Метод добору зрілих сперматозоїдів для запліднення in vitro

1. Метод добору зрілих сперматозоїдів для запліднення in vitro, що включає приготування препарату еякуляту для оцінки та морфологічний відбір, з виготовленого препарату, сперматозоїдів, при їх збільшенні, для подальшого їх використання для запліднення, який відрізняється тим, що додатково здійснюють культивування зразків виготовленого препарату еякуляту у розчині натрієвої солі гіалуронової кислоти, після чого у цих зразках проводять попередній відбір популяції зрілих сперматозоїдів, шляхом їх мікроскопічного дослідження, а подальший морфологічний відбір здійснюють серед отриманої популяції зрілих сперматозоїдів. 2. Метод добору за п. 1, який відрізняється тим, що культивування зразків препарату еякуляту здійснюють у 0,1 М розчині натрієвої солі гіалуронової кислоти протягом, не менше, 30 хвилин. 3. Метод добору за пп. 1, 2, який відрізняється тим, що мікроскопічне дослідження оброблених гіалуроновою кислотою зразків препарату еякуля U 2 (19) 1 3 кислоти забезпечує вже через 8-30 днів підвищення концентрації сперматозоїдів за рахунок їх меншої дегенерації, збільшення долі морфологічно нормальних форм за рахунок нормалізації ана- і катаболізму при сперміогенезі, підвищення рухливості за рахунок стимуляції енергетичного обміну. Перелічені види лікування відносяться до традиційних методів визначення запліднюючої здатності сперми, коли до уваги беруться такі критерії, як концентрація сперматозоїдів, їх рухливість та морфологія. Всі ці критерії, безумовно, дуже важливі для аналізу зразків сперми, проте, на сьогодні пацієнти з тяжкими формами чоловічого безпліддя не можуть бути успішно виліковані, використовуючи традиційні методи лікування. Надзвичайно низька кількість сперматозоїдів, знижена рухливість і морфологічні аномалії чоловічих статевих клітин є причиною відсутності запліднення при використанні традиційних методів. Задля подолання цих проблем було розроблено декілька процедур допоміжного запліднення, що базуються на мікроманіпуляціях з ооцитами і сперматозоїдами [1]. Кульмінацією прогресу у цій галузі стало ICSI (intracytoplasmic sperm injection) ін'єкція одного сперматозоїда безпосередньо в ооплазму [2]. На сьогодні, ICSI є єдиним можливим методом для подолання чоловічого безпліддя. Цей метод має потенціал до вдосконалення, адже у випадках важких форм чоловічого безпліддя ефективність лікування залишається низькою. Причиною відсутності запліднення у деяких випадках як при проведенні традиційного запліднення in vitro [3], так і при проведенні ICSI [4], є вплив батьківського генетичного матеріалу на ранній розвиток ембріону. Вклад батьківського фактора в ранній ембріогенез довгий час був недооцінений. Чоловіча статева клітина або сперматозоїд несе в собі не лише гаплоїдний геном. На сьогодні відомо, що сперматозоїд також містить фактори, які відіграють ключову роль у сингамії пронуклеусів, ініціації перших мітозів створеного ембріона і епігенетичній регуляції нового диплоїдного геному [5]. Поряд з генетичними аномаліями, епігенетичні аномалії сперматозоїдів є основними причинами ідіопатичного чоловічого безпліддя і можуть впливати на ефективність лікування [6]. З'являється все більше даних щодо перенесення генетичних і епігенетичних помилок вертикально (від батьків до дітей) завдяки використанню ICSI. Це було б неможливо без застосування ICSI, без механічного введення сперматозоїда у яйцеклітину. Прикладами цього є наслідування мікроделецій Υ хромосоми, у першу чергу AZFc [7] та синдрому Ангельмана та Беквік-Відемана [8]. Саме тому, ретельність, з якою морфологічно нормальні сперматозоїди повинні бути вибрані для ICSI, набуває вирішального значення для підвищення ефективності лікування чоловічого безпліддя у програмах екстракорпорального запліднення. Кінцевою метою є розробка оптимальних критеріїв відбору та мінімізація суб'єктивних факторів при відборі сперматозоїдів. 50633 4 Так, відомий спосіб діагностики чоловічого безпліддя, що може бути використаний у допоміжних репродуктивних технологіях для збільшення частоти настання вагітності при лікуванні у програмах екстракорпорального запліднення, за рахунок відбракування зразків сперми, що містить клітини з порушеною упаковкою (структурою) хроматину - генетичного матеріалу чоловічих статевих клітин (патент RU 2118822, опубл. 