Спосіб прогнозування здатності ооцитів до запліднення при лікуванні безплідності в програмі запліднення in vitro

Спосіб прогнозування здатності ооцитів до запліднення при лікуванні безплідності в програмі запліднення in vitro, що включає визначення активності ферменту супероксиддисмутази у фолікулярній рідині та прогнозування зниження здатності ооцитів до запліднення при високій активності супероксиддисмутази в фолікулярній рідині і, навпаки, високої здатності ооцитів до запліднення in vitro при низькій активності супероксиддисмутази в фолікулярній рідині, який відрізняється тим, що при активності супероксиддисмутази 2,3 ум од та вище прогнозують 0 - 33,3% запліднення ооцитів, при активності супероксиддисмутази 1,2 - 2,29 ум од прогнозують 33,4 - 66,6%, а при активності супероксиддисмутази 1,19 ум од та нижче прогнозують 66,7 -100% запліднення ооцитів Винахід відноситься до медицини, а саме до акушерства та гінекологи і може бути використаний в прогнозуванні ефективності запліднення ооцитів при лікуванні безплідності в програмі запліднення in vitro Відома велика КІЛЬКІСТЬ патологічних станів, при яких єдиним ефективним методом лікування безплідності є програма запліднення in vitro Ця технологія вже отримала широке розповсюдження в усьому СВІТІ Ефективність лікування безплідності методом запліднення in vitro досягає в середньому 20 - 30% у розрахунку на одну спробу (Лечение бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения / В И Грищенко, В И Пиняев, М П Петрушко, Л И Луцкая, И В Терпячая //Актуальные вопросы репродуктологии и криомедицины, X , 1998 е 135138, Dale В, Elder К, In vitro fertilization // Cambridge university press -1997 -P 102-107) фолікулярній рідині, здійснюють регуляцію і синхронізацію процесів дозрівання ооциту, овуляції, активації моторики маткових труб Склад фолікулярної рідини може служити біохімічним дзеркалом і відображати не тільки морфологічний, але і функціональний стан ооциту, його здатність до запліднення і розвитку повноцінного ембріона, або служити інструментом для прогнозування ефективності лікування безплідності Так, наприклад, відомий спосіб оцінки якості та ефективності процесів овуляції, дозрівання ооцитів, взаємодії гамет по активності перекисного окислювання ЛІПІДІВ В фолікулярній рідині (Takami М , Preston S L , Toyloy V А , Behrman H R Antioxidants reversibly inhibit the spontaneous resumption of meiosis//Am J Physiol - 1999 -V 276 -P 84-88) Відомо також, що процеси перекисного окислювання ЛІПІДІВ потенційно небезпечні і відіграють ведучу роль у розвитку багатьох патологічних станів (Sadam G R , Nadkarni G D Role of tissue antioxidant defence in thyroid cancers //Cancer Lett -1996 -V 109 -P 231-235) Встановлено, що реактивні кисневі сполуки безпосередньо або побічно беруть участь у процесі дозрівання ооцитів, і їх синтез є важливим регулюючим фактором 3 іншого боку, неконтрольоване підвищення інтенсивності процесів перекисного окислювання ЛІПІДІВ у З огляду на високу медичну і соціальну вагомість проблеми безплідності, актуальним є пошук причин невдач метода запліднення in vitro із метою підвищення ефективності лікування Одним із найважливіших факторів для запліднення в програмі запліднення in vitro є морфофункцюнальний стан ооцитів Фолікулярна рідина є середовищем, що бере участь в дозріванні яйцеклітини і має регулюючі функції Склад фолікулярної рідини не є постійним Динамічні біохімічні зміни, що відбуваються в (О о> (О о ю фолікулярній рідині негативно впливає на ооцит, зменшуючи його здатність до запліднення in vitro В таких умовах великого значення набувають механізми антиоксидантного захисту Одним з важливих антиоксидантних ферментів фолікулярної рідини є супероксиддисмутаза Відомо, що ооцити в змозі синтезувати цей фермент (Guerm Р, ЕІ Mouatassim S, Menezo Y Oxidative stress and protection against reactive oxygen species in the preimplantation embryo and its surroundmgs//Hum Reprod Update -2001 - № 7 -P 175-189) Дослідження останніх років показують, що ферментативні антиоксидантні системи присутні в фолікулярній рідині і мають велике зназначення в захисті клітин від продуктів перешеного окислення ЛІПІДІВ та реактивних кисневих сполук Так, наприклад, була імунопстохімічно визначена локалізація