Регенеративний патрон ізолюючого дихального апарата

Запропонований винахід відноситься до способів контролю функціонального стану мікроводоростей Chlorella vulgaris при рішенні задач біотестування та оцінки токсичності водяного середовища, як в лабораторних умовах, так і в природному середовищі та може бути використаний, зокрема при формуванні регламенту контролю біомоніторингу.

Відомий спосіб кількісної реєстрації інтенсивності флуоресценції мікроскопічних препаратів [1], згідно якого здійснюють відбір проби клітин з популяції, вводять її до вимірювальної камери на предметне скло (покрівне скло не обов'язко-ве) предметного столику флуоресцентного мікроскопу, мікроскопіювання проби, опромінювання збуджуючим світлом, в заданому діапазоні спектру, вимір інтенсивності флуоресценції нативного світіння клітин, що містять хлорофіл, у певній частині спектру, за яким визначають ступінь життєдіяльності клітин. До недоліків цього способу слід віднести:

- неможливість виміру інтенсивності флуоресценції та вмісту хлорофілу в одиничній клітині мікроводорості для оцінки стану популяції;

Відомий також спосіб оцінки рівню припустимих дій пошкоджуючого фактору на організми, що фотосинтезують [2], згідно якого з лабораторної культури мікроводоростей відбирають пробу для оцінки їхнього стану. Контроль функціонального показника водоростей здійснюють шляхом виміру повільної флуоресценції, яку визначають протягом заданого часу з отриманням кривої індукції. Ефективність фотосинтезу розраховують у вигляді різниці максимуму індукції та стаціонарного рівню, який визначається через 3... 5 хвилин з моменту опромінювання клітин збуджуючим світлом. Інтенсивність збуджуючого світла, встановлюють за величиною, яку знаходять із світлової залежності, а саме, на її плато. Показник ефективності фотосинтезу оцінюють у відносних одиницях у вигляді відношення

В даному способі передбачений проточний режим виміру, коли суспензія клітин безперервно прокачується через вимірювальну камеру із поверненням її до початкової ємності, у якій здійснюють інкубацію водоростей з токсикантом, що досліджується.

Недоліками способа є:

- неможливість контролю функціональної структури популяції одноклітиних мікроводоростей з використанням методів статистичного аналізу, так як в способі реалізований контроль середніх величин флуоресценції водоростей за всією сукупністю клітин популяції;

- відсутність комплексності оцінки як функціональної характеристики параметрів життєдіяльності клітин, що фотосинтезують, як на рівні її енергетичної підсистеми - ефективності первинних реакцій фотосинтезу, так і структурної - вмісту хлорофілу в одиночних клітинах з урахуванням їхнього розподілення в просторі та часі при дії факторів зовнішнього середовища.

Найбільш близьким до запропонованого способу, обраний прототипом є спосіб контролю функціональної структури популяції одиночноклітинних водоростей [3], згідно якого у відомому способі здійснюють відбір проби, розміщують її у термостатованій мікрокамері цитофлуориметра, освітлюють проби світлом заданої інтенсивності та спектрального складу, вимірюють інтенсивність флуоресценції хлорофілу клітин мікроводоростей, які ідентифікуються оператором, шляхом сканування об'єктива фотоелектронного вимірювача світла по площині мікрокамери з заданим розміром ділянки фотометрування, та поданні результатів із наступною оцінкою функціональної структури популяції за обраним критерієм.

До недоліків способа - прототипу необхідно віднести:

- тривалість проведення дослідів при оцінці функціональної структури популяції мікроводоростей;

- відсутність комплексності оцінки як функціональної характеристики параметрів життєдіяльності клітин, що фотосинтезують, як на рівні її енергетичної підсистеми - ефективності первинних реакцій фотосинтезу, так і структурної - вмісту хлорофілу в одиночних клітинах з урахуванням їхнього розподілення в просторі та часі при дії факторів зовнішнього середовища.

У основу винаходу поставлена задача створити спосіб контролю функціональної структури популяції мікроводоростей за показниками ефективності фотосинтезу та вмісту хлорофілу в одиночних клітинах з використанням статистичних методів обробки розподілень в умовах дії зовнішніх факторів в реальному масштабі часу.

Технічний результат, що може бути отриманий при здійсненні винаходу полягає в тому, що з'являється можливість здійснити оперативний контроль стану популяції одноклітинних мікроводоростей Chlorella vulgaris шляхом вимірювання люмінесцентних характеристик одиничних клітин, за якими визначаються ефективності первинних стадій фотосинтезу та вмісту хлорофіла водоростей.

Поставлена ціль досягається тим, що у відомому способі визначення функціональної структури популяції мікроводоростей Chlorella vulgaris, який включає відбір проби, поміщення її до термостатованої мікрокамери цитофлуориметра, освітлення проби світлом заданої інтенсивності та спектрального складу, з виміром інтенсивності флуоресценції хлорофілу а клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris, які ідентифікуються оператором, шляхом сканування об'єктива фотоелектронного вимірювача світла по площині мікрокамери із заданим розміром ділянки, що фотометрується, та поданні результатів із наступною оцінкою функціональної структури популяції за обраним критерієм, згідно винаходу, вимірюють інтенсивність збуджуючого світла, а інтенсивність флуоресценції вимірюють двічі: в максимумі індукції при низькій, в границях від 0,5 до 2,0Вт/м2, та, що насичує, в границях від 50 до 100Вт/м2, інтенсивностях світла, за результатами яких обчислюють величину ефективності первинних реакцій фотосинтезу, які використовуються в якості критерію функціональної активності мікроводоростей Chlorella vulgaris в популяції.

Новим також є те, що виміри флуоресценції мікроводоростей Chlorella vulgaris проводять при безперервному освітлені кювети світлом низької інтенсивності, а повторний вимір флуоресценції при інтенсивностях насичуючого світла, ведуть шляхом засвітлення камери на протязі 1...3сек., при цьому інтервали між засвітленнями встановлюють в границях від 5 до 60сек.