10.09.1998 p.). Стан хроматину сперматозоїдів оцінюють, порівнюючи інтенсивність флуоресценції ядер клітин, пофарбованих бромистим етідієм, перед та після оброблення їх гепарином. Якщо у значної частини клітин (більше 30%) інтенсивність флуоресценції підвищена початково, або після обробки гепарином вона збільшується більше, ніж у два рази у більше, ніж 50% клітин, то такі зразки сперми відбраковують. Так як вірогідність настання вагітності при заплідненні такими сперматозоїдами низька. Такий спосіб діагностики, дійсно, не потребує використання складного обладнання, процедура обробки зразків займає небагато часу. Але застосування даного методу унеможливлює використання відібраних сперматозоїдів для запліднення, адже цей метод базується на застосуванні хімічних реагентів, що проникають всередину клітини. Цей метод є лише діагностичним і не може бути використаним у клінічній практиці для оцінки сперматозоїдів перед заплідненням in vitro. Найбільш близьким до методу, що заявляється, є метод відбору окремих сперматозоїдів для інтрацитоплазматичної мікроін'єкції, відповідно до якого, для оглядової мікроскопії використовують нативний препарат, приготований зі свіжого еякуляту, на збільшенні х4000 (заявка US 2003039953A1, опубл. 27.02.2003). Відбирають тільки окремі морфологічно нормальні сперматозоїди з ядрами, що мають правильну овальну форму певної довжини й ширини, та містять хроматину менше 4% вакуолі від усього ядерного простору. Відбір здійснюють за допомогою мікроманіпулятора та скляних капілярів. Такий метод, дійсно, забезпечує певну точність морфологічного відбору, і, як наслідок, збільшення частоти настання вагітності при екстракорпоральному заплідненні. Але у даному способі по-перше, використовуються застарілі оптичні і цифрові засоби, що було суттєво вдосконалено протягом останніх семи років. По-друге, відбір у даному способі базується на відборі сперматозоїдів лише за певними аномаліями без застосування комплексної оцінки сперматозоїдів. Сперматозоїди, що виглядають як морфологічно нормальні при такому збільшенні насправді можуть мати різноманітні структурні аномалії. Також використовуючи даний спосіб неможливо відібрати зрілі сперматозоїди, адже за морфологічними критеріями їх неможливо виокремити. В основу корисної моделі поставлена задача підвищити ефективність лікування чоловічого безпліддя у програмах екстракорпорального запліднення, за рахунок удосконалення методу дослідження та відбору сперматозоїдів з найменшими аномаліями для запліднення in vitro. 5 Поставлена задача вирішується за рахунок того, що метод відбору сперматозоїдів включає приготування препарату еякуляту для оцінки та морфологічний відбір, з виготовленого препарату, сперматозоїдів, при їх збільшенні, для подальшого їх використання для запліднення. Відповідно до технологічного вирішення, що заявляється, додатково здійснюють культивування зразків виготовленого препарату еякуляту у 0,1 Μ розчині натрієвої солі гіалуронової кислоти протягом, не менше, 30 хвилин. Після чого, у зразках, оброблених гіалуроновою кислотою, проводять попередній відбір популяції зрілих сперматозоїдів, шляхом їх мікроскопічного дослідження за допомогою мікроскопу на збільшенні не менше х400 методом фазовоконтрастної мікроскопії. Відбір зрілих сперматозоїдів здійснюють мікроманіпулятором та мікроголкою з внутрішнім діаметром не більше 5 μm та кутом згинання голки не більше 35° шляхом створення від'ємного тиску мікроінжектором. Подальший морфологічний відбір здійснюють серед отриманої популяції зрілих сперматозоїдів за жорсткими критеріями Крюгера, за допомогою мікроскопу та широкоформатних плазмених панелей, на збільшенні не менше х6300, завдяки використанню прозорого шаблону, що накладають на монітор. При цьому, шаблон виготовляють шляхом масштабування еталонних розмірів голівки сперматозоїду: довжина 4.75 ± 0.28 μm, ширина 3.28 ± 0.20 μm, співвідношення довжини до ширини - від 1,5 до 1,75, при цьому, акросома має займати від 40% до 70% площі всієї голівки. Експозиція сперматозоїдів протягом 30 хвилин у 0,1 М розчині натрієвої солі гіалуронової кислоти та подальший морфологічний добір дозволяє відібрати сперматозоїди з найвищим репродуктивним потенціалом. Відомо, що зрілі сперматозоїди мають низький рівень одноланцюгових розривів ДНК та хромосомних анеуплоїдій, що є необхідною умовою для нормального запліднення та активації яйцеклітини. З іншого боку, незрілі сперматозоїди не можуть взаємодіяти з гіалуроновою кислотою. Застосування відбору сперматозоїдів на основі гіалуронового