину, що їхній внесок до інтенсивності вільнорадикальних не є загальноприйнятим терміном тривалості реакцій в організмі Крім того, застосування у інкубації Відомо, ЩО збільшення терміну інкубації розрахунках відомого факту здатності 2Моль суспензії моноцитів з розчином нітросинього супероксидного анюн-радикалу відновлювати тетразолію приводить до ВІДПОВІДНОГО збільшення 1 Моль нітросинього тетразолію дає можливість рівня відновлення нітросинього тетразолію у кількісної (у молях) оцінки генерації формазан При цьому, залежність між рівнем супероксидного анюн-радикалу фагоцитуючими генерації супероксидного анюн-радикалу та клітинами крові і дозволяє суттєво підвищити утворенням формазану пропорційна лише до 20 точність результату оцінки генерації ЗО хвилини Таким чином інкубація реакційної супероксидного анюн-рад икала Таким чином, суміші впродовж однієї години призводить до можливість паралельної оцінки генерації зниження точності вказаного методу Процедура супероксидного анюн-рад икала поліморфноприготування стандартних зразків, шляхом ядерними лейкоцитами та моноцитами крові з зважування мікрограмових кількостей нітросинього КІЛЬКІСНИМ відображенням отриманих результатів, тетразолію, вносить додаткових помилок ще й на дозволяє оцінити здатність вказаних клітин до етапі побудови калібровочного графіка, що значно генерації супероксидного анюн-рад икала з погіршує відтворюваність і достовірність високим ступенем точності, достовірності і результатів дослідження відтворюваності результатів лабораторного дослідження В основу винаходу поставлено задачу удосконалення способу оцінки генерації супероксидного анюн-рад икала фагоцитуючими клітинами крові, шляхом паралельного аналізу суспензії мононуклеарних та поліморфно-ядерних лейкоцитів, зміни довжини хвилі реєстрації оптичної ЩІЛЬНОСТІ розчину формазану та шляхом додаткових розрахунків за формулою, що дозволить підвищити точність, відтворюваність та достовірність результатів лабораторного дослідження Поставлена задача вирішується тим, що у способі визначення рівня генерації супероксидного анюн-рад икала фагоцитуючими клітинами крові, що полягає у розділенні фагоцитуючих клітин крові на моноцити та поліморфно-ядерні лейкоцити за допомогою градієнта ЩІЛЬНОСТІ фікол-трюмбраст, додаванні до фагоцитуючих клітин крові 0,2% розчину нітросинього тетразолію, додаванні до реакційної суміші 2М розчину гідроксиду калію та д и мети л сульфоксид у, вимірюванні оптичної ЩІЛЬНОСТІ розчину формазану за допомогою спектрофотометра та визначенні КІЛЬКОСТІ формазану, новим є те, що паралельно аналізують суспензію моноцитів та поліморфноядерних лейкоцитів, шкубують реакційну суміш 20 хвилин, вимірюють оптичну ЩІЛЬНІСТЬ розчину формазану при 540нм та визначають рівень генерації супероксидного анюн-рад икала фагоцитуючими клітинами крові за формулою Х=А/Вх2хЮ3, де, X - рівень супероксидного анюн-радикалу (мкМ на 103 фагоцитуючих клітин крові), А - КІЛЬКІСТЬ формазану у пробі (мкМ), В - абсолютний вміст фагоцитуючих клітин крові у пробі, 2, 103 - алгебраїчні коефіцієнти Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає у наступному визначення рівня генерації супероксидного анюн-рад икала лише поліморфно-ядерними лейкоцитами чи моноцитами крові не дає достатньо повної уяви Для визначення показника норми нами було обстежено 55 практично здорових осіб Серед обстежених здорових осіб були представлені різні ВІКОВІ групи (згідно рекомендацій ВОЗ), середній вік склав 38,6+15,3 року, жінок було 37(67,3%), ЧОЛОВІКІВ -18(32,7%) Після обчислення результатів обстеження групи здорових осіб, рівень генерації супероксидного анюн-радикала на тисячу фагоцитуючих клітин крові склав 