В даний час розроблені флюорометричні методи досліду, які дозволяють оцінювати ефективність первинних фотосинтетичних реакцій рослинного організму [4, 8]. Інтенсивність флуоресценції хлорофілу фотосинтетичного апарату клітини залежить від стану, в якому знаходиться реакційний центр II фотосистеми. Найбільш часто оцінку ефективності роботи фотосинтетичного апарату проводять за співставленням інтенсивностей флуоресценції в умовах, коли реакційні центри відкриті та закриті [6]. При цьому індукція флуоресценції - кінетична крива зміни інтенсивності флуоресценції у відповідь на вмикання світла, що збуджує, після тривалої темневої адаптації рослинного об'єкту - дозволяє отримати стан відкритих та закритих реакційних центрів та оцінити ефективність первинних стадій фотосинтезу [5]. Другим способом створення умов, при яких реакційні центри закриті, є використання деяких похідних мочевини (наприклад, монурон або діурон), які блокують ланцюг фотосинтетичного електронного транспорту [7]. В цьому випадку використовують відношення інтенсивностей стаціонарних рівнів флуоресценції хлорофілу нативних та оброблених інгібітором рослинних клітин. Цей метод використовували для оцінки стану фотосинтетичного апарату суспензій одноклітинних водоростей [5, 22, 23]. Однак, ці методи не можна використовувати для дослідження стану фотосинтетичного апарату одиночних клітин водоростей. Це зумовлено необхідністю фіксації місця знаходження кожної клітини в нативному препараті. Але надійна фіксація препарату без порушення його активності, особливо в умовах проточної камери, необхідної для введення інгібітору, є практично неможливою задачею. В той же час аналіз літературних даних вказує на те, що вимір флуоресценції є найбільш зручним та інформативним методом оцінки стану одиничних клітин [3].

Враховуючи, що до цього часу не розроблені методичні прийоми об'єктивної оцінки ефективності первинних реакцій фотосинтезу одиничної клітини мікроводоростей Chlorella vulgaris, для оцінки стану всієї популяції, необхідно розглянути можливості статистичних методів обробки імперичних даних функціональних характеристик одиничних клітин, що фотосинтезують, розподілених в просторі та часі, та адаптацію флюорометричних методів оцінки функціональної активності фотосинтетичного апарату одиничних клітин водорості для оцінки стану популяцій мікроводоростей Chlorella vulgaris при різних умовах культивування та дій хімічних факторів для оцінки токсичного ефекту.

Найбільш адекватним апаратом математичного моделювання позначених процесів є теорія біфуркацій дисипативних структур [4]. Разом з тим, корисними можуть виявитись й більш ординарні засоби обробки обчислювальної інформації, включаючи апроксимацію тригонометричними рядами функцій розподілення із наступним виявленням часової організації популяції мікроводоростей Qalorella vulgaris, а також виявлення залежностей відповідних градієнтів від параметрів отриманих розподілень в конкретних задачах [10, 14].

Для вияснення можливості використання залежності люмінесценції від інтенсивності освітлення, а також кривих індукції флуоресценції, у визначенні стану фотосинтетичного апарату одиничної клітини водорості Chlorella vulgaris були виконані виміри флуоресценції при збуджені світлом, що значно відрізняється за інтенсивністю.

Проведені експерименти показали можливість надійної реєстрації кривих індукцій флуоресценції від одиничних клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris Chlorella vulgaris, в широкому діапазоні інтенсивностей світла. Індукційні криві повністю відновлюються після 7 хвилин темневої адаптації. На Фіг.2 подані характерні криві індукції флуоресценції, отримані на одиночних клітинах.

При цьому, в діапазоні від 2,0 до 50Вт/м2 форма індукційних кривих різних клітин в значному ступені варіювала. Можна припустити, що ця різниця зумовлена особливостями клітин в популяції. Очевидно, поглиблений аналіз індукційних кривих флуоресценції дозволяє отримати інформацію про ефективність первинних процесів фотосинтезу в одиночній клітині. Однак, необхідність проведення темрявної адаптації (не менше 7 хвилин) приводить до того, що час одного виміру перевищує 10 хвилин. Ця обставина ускладнює швидкий набір статистично достовірних результатів.

Таким чином, оцінка ефективності функціонування фотосинтетичного апарату клітини за індукцією флуоресценції не відповідає поставленим вимогам. Крім того, такий аналіз ускладнений великою варіабельністю індукційних кривих від клітини до клітини та труднощами вибору критерію форми.

Слід відмітити, що в умовах збудження флюоресценції малими (2,0Вт/м ) та великими (>50Вт/м2) інтенсивностями світла, всі клітини, що досліджувалися, давали східну індукційну відповідь. Аналіз кривих індукції флуоресценції при малому (2,0Вт/м2) та великому (50Вт/м2) світлі, що збуджує, вказує на можливість іншого підходу до оцінки ефективності первинних стадій фотосинтезу одиночної клітини водорості. При низьких інтенсивностях світла, що збуджує, (2,0Вт/м2 ) перемінна фаза в індукції флуоресценції практично відсутня. Очевидно, це відбувається в зв'язку з тим, що таке мале завантаження електротранспортного ланцюгу залишає практично всі реакційні центри відкритими (умови мінімального тушіння флуоресценції хлорофілу за рахунок електронного транспорту), а іонні потоки, що зв'язані з електронним транспортом, недостатні для виміру трансмембранних потенціалів, що впливають на квантовий вихід флуоресценції [16, 20].