ферменту супероксиддисмутази в тканинах яєчника - його виявили в theca mterna і в фолікулярній рідині (Shiotam М , Noda Y , Nanmoto К , Imai К , Mori T , Fujimoto К, Ogawa К, Immunohistochemical localization of Superoxide dismutase in the human ovary // Hum Reprod - 1991 - Vol 6 -№10 -P 1349-1353) Було також проведене порівняльне дослідження активності супероксиддисмутази в плазмі крові та в фолікулярній рідині (Sabatmi L , Wilson С , Lower A , Al Shawaf T , Grudzmskas J G Superoxide dismutase activity in human folhcular fluid after controlled ovarian hyperstimulation in women undergoing in vitro fertilization // Fertil Stenl -1999 Vol 72 - № 6 - P 1027-1034) Автори виявили, що активність цього ферменту в ' фолікулярній рідині значно вище, чим в плазмі крові Встановлено також, що в випадках з високою активністю супероксиддисмутази знижується здатність ооцитів до запліднення Таким чином було встановлено взаємозв'язок між активністю супероксиддисмутази в фолікулярній рідині та заплідненням ооцитів in vitro Даний спосіб оцінки здатності ооцитів до запліднення in vitro, у якому інструментом служить активність супероксиддисмутази в фолікулярній рідині, є найбільш близьким по технологічній суті і результату, який може бути досягнутим до того, що заявляється, тому його обрано в якості прототипу Основним недоліком відомих аналогів, в тому числі і прототипу, є те, що вони відмічають тільки тенденції та властивості змін активності супероксиддисмутази в фолікулярній рідині при лікуванні безплідності методом запліднення m vitro, даючи якісну оцінку, але неспроможні точно спрогнозувати здатність ооцитів до запліднення ізза відсутності кількісної оцінки активності супероксиддисмутази У зв'язку з вищевикладеним, в основу винаходу покладено задачу підвищення точності прогнозування запліднення ооцитів при лікуванні безплідності в програмі запліднення in vitro шляхом кількісної оцінки активності супероксиддисмутази в фолікулярній рідині Задача, яку покладено в основу винаходу, вирішується тим, що у відомому способі, що 50696 включає визначення активності ферменту супероксиддисмутази у фолікулярній рідині, прогнозують зниження здатності ооцитів до запліднення при високій активності супероксиддисмутази і, навпаки, високу здатність ооцитів до запліднення in vitro при низькій активності супероксиддисмутази в фолікулярній рідині Згідно З винаходом, при активності супероксиддисмутази - 2,3ум од та вище прогнозують 0 - 33,3% запліднення ооцитів, при активності супероксиддисмутази - 1,2 - 2,29ум од прогнозують 33,4 - 66,6%, при активності супероксиддисмутази - 1,19ум од та нижче прогнозують 66,7 -100% запліднення ооцитів Можливість підвищення точності прогнозу була одержана завдяки КІЛЬКІСНІЙ ОЦІНЦІ активності антиоксидантного ферменту супероксиддисмутази у фолікулярній рідині Спосіб виконують слідуючим чином Перед початком лікування всі безплідні подружні пари обстежують за загальноприйнятою методикою Серед спеціальних методів дослідження в обов'язковому порядку здійснюють динамічне ультразвукове сканування органів малого тазу Дослідження проводять за допомогою вапнального секторального датчика з частотою сканування 7Мгц При індукції овуляції використовують загальноприйняті протоколи з наборами препаратів ФСГ (Metrodm, "Serono") і аналогів гонадотропін - рилізінг гормону (Suprefact, "Hoechst") Через 34 - 35 годин після введення тригерної дози ЧХГ (Profasi, "Serono") під ультразвуковим контролем здійснюють пункцію фолікулів і аспірацію ооцитів Відразу ж після пункції виявлені ооцити переносять з фолікулярної рідини у чисте середовище для культивування У зразках фолікулярної рідини визначають активність супероксиддисмутази, та прогнозують здатність ооцитів до запліднення in vitro Супероксиддисмутазну активність в зразках фолікулярної рідини оцінюють на підставі реакції гальмування автоокислення адреналіну за методом В С Гуревич і Е Е Дубшіной При активності супероксиддисмутази 2,3ум од та вище прогнозують 0 - 33,3% запліднення ооцитів, при активності супероксиддисмутази 1,2 2,29ум од прогнозують 33,4 - 66,6%, при активності супероксиддисмутази - 1,19ум од та нижче прогнозують 66,7 -100% запліднення ооцитів Вищевказані значення активності супероксиддисмутази були одержані