0,46+0,05 (межі коливань від 0,24 до 0,88мкМ), із них, на тисячу поліморфно-ядерних лейкоцитів цей показник склав 0,400+0,045мкМ (межі коливань від 0,2 до 0,82мкМ), на тисячу мононуклеарних лейкоцитів - 0,34+0,04мкМ (межі коливань від 0,13 до 0,78мкМ) Спосіб здійснюється таким чином 1 Отримують 4мл крові, стабілізованої трилоном Б, стандартним способом 2 Розділяють фагоцитуючі клітини крові на мононуклеарні та поліморфно-ядерні лейкоцити на 3 градієнті ЩІЛЬНОСТІ фікол-трюмбраст (1,080г/см ) стандартним способом 3 Збирають у окремі пробірки кільце мононуклеарних лейкоцитів (над розчином градієнта), та поліморфно-ядерні лейкоцити (під шаром розчину градієнту) 4 Отримані суспензії фагоцитуючих клітин крові відмивають тричі і визначають життєздатність мононуклеарних та поліморфноядерних лейкоцитів в тесті з трипановим синімеозином Суспензії клітин беруть у роботу тільки при КІЛЬКОСТІ життєздатних клітин не менше, ніж 97% 5 Підраховують КІЛЬКІСТЬ мононуклеарних і поліморфно-ядерних лейкоцитів в отриманих суспензіях із застосуванням фарби ДозмороваЗадорожного 6 Паралельно аналізують суспензію мононуклеарних та поліморфно-ядерних лейкоцитів 7 У окремих пробірках змішують по 0,1 мл суспензії мононуклеарних та поліморфно-ядерних 50567 лейкоцитів з 0,1мл 0,2% розчином нітросинього тетразолію 8 Інкубують пробірки з реакційною сумішшю 20 хвилин при 37°С 9 Після інкубації реакційну суміш центрифугують, надосадову рідину відбирають 10 Осад клітин тричі відмивають у фосфатносольовому буфері 11 Після відмивання до реакційної суміші додають по 0,2мл 2М розчину гідроксиду калію і 0,2мл диметилсульфоксиду 12 Вимірюють оптичну ЩІЛЬНІСТЬ розчину формазану при 540нм у кюветі, товщиною 1см за допомогою спектрофотометра 13 Визначають рівень генерації супероксидного анюн-рад икала фагоцитуючими клітинами крові, за формулою Х=А/Вх2хЮ3, де, X - рівень супероксидного анюн-радикалу (мкМ на тисячу фагоцитуючих клітин крові), А - КІЛЬКІСТЬ формазану у пробі (мкМ), В - абсолютний вміст фагоцитуючих клітин крові у пробі, 2, 103 - алгебраїчні коефіцієнти Приклад Хворій Р 48 років надійшов у пульмонолопчне відділення Запорізької обласної клінічної лікарні зі скаргами на слабкість, СПІТНІЛІСТЬ, головний біль, задуху при найменшому фізичному навантаженні, кашель з харкотинням Вважає себе хворим на протязі 22 років, коли після переохолодження, на тлі фебрильної температури з'явився кашель з харкотинням, задуха, що виникала при незначному фізичному навантаженні Згодом хворий тричі знаходився на стаціонарному лікуванні з приводу хронічного бронхіту, одержував антибактеріальну, протизапальну та бронхолітичну терапію За тиждень до надходження в клініку, після перенесеної гострої респіраторної вірусної інфекції, з'явилися вищезазначені скарги на тлі підвищеної температури, і хворий був госпіталізований для лікування загострення захворювання Анамнез життя - без особливостей, спадкової патології в родині не виявлено Пацієнт палить на протязі ЗО років, ІНШІ ШКІДЛИВІ ЗВИЧКИ заперечує, алергологічний анамнез не обтяжений Об'єктивно спостерігаються наступні зміни При огляді відзначається участь допоміжних м'язів в акті дихання При пальпації голосове тремтіння дещо послаблене, верхівковий поштовх визначається нечітко Перкуторно - над всією поверхнею легеневих полів звук з коробковим ВІДТІНКОМ, аускультативно ДІЯЛЬНІСТЬ серця правильна, тони приглушені, в легенях дихання жорстке, велика КІЛЬКІСТЬ розсіяних сухих та вологих хрипів, більше у нижніх відділах Частота дихання 26 за 1 хвилину, дихання поверхневе Артеріальний тиск у момент надходження 155 і 95мм рт ст, пульс 74 удари за хвилину, задовільних властивостей На електрокардіограмі - ознаки гіпертрофії міокарду правого шлуночка, порушення процесів реполяризацм в правих грудних відведеннях, неповна блокада правої ніжки пучка Гіса При ехокардюграфічному дослідженні спостерігається збільшення порожнини правого шлуночка, потовщення 8 передньої стінки правого шлуночка та міжшлуночкової перетинки, парадоксальний рух міжшлуночкової перетинки у систолу, помірне зниження скоротливих властивостей лівого шлуночка При рентгенологічному дослідженні у легенях посилений судинний малюнок, корені структурні, тяжисті з обох сторін Бронхоскопічно виявлені ознаки ендобронхіту Спірографічне дослідження виявило порушення вентиляції за обструктивним типом При лабораторному дослідженні харкотиння слизисто-гнійне, лейкоцити на дві третини поля зору Враховуючи скарги хворого, клінічну картину захворювання, дані об'єктивного дослідження та зважаючи на результати додаткових методів дослідження, хворому був поставлений КЛІНІЧНИЙ діагноз Хронічний обструктивний бронхіт, загострення Емфізема Пневмосклероз Легенева недостатність III ступеня Недостатність кровообігу ІІ-а стадії Для визначення стану кисень-залежного метаболізму лейкоцитів хворого, було проведено визначення рівня генерації супероксидного анюнрадикалу фагоцитуючими клітинами крові загальновідомим, та запропонованим нами способом Після визначення рівня генерації супероксидного анюн-радикалу фагоцитуючими клітинами крові, ЦИТОХІМІЧНИЙ индекс склав 1,28од (верхня межа норми - 1,1од), що свідчило про високий рівень генерації супероксидного анюн-радикалу фагоцитуючими клітинами крові, але такий значний показник рівня генерації супероксидного анюн-радикалу фагоцитуючими клітинами крові не відповідав стану хворого, у якого були КЛІНІЧНІ ознаки імунодефіциту Тому вказаний результат визначення генерації супероксидного анюн-радикалу фагоцитуючими клітинами крові слід було б вважати артефактом у даного хворого, та він не може бути використаний у лікувально-діагностичному процесі Після визначення рівня генерацмсупероксидного анюнрадикалу фагоцитуючими клітинами крові запропонованим нами способом, рівень генерації супероксидного анюн-рад икала фагоцитуючими клітинами крові склав 0,97мкМ, в тому числі у перерахунку на тисячу поліморфно-ядерних і моноцитів, цей показник склав ВІДПОВІДНО 0,38МКМ та 0,72мкМ, тобто був в межах норми (для поліморфно-ядерних лейкоцитів) і в районі верхньої межі норми (для моноцитів) ВИСОКИЙ рівень генерації супероксидного анюн-радикалу моноцитами, з урахуванням значної інфільтрації ними легеневої тканини, був фактором ризику розвитку оксидативного пошкодження тканин організму і насамперед легеневої тканини і вказував на хронізацію процесу запалення Отримані дані рівня генерації супероксидного анюн-радикалу фагоцитуючими клітинами крові, дозволили внести корекцію у запроваджену терапію, до якої були додані ліки з групи імуномодуляторів, для стимулювання активності полімарфно-ядерних лейкоцитів Через 3 тижні комплексного лікування, при контрольному обстежені, поряд з поліпшенням клінічної картини захворювання і позитивною динамікою даних інструментальних досліджень, спостерігалося збільшення рівня генерації супероксидного аніон 9 50567 10 радикалу фагоцитуючими клітинами крові до дозволило з високим ступенем точності та 1,23мкМ, в тому числі - поліморфно-ядерними достовірності визначити рівень генерації лейкоцитами до 0,64мкМ, генерація супероксидного анюн-радикалу, вчасно провести супероксидного анюн-радикалу моноцитами патогенетично-обумовлену терапію і запобігти майже не змінилась, склавши 0,75мкМ Таким появі ускладнень чином, використання способу, що пропонується, ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71