Інтенсивності збуджуючого світла, які насичують фотосинтез, (50Вт/м2) приводять до стану, коли максимальний рівень флюоресценції на індукційній кривій відповідає створенню умов практично повної відсутності тушіння за рахунок електронного транспорту (закриті реакційні центри), а градієнти потенціалів на мембрані ще не сформувались та змін в системі міграції енергії між фото системами ще не відбулося. Подальше зниження інтенсивності флуоресценції на індукційній кривій, очевидно, зумовлене адаптаційними змінами фотосинтетичного апарату рослинної клітини до високої інтенсивності збуджуючого світла.

З розгляду кривих індукції флуоресценції при малій та великій інтенсивності збуджуючого світлі випливає, що їхнє співставлення може дати інформацію про стан електротранспортного ланцюгу фотосинтезу, який визначає ефективність первинних процесів утилізації світла клітиною. Для вибору необхідних умов виміру була досліджена залежність відношення інтенсивності флуоресценції до інтенсивності світла, (при постійному поглинанні об'єктом світла - це відношення відповідає квантовому виходу флуоресценції) від інтенсивності збуджуючого світла, Виміри інтенсивності люмінесценції проводили за її максимальним рівнем на кривій індукції.

На Фіг.3 подані світлові криві квантового виходу флуоресценції, які побудовані для нативних клітин та клітин, що оброблені діуроном. При високій інтенсивності світла, що збуджує, квантовий вихід флуоресценції фотосинтетичного апарату клітин із заблокованим діуроном електронним транспортом та нативних клітин порівнюються. Це вказує на те, що при дії світла високої інтенсивності досягається насичення швидкостей фотосинтетичних реакцій та практично повністю відновлюється первинний акцептор фотосистеми II. При низькій інтенсивності світла, квантовий вихід флуоресценції істотно нижче для нативних клітин, ніж для клітин, оброблених діуроном.

Велике відхилення від середніх значень квантового виходу флуоресценції в області середніх інтенсивностей світла, пов'язано, очевидно, з індивідуальними особливостями клітин, що проявляється у варіабельності форми кривих індукції флуоресценції. Відносно мале відхилення від середніх значень квантових виходів флуоресценції в областях відповідних інтенсивності світла, що дорівнює 0,7Вт/м2 та 140Вт/м2 дозволила викоритовувати їх для оцінки ефективності первинних стадій фотосинтезу. Оцінку ефективності первинних реакцій фотосинтезу на одиничній клітині водорості проводили за виміром інтенсивності флуоресценції в умовах відкриття та закриття реакційних центрів та співставленню відношення інтенсивностей флуоресценції та світла, що збуджує.

Таким чином, були обрані умови виміру ефективності первинних стадій фотосинтезу за співставленням квантових виходів флуоресценції при збуджені світлом інтенсивністю 0,7Вт/м2 та 140Вт/м2. Розрахунок цього параметру можна проводити за формулою:

(1)

де η - ефективність фотосинтезу (Відн. од.);

І1, І2 - інтенсивність флуоресценції (Ум. од.) при збуджені клітини при інтенсивностях світла Ф1=0,7Вт/м2, Ф2=140Вт/м2'

При η=0 фотосинтетичний транспорт електронів повністю блокований, а прямування η до одиниці вказує на високу ефективність первинних стадій фотосинтезу.

Таким чином, відносно прості виміри інтенсивності флуоросценції клітини мікроводорості при малій та великій інтенсивності світла за максимальним значенням інтенсивності флуоресценції дозволяють визначити функціональний стан хлорофілу фотосинтетичного апарату. Слід відмітити, що виміри, які проводили на малій інтенсивності світла не впливають на форму індукційної кривої, яку отримуємо слідом при великій інтенсивності світла.

Для перевірки спроможності запропонованої методики були проведені експерименти з співставленням середніх значень квантової ефективності фо-тосинтезу в групах по 30...50 клітин та значень цього ж параметру, що виміряний на суспензії (hсусп.) з використанням діурона [23].

Розрахунок hсусп. проводили за формулою:

(2)

де Іс/Іс+Д - відношення інтенсивностей флуоресценції сусупензії клітин в нативному стані та після додавання діурона.

Виміри були проведені на клітинах як в стандартних умовах культивування, так і при різних діях. Отримані дані показують наявність лінійної кореляції (з коефіцієнтом кореляції 0,86). Такий високий коефіцієнт кореляції вказує на те, що спосіб, який пропонується, для оцінки ефективності первинних стадій фотосинтезу для одиничних клітин Chlorella vulgaris є досить задовільним та може бути використаний для визначення стану популяції. У зв'язку з високим відтворенням методу (час вимірів на одній клітині - менше 2 хвилин) при досить великих виборках він може давати статистично достовірні результати.

Перевагою мікрофлуорисцентного методу є можливість одночасного виміру -вмісту хлорофілу в клітині. Це можливо у зв'язку з тим, що інтенсивність флуоресценції при закритих центрах (в даному випадку - максимальний рівень флуоресценції при високій інтенсивності світла) пропорційна вмісту хлорофілу а в II фотосистемі [19, 21]. Якщо припустити, що відношення компонентів пігментного апарату ФС-І та ФС-ІІ, а також хлорофілів а та в - залишається постійним, то інтенсивність флуорисценції повинна бути пропорційна вмісту хлорофілів в клітині [15]. Данні, отримані при вивчені відношення інтенсивності флуоресценції окремих клітин та їхнього об'єму (див. Фіг.4) вказує на наявність лінійної кореляції (з коефіцієнтом кореляції 0,83), де також показані пунктирними лініями інтервали розкиду экспе-риментальних даних. З Фіг.4 бачимо, що розкид ефективності первинних реакцій фотосинтезу істотно залежить від об'єму клітин, та на цей біологічний феномен ще треба відповісти в майбутньому, а поки ми можемо його інтерпретувати як наявність гетерогенності клітин в популяції.