експериментальним шляхом Були сформовані КЛІНІЧНІ групи з різним відсотком запліднення ооцитів in vitro Результати визначення активності супероксиддисмутази у виділених групах представлено в таблиці 50696 Таблиця КЛІНІЧНІ групи 1 група 66,7-100% запліднення (п = ЗО) 2 група 33,4 - 66,6% запліднення (п = ЗО) 3 група 0 - 33,3% запліднення (п = ЗО) Активність СОД ум од М ± м 0,8 ±0,1 1,6 ±0,2 3,0 ±0,2 Зазначені дані свідчили про значне підвищення активності ферменту супероксиддисмутази у фолікулярній рідині, одержаної в групах з низьким відсотком запліднення ооцитів in vitro Достовірність розходжень оцінювали з використанням критеріїв Фішера-Ст'юдента Також проводили кореляційний аналіз зв'язку між дослідженими показниками Виділені групи статистично не відрізнялися за віком пацієнток, КІЛЬКІСТЮ отриманих ооцитів і морфофункцюнальними властивостями еякуляту партнерів Максимальна активність супероксиддисмутази була зареєстрована в групі з найменшим відсотком запліднення (3-я група) Розходження в активності СОД між 1-ю групою та 2-ю і 3-ю групами були статистично достовірні (р < 0,01) При кореляційному аналізі буловстановлено, що активність супероксиддисмутази тісно пов'язана з відсотком запліднення ооцитів in vitro (r = -0,732) Таким чином було встановлено, що при підвищенні активності супероксиддисмутази в фолікулярній рідині достовірно знижується здатність ооцитів до запліднення in vitro Присутність ЛІНІЙНОГО зв'язку дозволила встановити межі діапазонів активності супероксиддисмутази за допомогою розрахунку значення середнього арифметичного між значеннями суміжних груп Для 1-ої групи була встановлена верхня межа - 1,19умод, для 3-ої групи - нижня межа - 2,3ум од Типова активність супероксиддисмутази для 2-ої групи була встановлена в інтервалі 1,2 - 2,29ум од Даний спосіб ілюструють слідуючи приклади 1 Хвора Р , 28 років, (історія хвороби № 110) звернулася для лікування безплідності Термін хвороби - 3 роки Із анамнезу відомо, що 3 роки тому хвора була оперована з приводу позаматкової вагітності Права маткова труба видалена При рентгенологічнім дослідженні було встановлено, що ліва маткова труба блокована в штрамуральному ВІДДІЛІ В результаті обстеження протипоказань до лікування безплідності із застосуванням програми запліднення in vitro не було виявлено При індукції овуляції був використаний загальноприйняті протокол з використанням препаратів Metrodm, "Serono" і Suprefact, "Hoechst" Через 35 годин після введення тригерної дози Profasi, "Serono", під ультразвуковим контролем була зроблена пункція фолікулів і аспірація оо-цитів Спремограма мужа - без відхилень від норми Було отримано 8 зрілих ооцитів При біохімічному дослідженні в фолікулярній рідині активність супероксиддисмутази - 0,67ум од Прогнозовано 66,7 -100% запліднення In vitro запліднилось 6 ооцитів (75% запліднення), розвилося 6 ембріонів, 4 з яких були перенесені в порожнину матки Через 2 тижні біохімічно встановлена вагітність 2 Хвора М , 29 років, (історія хвороби № 118) звернулася для лікування безплідності Термін хвороби - 6 років Із анамнезу відомо, що 6 років тому хвора була оперована з приводу позаматкової вагітності Ліва маткова труба видалена При рентгенологічнім дослідженні було встановлено, що ліва маткова труба являє собою пдросальпінкс В результаті обстеження протипоказань до лікування безплідності із застосуванням програми запліднення in vitro не було виявлено При індукції овуляції був використаний загальноприйняті протокол з використанням препаратів Metrodm, "Serono" і Suprefact, "Hoechst' Через 35 годин після введення тригерної дози Profasi, "Serono", під ультразвуковим контролем була зроблена пункція фолікулів і аспірація ооцитів Спремограма мужа без відхилень від норми Було отримано 12 зрілих ооцитівта 6 ооцитів з ознаками дегенерації При біохімічному дослідженні в фолікулярній активність супероксиддисмутази - 2,89ум од Прогнозовано 0 - 33,3% запліднення In vitro запліднилось 6 ооцитів (33,3% запліднення), розвилося 6 ембріонів - усі вони були перенесені в порожнину матки Вагітність не настала Таким чином, спосіб що заявляється з високою достовірністю дозволяє прогнозувати здатність ооцитів до запліднення in vitro ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71