гідрогелю дозволяє максимально наблизити відбір сперматозоїдів in vitro до умов, що притаманні відбору in vivo. Незрілі чи неживі сперматозоїди не можуть взаємодіяти з гіалуроновою кислотою, тому застосування сперматозоїдів на основі їх здатності до зв'язування з гіалуроновою кислотою є значним вдосконаленням в репродуктивних технологіях. Гіалуронова кислота є фізіологічним компонентом клітин кумулюсу яйцеклітини, тому не виникає будь-яких питань щодо етичності використання даного виду селекції сперматозоїдів. Відбір сперматозоїдів, що не лише є зрілими, а не мають структурних аномалій дозволяє підвищити основні показники результативності культивування ембріонів in vitro. Більшість аномалій є можливим ідентифікувати лише на збільшенні в х6300. 50633 6 Відбір сперматозоїдів під великим збільшенням дозволяє ідентифікувати найменші внутрішньоядерні вакуолі сперматозоїда. Наявність таких вакуолей може бути свідченням дефектів на молекулярному рівні, що відповідають за реорганізацію хроматину протягом дозрівання сперматозоїдів. В свою чергу помилки у реорганізації хроматину можуть спричиняти пошкодження ДНК як зовнішніми, так і внутрішніми активними радикалами кисню [9]. Тому використання відбору сперматозоїдів на збільшенні х6300 може бути основою для відбору сперматозоїдів з нижчим рівнем фрагментації ДНК. Таким чином, метод, що заявляється, дає можливість ідентифікувати найменші аномалії будови сперматозоїду, отримати більше інформації для прийняття рішення щодо селекції певного сперматозоїду для запліднення. Що стане запорукою отримання ембріонів високої якості, що безперечно, є необхідною умовою народження здорової дитини. Заявлений метод здійснюється наступним чином. У чашку Петрі (60 mm, Nunc, Denmark) наносили декілька краплин по 10 μl 0,1 Μ розчину натрієвої солі гіалуронової кислоти та покривали шаром мінеральної олії (Global, USA). Всі маніпуляції проводили без застосування нагрівальних столиків при кімнатній температурі - 22-24°С. Через 30 хвилин у кожну краплину додавали по 10 μl суспензії, що містить сперматозоїди. Для приготування сперми використовували двошаровий градієнт щільності згідно з протоколом виробника (Cook, Ireland): 1. 3 мл 40% розчину Percoll нашаровували на 3 мл 80% Percoll у конічній стерильній пробірці. 2. Зверху на 40% розчин нашаровували весь наявний розріджений еякулят та центрифугували протягом 20-ти хвилин при 400g (що для Labofuge 400 відповідає 1800 об/хв при використанні ротора діаметром 20 см). 3. Осад ресусендували у 3 мл Sperm wash buffer (Global, USA) з подальшим центрифугуванням при 200g протягом 10 хв. (1100 об/хв для Labofuge 400). 4. Супернатант видаляли, а на осад обережно нашаровували 0,5 мл Global media (Global, USA) і залишали на 30 хвилин у інкубаторі (37°С, без СО2). Додавання суспензії сперматозоїдів здійснювали шляхом вприскування під шаром олії з подальшим обережним перемішуванням отриманого розчину. Через 30 хвилин зрілі сперматозоїди виявляли завдяки їх зв'язуванню з гіалуроновою кислотою. Такі сперматозоїди робили активні рухи хвостом, проте поступальний рух вперед був відсутній. Підбір оптимальної концентрації залежно від параметрів спермограми (кількість активнорухливих і неживих сперматозоїдів) проводили методом серійних розведень. Зрілі сперматозоїди відбирали мікроголкою (внутрішній діаметр голки - 5 μm, кут згинання голки - 35°, Cook, Ireland) шляхом створення від'ємного тиску мікроінжектором (ІМ-6, Narishige). Відбір здійснювали за допомогою мікроскопу на збіль 7 шенні х400 методом фазово-контрастної мікроскопії. Після цього сперматозоїди переносили у мікрокраплини для проведення морфологічного добору. Морфологічний аналіз проводився при збільшенні х6600, яке було досягнуто завдяки використанню мікроскопа IX 71, DIC оптики (Nomarski differential interference contrast), об'єктиву Uplan Apo 100 oil/1.50 (значення числової апертури конденсора дорівнювало 0,55), фотокамери Olympus DP 20 та широкоформатних плазмених панелей (розмір діагоналі 533,4 мм). Виходячи з наявних літературних даних [10], було взято до уваги шість параметрів сперматозоїда (три головних і три другорядних), що за англійською абревіатурою було названо HAVBIC (Head, Acrosome, Vacuole, Basis, Insertion, Cytoplasmic droplet). До головних було віднесено: будову головки, наявність вакуолей і структуру основи сперматозоїда. До другорядних було віднесено: будову акросоми, хвостика та наявність залишків цитоплазми на