Таким чином, в результаті проведеного досліду та з літературних джерел [3, 6, 9] нами був розроблений метод визначення ефективності первинних стадій фотосинтезу та вмісту хлорофілу в одиночних клітинах водорості Chlorella vulgaris за виміром інтенсивності флуоресценції при збуджені її світлом різної інтенсивності.

Додаткове вимірювання інтенсивності світла, забезпечує підвищення точності оцінки функціональної структури популяції, за рахунок урахування помилок, пов'язаних із нестабільністю джерел світла. Крім того, знання величини інтенсивності світла, необхідне для обчислення величини ефективності первинних реакцій фотосинтезу (див. формулу 1), що характеризує енергозабезпеченість клітини. Цей показник є важливим параметром в оцінці функціональної структури популяції мікроводоростей Chlorella vulgaris, так як розвиток організму, швидкість його розмноження, стійкість до несприятливих дій у переважаючій більшості випадків прямо пов'язана з його енергозабезпеченістю. Порушення в системі енергозабезпечення завжди пагубні для організму та часто виявляються головною причиною зсувів екологічної рівноваги, що спостерігаються.

Вимірювання інтенсивності флуоресценції двічі в максимумі індукції при низькій та насичуючій інтенсивностях світлах забезпечує скорочення тривалості аналізу у порівнянні із відомими методами оцінки фотосинтетичної активності мікроводоростей за індукцією флуоресценції [5], або за діурон стимульованого збільшення стаціонарного рівня флуоресценції [7]. Це відбувається за рахунок ліквідації необхідності витрат часу на темневу адаптацію водоростей та на закінчення повного процесу індукційного переходу, а також за рахунок вилучення необхідної процедури промивки камери, що виникає у випадку використання діурона в аналізах. При умовах збудження флуоресценції малими (менше 2,0Вт/м2) та великими інтенсивностями світла, (більше 50,0Вт/м2) спостерігали індукції флуоресценції, які відновлюються, що важливо для підвищення точності оцінки.

Для визначення ефективності первинних процесів фотосинтезу за результатами виміру інтенсивності флуоресценції необхідно знати квантовий вихід флуоресценції у двох станах фотосинтетичного апарату: коли всі реакційні центри фотосистеми II повністю відчинені; та коли всі вони повністю зачинені. Нами встановлено, що квантові виходи флуоресценції в максимумах індукційних переходів при збуджені низькими або інтенсивностями світла, що насичують, відповідно дорівнюють квантовим виходам флуоресценції мікроводоростей Chlorella vulgaris, коли у них всі реакційні центри фотосистеми II повністю відчинені та зачинені (наприклад, при інгибіюванні електронного транспорту діуроном)/ Тому виміри максимумів індукції флуоресценції при двох світлових режимах є принципово необхідними для досягнення поставленої цілі та рішення технічної задачі згідно винаходу, що розглядується.

Встановлення границі інтенсивності світла в границях від 0,5 до 2,0Вт/м2, забезпечує підвищення точності виміру, так як при інтенсивностях світла вище 2,0Вт/м2 спостерігається невідповідність квантових виходів флуоресценції максимуму індукції, коли всі реакційні центри фотосистеми II повністю відчинені, що збільшує помилку виміру функціонального показника рослинної клітини (ефективність фотосинтезу). Використання світла з інтенсивністю менше 0,5Вт/м2 не доцільно, так як при цьому знижується інтенсивність флуоресценції, що випромінюється клітинами, та виникають труднощі її реєстрації, із підвищеними вимогами затемнення в лабораторії, що веде до незручності проведення дослідів, стомленості оператора.

Встановлення границі інтенсивності світла що насичує в границях від 50,0 до 100Вт/м , забезпечує підвищення точності виміру, так як при інтенсивностях світла нижче 50Вт/м2 спостерігається невідповідність квантових виходів флуоресценції максимуму індукції флуоресценції, коли всі реакційні центри фотосистеми II повністю зачинені. Використання світла з інтенсивністю вище 100Вт/м2 призводить до фотодеструкції фотосинтетичного апарату мікроводоростей, що призводить до додаткових помилок, які мають динамічний характер.

Обчислення величини ефективності первинних реакцій фотосинтезу, за формулою (1) забезпечує підвищення точності визначення ефективності первинних реакцій фотосинтезу, так як будь-яка зміна ефективності первинних процесів фотосинтезу призводить до зміни квантових виходів флуоресценції [6]. Крім того, обчислення ефективності фотосинтезу за формулою (1) дозволяє вилучити помилки, які пов'язані із варіабельністю вмісту хлорофілу а в клітині водорості, так як Ф1 та Ф2 пропорційні кількості хлорофілу а в клітині [15].

Використання в якості критерію функціональної активності первинних реакцій фотосинтезу в окремій клітині та спосіб його визначення, що пропонується, відповідає критерію винаходу "новизна". Відомі технічні рішення [9], в яких вимірюють флуоресценцію кожної клітини за допомогою цитофлуориметрів, проточних лазерних аналізаторів мікрочастин, діфрактометрах та т.п. Однак, ці технічні рішення не дозволяють визначити функціональну структуру популяції мікроводоростей за показником ефективності первинних процесів фотосинтезу. Це дозволяє зробити висновок про відповідність технічного рішення, що заявляється, критерію "істотні різниці", так як при цьому досягається та реалізується можливість визначення функціональної структури популяції мікроводоростей Chlorella vulgaris.

Розглянемо далі вищевказані ознаки у частині, що відрізняється, згідно формули винаходу.

Безперервне освітлення кювети з клітинами мікроводоростей Chlorella vulgaris світлом низької інтенсивності забезпечує скорочення тривалості проведення досліду, так як при цьому всі клітини в популяції знаходяться в однакових умовах, а це значить, що можна відразу робити виміри при послідовному скануванні кювети. Підсвітлення кювети полегшує процес пошуку та ідентифікації клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris, що також скорочує час проведення аналізу, при цьому у оператора знижується помилка неправильного виміру та забезпечується можливість вибору репрезентативної вибірки для набору потрібної кількості даних при статистичному аналізі.

Повторний вимір флуоресценції при інтенсивностях світла, що насичує, ведуть шляхом засвітлення камери на протязі 1...3сек. Це забезпечує підвищення точності аналізу та скорочення часу проведення досліду, так як за цей час всі реакційні центри фотосистеми II зачиняються та індукція флуоресценції досягає свого максимального значення. Засвітлення більше 3сек. не бажана, так як при цьому клітини в популяції, піддаються світловій дії з рівнем, що перевищує фізіологічні границі. Тривалість нижче 1сек. зумовлює підвищення динамічної помилки за рахунок неповного закриття реакційних центрів фотосистеми II.

Встановлення інтервалу між двома засвітленнями в границях від 5 до 60сек., забезпечує підвищення точності визначення та скорочення проведення аналізу, так як за цей час відбувається повне повертання клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris до стану адаптації до низького світла. При часі менше 5сек. в клітинах можуть накопичуватись зміни, які пов'язані з дією спалахів світла, що насичує, що тягне за собою підвищення помилки оцінки функціонального стану клітини. Часи більше 60сек. не доцільний, так як при цьому істотно збільшується тривалість проведення всього аналізу, а це в свою чергу підвищує помилку виміру, яка пов'язана з обмеженістю вимірювальної камери, ефектами пристінних явищ, газообміну, втраті вологи та т. п.

Таким чином, всі вищенаведені ознаки забезпечують досягнення поставленої цілі, задовольняють вимогам "істотні різниці". Не дотримання хоча б одного з пунктів частини формули винаходу, що заявляється, не дозволяє досягти точності аналізу, що вимагається та рішення поставленої технічної задачі.

На Фіг.1 подана структурна схема пристрою для визначення функціональної структури популяції мікроводоростей Chlorella vulgaris;

на Фіг.2 подані характерні криві індукції люмінесценції одиночних клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris при різних інтенсивностях світла, що збуджує;

на Фіг.3 - світлова залежність квантового виходу люмінесценції мікроводоростей Chlorella vulgaris, оброблених діуроном та стаціонарного рівню інтактних клітин;

на Фіг.4 подана залежність інтенсивності флуоресценції хлорофіла в рослинній клітині мікроводорості при інтенсивності світла, що насичує та збуджує фотосинтез від об'єму клітин;

на Фіг.5 - розподілення клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris за показником ефективності фотосинтезу, час культивування, 0 годин;

на Фіг.6 - розподілення клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris за показником ефективності фотосинтезу, час культивування, 24 години;

на Фіг.7 - розподілення клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris за показником інтенсивності флуоресценції, час культивування, 0 годин;

на Фіг.8 -розподілення клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris за показником інтенсивності флуоресценції, час культивування, 24 години;

на Фіг.9 - розподілення клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris за показником інтенсивності флуоресценції при дії ртуті, 0,01мг/л, час інкубації, 1 година;

на Фіг.10 - розподілення клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris за показником інтенсивності флуоресценції при дії ртуті, 0,01мг/л, час інкубації, 24 години;

на Фіг.11 - розподілення клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris за показником інтенсивності флуоресценції при дії ртуті, 0,01мг/л, час інкубації, 48 годин;

на Фіг.12 - розподілення клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris за показником ефективності фотосинтезу при дії ртуті, 0,01мг/л, час інкубації, 1 година;

на Фіг.13 - розподілення клітин мікро-водоростей хлорела за показником ефективності фотосинтезу при дії ртуті, 0,01мг/л, час інкубації, 24 години;

на Фіг.14 - розподілення клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris за показником ефективності фотосинтезу при дії ртуті, 0,01мг/л, час інкубації, 48 годин;

на Фіг.15 - розподілення клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris за показником інтенсивності флуоресценції при дії діурона, 3-10-6, час інкубації, 1 година;

на Фіг.16 - розподілення клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris за показником інтенсивності флуоресценції при дії діурона, 3-10-6,час інкубації, 3 години;

на Фіг.17 - розподілення клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris за показником інтенсивності флуоресценції при дії діурона, 3-10-6, час інкубації, 24 години;

на Фіг.18 - розподілення клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris за показником ефективності фотосинтезу при дії діурона, 3-10-6, час інкубації, 1 година;

на Фіг.19 - розподілення клітин мікро-водоростей хлорела за показником ефективності фотосинтезу при дії діурона, 3-10-6. Час інкубації, 3 години;

на Фіг.20 - розподілення клітин мікроводоростей хлорела за показником ефективності фотосинтезу при дії діурона, 3-10-6. Час інкубації, 24 години;

на Фіг.21 - розподілення клітин мікроводоростей хлорела за показником інтенсивності флюоресценції при азотному голодуванні. Час культивування, 6 годин;

на Фіг.22 - розподілення клітин мікроводоростей за показником інтенсивності флуоресценції при азотному голодуванні. Час культивування, 48 годин;

на Фіг.23 - розподілення клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris за показником інтенсивності флуоресценції при азотному голодуванні. Час культивування, 72 години;

на Фіг.24 - розподілення клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris за показником ефективності фотосинтезу при азотному голодуванні. Час культивування, 6 годин;

на Фіг.25 - розподілення клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris за показником ефективності фотосинтезу при азотному голодуванні. Час культивування, 48 годин;

на Фіг.26 - розподілення клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris за показником ефективності фотосинтезу при азотному голодуванні. Час культивування, 72 години;

на Фіг.27- розподілення клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris за показника інтенсивності флуоресценції після введення азоту. Час культивування, 6 годин;

на Фіг.28 - розподілення клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris за показником інтенсивності флуоресценції після введення азоту. Час культивування, 24 години;

на Фіг.29 - розподілення клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris за показником ефективності фотосинтезу після введення азоту. Час культивування, 6 годин;

на Фіг.30 - розподілення клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris за показником ефективності фотосинтезу після введення азоту. Час культивування, 24 години;

на Фіг.31 подано алгоритм реалізації способу визначення функціональної структури популяції мікроводоростей.