шийці чи головці сперматозоїда. На Фіг.1 представлено результати застосування гіалуронової кислоти у заявленій концентрації 0,1 М протягом 30 хвилин з подальшим відбором сперматозоїдів, що провзаємодіяли з гіалуроновою кислотою на збільшенні х6300 у порівнянні з контрольною групою (без гіалуронової кислоти). Наведені результати свідчать, що застосування гіалуронової кислоти та морфологічного добору призводить до підвищення частоти запліднення яйцеклітин in vitro. Також нами було зафіксовано достовірне збільшення кількості завершених циклів та циклів з кріоконсервацією ембріонів, що свідчить про покращення якості ембріонів у порівнянні з контролем. На Фіг.2 наведено результати застосування гіалуронової кислоти у заявленій концентрації 0,1 М протягом 30 хвилин з подальшим відбором сперматозоїдів, що провзаємодіяли з гіалуроновою кислотою на збільшенні х6300 у порівнянні з контрольною групою (без гіалуронової кислоти). Аналіз отриманих результатів засвідчив збільшення частоти формування бластоцист, зниження кількості перенесених у порожнину матки ембріонів. Частота настання клінічних вагітностей є найважливішим показником ефективності лікування методами допоміжних репродуктивних технологій. Збільшення частоти настання вагітності при застосуванні гіалуронової кислоти і морфологічного добору є важливим вдосконаленням наявних методів екстракорпорального запліднення. Морфологія сперматозоїда грає визначальну роль у процесах раннього ембріогенезу, що визначає подальший розвиток ембріону. Описаний спосіб дозволяє отримати більше інформації і оцінити більше параметрів сперматозоїдів у порівнянні з аналогами. Цей метод дозволяє не лише поновому подивитися на чоловічі статеві клітини, а й 50633 8 відібрати серед них зрілі і використати саме їх для запліднення in vitro. Розробка і впровадження заявленого методу відбору сперматозоїдів може значно підвищити ефективність лікування безпліддя в програмах екстракорпорального запліднення, і, як наслідок, збільшити частоту настання вагітності у пацієнтів з попередніми невдалими спробами при тератозооспермії, а також, при використанні тестикулярних сперматозоїдів. Джерела інформації: 1. Steptoe P. C, Edwards R.G.. Birth after the reimplantation of a human embryo. Lancet 1978; 2: 366. 2. Palermo G., Joris Η., Camus Μ., Devroey P., Van Steirteghem A. C. Outcome of 300 cycles of assisted fertilization by subzonal insemination and intracytoplasmic sperm injection. In the abstract book of the International Symposium on Preimplantation Genetics and Assisted Fertilization. Brussels, Belgium. February 21-22, 1992. 3. Küpker W., al-Hasani S., Schulze W., Kühnel W., Schill Т., Felberbaum R., Diedrich K.. Morphology in intracytoplasmic sperm injection: preliminary results. J Assist Reprod Genet. 1995 Oct;12(9):620-6. 4. Mansour R. Т., Aboulghar Μ. Α., Serour G. I., Amin Y. M., Ramzi A. M.. The effect of sperm parameters on the outcome of intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril. 1995 Nov;64(5):982-6. 5. De Vos Α., Van De Velde H., Joris Η., Verheyen G., Devroey P., Van Steirteghem Α.. Influence of individual sperm morphology on fertilization, embryo morphology, and pregnancy outcome of intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril. 2003 Jan;79(l):42-8. 6. Tesarik J. Paternal effects on cell division in the human preimplantation embryo. Reprod Biomed Online. 2005 Mar;10(3):370-5. Review. 7. Kent-First M. G., Kol S., Muallem A. The incidence and possible relevance of Y-linked microdeletions in babies born after intracytoplasmic sperm injection and their infertile fathers // Mol. Hum. Reproduction. - 1996. - Vol. 2. - No. 12. - P. 943 – 950. 8. Liebaers I., Bonduelle Μ., Van Assche E. Sex chromosome abnormalities after intracytoplasmic sperm injection // Lancet. - 1995. - Vol. 346 (8982). P. 1095.) 9. Sakkas D, Seli E, Bizzaro D et al. 2003 Abnormal spermatozoa in the ejaculate: abortive apoptosis and faulty nuclear remodelling during spermatogenesis. Reproductive BioMedicine Online 7, 428-432. 10. Cassuto N. G., Bouret D., Plouchart J. M., Jellad S., Vanderzwalmen P., Balet R., Larue L., Barak Y.. A new real-time morphology classification for human spermatozoa: a link for fertilization and improved embryo quality. Fertil Steril. 2009 Nov;92(5): 1616-25. 9 Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко 50633 Підписне 10 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601