Спосіб визначення функціональної структури популяції мікроводоростей Chlorella vulgaris можна реалізувати за допомогою вимірювального комплексу на базі флуоресцентного мікроскопа з деякою його модифікацією, структурна схема якого подана на Фіг.1, де вказані:

1. Джерело світла, що збуджує флуоресценції.

2. Блок живлення для джерела світла.

3. Блок формування освітлення біологічного об'єкта.

4. Колектор.

5. Кювета для поглинання інфрачервоного випромінювання.

6. Діафрагми.

7. Світлофільтри для виділення необхідної ділянки спектра збудження.

8. Керування світлофільтрами збудження.

9. Лінзи.

10. Запираючі світлофільтри (нейтральні).

11. Блок керування інтенсивністю збуджуючого світла.

12. Поворотне дзеркало.

13. Проба біологічного об'єкта.

14. Предметне скло для формування "повільної краплини".

15. Покрівне скло для припинення випаровування проби.

16. Предметний столик.

17. Блок керування положенням предметного столика в 2-х координатах.

18. Тубус мікроскопа.

19. Механізм керування положення тубуса (вертикальна).

20. Зрачок об'єктива.

21. Об'єктив.

22. Лінзи для фокусування на ФЕП відображених дзеркалом промінів.

23. Світлофільтри для виділення ділянки спектра флуоресценції від біологічного об'єкта.

24. Блок керування світлофільтрами флуоресценції (їх положення та зміна).

25. Відображуюче напівпрозоре дзеркало-дільник променя світла.

26. Окуляр.

27. Фокусуюча лінза.

28. Діафрагма.

29. Око оператора.

30. Мікроотвір для регулювання величини світлового потоку флуоресценції.

31. Блок керування мікроотвором, в якому відсутній датчик контролю інтенсивності світлового потоку, що подається на предметний столик.

32. Шторка.

33. Блок керування положенням шторки.

34. Фотоелектронний помножувач (ФЕП).

35. Блок живлення ФЕП.

36. Попередній підсилювач електричного сигналу від ФЕП.

37. Блок обробки інформації.

38. Блок виводу інформації та реєстрації.

Розглянемо декілька прикладів, що демонструють можливості способу, який пропонується.

Приклад 1

Аналіз розподілення клітин мікроводоростей Chlorella vulgaris при різних умовах культивування (явище старіння культури).

В якості об'єкта досліду були використані клітини культури зеленої водорості Chlorella vulgaris, термофільний штам. Аналогічно бактеріологічно чисту культуру водорості зберігали на косяках 2%-ого агаризованого середовища Тамія (рН6,0...6,8) та зрощували в колбах в люміностаті на повітрі при 37°С та освітлені 8Вт/м2. Через тиждень культуту клітин після розведення середовищем Тамія поміщали до культиватора, який барботується повітрям. Для забезпечення відтворення результатів досліду проводили через 24 години після введення до культиватора клітин в кінцевій кількості біля 106кл/мл. На початок вимірів кількість клітин складала 6×106кл/мл. Для створення умов азотного голодування клітин у експоненціальній фазі зростання культури проводили осідання центрифугуванням на протязі 15 хвилин при 3000g, після чого відмивали 2 рази середовищем, яке не містило азоту, після чого отриману суспензію поміщали до культиватора (люміностат) на таке ж середовище.

Мікрофлуориметричні виміри проводили на флуоресцентному мікроскопі, Люмам Ρ-3, обладнаним флуоресцентною фотометричною насадкою ФМЕЛ-1А. Система реєстрації ефективності об'єкту забезпечувала часове розв'язання біля 0,5сек. Збудження флуоресценції клітин в препараті проводили галогеновою лампою накалювання КГМ 9-70. Необхідний для збудження спектральний інтервал спектру за допомогою скляного світлофільтру СЗС-22. Послаблення інтенсивності світла, проводили нейтральними світлофільтрами. Максимальне значення інтенсивності світла, складало біля 240Вт/м2. В якості початкового фільтра використовували скляний світлофільтр КС-16. Діаметр фотометричної ділянки (в площині препарату при використанні об'єктиву 40х) складав біля 12мкм, що дозволяло реєструвати сигнал від однієї клітини водорості. Лінійні розміри клітин визначали за допомогою окуляр-мікрометру. Розрахунок об'єму клітин проводили, припускаючи їх форму сферичною. Для забезпечення нерухомості об'єкту використовували спеціальну скляну камеру глибиною біля 5мкм. Встановлення однакового світлового потоку проводили за допомогою фотодіода ФД-2, який знаходився в площині об'єктиву, що дозволило стандартизувати умови збудження у всіх серіях вимірів.

Результати дослідів оброблювали статистично [11, 12,13, 18].

Виміри ефективності первинних процесів фотосинтезу та вмісту хлорофілу в одиночних клітинах хлорели показали, що клітини мають істотну різницю за обома параметрами. Діапазон, в якому можуть знаходитись живі клітини водоростей за ефективністю фотосинтезу лежить від 0,83 до 0,14, а відновний вміст хлорофілу від 18 до 150. Величина η, що дорівнює 0,83, близька до теоретично максимальної ефективності функціонування фотосинтетичного апарату.

Вміст хлорофілу в клітинах хлорели, поділення якої відбувається звичайно на 4¸8 повинно відрізнятись приблизно в 10 разів. Таким чином, результати наших вимірів відповідають загальним уявленням про гетерогенність клітин різновікової популяції даного виду водоростей.

Методика оцінки ефективності первинних стадій фотосинтезу та вмісту хлорофілу, одиночної клітини, дозволила провести аналіз структури популяції за цими параметрами. Розподілення клітин водоростей, зрощених в різних умовах, істотно відрізняються від Гаусового розподілення. Про це говорять значення критерію c2, який служить показником відповідності даного розподілення гаусонському [13].

Профіль розподілення клітин істотно змінюється у випадку варіювання умов зрощування культури. Культивування на протязі 24 годин на середовище, що не викликає дефіциту мінерального живлення, приводить до деякого збільшення середньоквадратичного відхилення (Фіг.5 та Фіг.6 - за показником ефективності фотосинтезу, та Фіг.7 й Фіг.8 - за показником інтенсивності флуоресценції) - за вмістом хлорофілу від 17 на початку до 19 через добу. Середній вміст хлорофілу в клітині збільшується з 62 до 72. Середньоквадратичне відхилення розподілення за ефективністю фотосинтезу з величини σ=0,047 зростає до σ=0,116 через 24 години. За цей час вміст хлорофілу в культурі збільшується в 5...6 разів.

Приклад 2

Дослід змін у функціональній структурі популяції мікроводоростей при дії несприятливих факторів (тяжких металів, HgCl2).

Використання суліми в якості несприятливого фактору, що діє, брали виходячи з того, що дія ртуті добре вивчена з відомим механізмом дії на біологічний об'єкт. Крім того, вибір діючої речовини ґрунтувався на його можливій участі у забруднені зовнішнього середовища. Відомо, що суліма є токсичною речовиною широкого спектру дії та одним з найбільш шкідливих забруднюючих середовище агентів. У фотосинтетичному апараті водоростей суліма насамперед інгібує електронний транспорт на рівні пластоціаінину [17]. Додавання до суспензії клітин мікроводорості хлорела (HgCl2) в кінцевій концентрації 3-10-2мг/мл швидко приводить до гибелі всієї культури водоростей. При цьому вже через 1 годину ефективність фотосинтезу значно знижується, а вміст хлорофілу в них падає. Через 3 години в пробі популяції водоростей практично не можна знайти клітин, здатних до ефективного фотосинтезу. Подальше культивування на відмічених клітинах не приводить до відновлення фотосинтетичної можливості водоростей.

При дії 10-2мг/мл HgCl2 через 3 години зменшуються середні значення ефективності фотосинтезу та флуоресценція в максимумі індукції. При цьому подальше культивування до 48 годин приводить до поширення розподілення вказаних показників в 1,6 разів. На Фіг.9, 10 та 11 подані експериментальні дані виміру флуоресценції, а на Фіг.12, 13 та 14 - ефективності фотосинтезу, де графіки, які виділені пунктирною лінією відображають контрольні проби. Ефективність фотосинтезу при цьому декілька вища, ніж у контрольних клітин. Одночасний вимір приросту біомаси в суспензії показує швидке зниження чисельності клітин водоростей в культурі. Приріст біомаси через 24 години в контролі майже в 10 разів перевищує приріст біомаси в досліді. Це можна інтерпретувати як гибель популяції. Однак, наявність в суспензії ефективних клітин, що фотосинтезують (навіть дуже незначна кількість) дозволяє прогнозувати слідком за фазою пригнічення росту значне збільшення кількості клітин після зняття навантаження за рахунок швидкого розмноження стійких до дії даного токсиканта осіб. Дійсно, деяке пригнічення росту популяції змінюється через 6 годин збільшенням вмісту хлорофілу в суспензії.

Приклад 3

Дослід змін у в функціональній структурі популяції мікроводоростей при дії несприятливих факторів (органічної природи, гербіцидів - діурон та дікват).

Отримання початкової культури мікроводоростей Chlorella vulgaris та метод аналізу ефективності первинних процесів фотосинтезу та вмісту хлорофілу проводили аналогічно яків прикладі 1 та 2. В даний час широко використовуються гербіциди, що пошкоджують рослини на рівні фотосинтетичного апарату.

Діурон та дікват є типичними представниками гербіцидів із добре відомими механізмами дії. Ці речовини були нами обрані для вияснення можливості використання методики контролю функціональної структури популяції мікроводоростей.

У випадку дії на клітини високопотенціального акцептора, діквата, який перехвачує електрони на акцепторній ділянці ФС І та передає їх до кисню з утворенням супероксидного аніон-радікалу на початкових етапах виявляється наступний ефект. Дікват прискорює електронний транспорт та спрямовує його на деструкцію фотосинтетичного апарату. У зв'язку з цим ефективність первинних утилізацій енергії світла, що вимірюється методом, який пропонується, зростає відразу після додавання діквату. Однак, в цьому випадку вміст хлорофілу в клітинах значно знижується.

При дії концентрації діквату 10-6М, через 3 години у клітин середньоквадратичне відхилення розподілення за вмістом хлорофілу зменшується на 64% від контролю. Погіршується ефективність фотосинтезу (η=0,35). В суспензії можна знайти клітини із значенням η=0,18 та η=0,56. Середньоквадратичне відхилення розподілення за ефективністю фотосинтезу збільшується в 1,7 разів. Через 24 години середнє значення η=0,29, хоча клітини за вмістом хлорофілу як і на початку, поступаються контрольним.

Аналіз розподілення клітин зрощених в середовищі з діуроном в різних концентраціях показав, що концентрація 3-10-6Μ приводить до повільних змін параметрів розподілення та подальше культивування не приводить до відновлення популяції. Декілька по-іншому ведуть себе клітини після додавання діурону в концентрації 10-5М, при цьому різко змінюються параметри розподілення за вмістом хлорофілу та ефективності фотосинтезу (див. Фіг.15, 16 та 17 - за інтенсивністю люмінесценції і Фіг.18, 19 та 20 - за ефективністю фотосинтезу, де графіки, які виділені пунктирною лінією відображають контрольні проби). Середнє значення хлорофілу зменшується на 58%, клітини за розмірами, в основному, дуже мілкі, багато з клітин не світяться. Середньоквадратичне відхилення розподілення дорівнює 15. Ефективність фотосинтезу падає на початку більш різко, ніж через 24 години (0,3 - відразу після додавання та 0,45 через 24 години). Накопичення біомаси в досліді через 24 години майже в 15 разів поступається контрольній. Однак, навіть при дії таких високих концентрацій гербіциду знаходяться клітини, які спроможні до ефективного фотосинтезу. І хоча загальна продуктивність та середнє значення відразу після введення гербіциду різко понижує, можна очікувати, що популяція виявиться стійкою до такої дії токсиканта.

Дійсно, після культивування на протязі двох місяців на середовищі, яке містить діурон в концентрації 10-5М, культура зберігалася та структура нової популяції адаптованої до гербіциду мало відрізняється від контрольної. Єдиною достовірною відміною є зменшення вмісту хлорофілу в клітинах.

Отримані дані демонструють той факт, що груповий відбір, який направлений на підвищення стійкості до діурона із паралельним зберіганням високої ефективності фотосинтетичної активності водоростей може привести до отримання форм осіб та властивостей популяції в цілому, які містять в собі такі властивості, як висока ефективність фотосинтезу та стійкість у відношенні інгібітору.

Таким чином, спосіб що розглядується має велику діагностичну та прогностичну цінність, що дозволяє використовувати його не тільки в задачах екологічного моніторингу, але й при скринінгу біологічної активності хімічних речовин та препаратів.

Приклад 4

Дослід змін у в функціональній структурі популяції мікроводоростей при культивуванні в умовах азотного голодування.

Для накопичення біомаси мікроводоростей Chlorella vulgaris тa ефективної утилізації світлової енергії в середовищі культивування необхідна присутність сполук азоту. В даний час проведені широкі дослідження стану фотосинтетичного апарату хлорели при азотному голодуванні. Експерименти за впливом азотного голодування на стан популяції показали, що виключення азоту із живильного середовища вже через 6 годин супроводжується зниженням вмісту хлорофілу в клітині на 26% у порівнянні із контролем (див. Фіг.21) при цьому також за показником ефективність фотосинтезу збільшується дисперсність розподілення (див. Фіг.24). Зменшується середньоквадратичне відхилення та середнє значення ефективності фотосинтезу. У голодуючих клітин на другу добу (див. Фіг.22) середнє значення вмісту хлорофілу зменшується на 54%, погіршуються показники ефективності фотосинтезу (див. Фіг.25). Голодуючі на третю добу (див. Фіг.23 та 26) клітини (Імах продовжує зменшуватись до 48% початкового рівню, η дорівнює при цьому 0,37).

Однак, відразу після додавання азоту до живильного середовища уже через 6 годин (див. Фіг.29 та 27) починається відновлення фотосинтетичних функцій. За ефективністю фотосинтезу клітини майже досягають контрольного значення (η=0,69). Небагато відстають значення величин за вмістом хлорофілу (61,5% від контролю).

На другу добу після відновлення умов мінерального живлення середнє значення за ефективністю досягає контрольного значення (див. Фіг.30). Середньоквадратичне відхилення цього розподілення значно нижче, ніж в контролі. За вмістом хлорофілу розподілення клітин на другу добу за відношенням до контролю відновлюється не в повній мірі (див. Фіг.29), що вказує на критичність характеристик живильного середовища, тому цей факт необхідно враховувати в біотехнологіях промислового культивування масових культур мікроводоростей. Слід відмітити, що через 6 годин голодування в розподіленнях з'явилася група клітин із дуже низькою ефективністю фотосинтезу. Такі клітини виявлені також через 6 годин після додавання до середовища нітрату. А через дві доби культивування після відновлення умов мінерального живлення таких аномальних клітин немає. Це говорить про те, що не всі клітини спроможні відновити свою фотосинтетичну активність.

Через дві доби Імах=56. Ці результати дають можливість припустити, що популяція складається із декількох субпопуляцій із різною стійкістю та функціональною надійністю показника життєдіяльності. Дуже вірогідно, що їм властива рівна чутливість до того чи іншого фактору середовища.

Таким чином, в результаті проведених експериментів показано, що структура популяції за ефективністю та за вмістом хлорофілу при різних діях зовнішніх факторів істотно змінюється в результаті реакцій популяції в короткострокових дослідах випробувань та може явитись показником стану популяції в реальному масштабі часу.

Висновки (за результатам прикладів 1, 2, 3 та 4).

1. Співвідношення інтенсивностей флуоресценції хлорофілу одиночної клітини при певних значеннях інтенсивностей збуджуючого світла може характеризувати ефективність первинних стадій фотосинтезу.

2. Існує лінійна кореляція між об'ємом рослинної клітини мікроводорості та інтенсивністю флуоресценції хлорофілу в ній при інтенсивності збуджуючого світла, яке насичує фотосинтез, (коефіцієнт кореляції 0,83 при рівні значимості більше 0,99, див. Фіг.4).

3. Розподілення клітин в популяції мікроводоростей Chlorella vulgaris в процесі старіння зсувається в бік зниження ефективності первинних стадій фотосинтезу.

4. Аналіз розподілення функціональної структури мікроводоростей Chlorella vulgaris в популяції дозволяє оцінити можливості адаптації та відновлення популяції в умовах дії несприятливих факторів зовнішнього середовища. При цьому розподілення істотно змінюються за своїм характером, що дозволяє використовувати цей біологічний феномен для отримання математичних моделей, що описують як стан популяції, так і їхній розвиток.

5. Дефіцит азоту в живильному середовищі інкубації приводить до зниження ефективності фотосинтезу та вмісту хлорофілу в клітині, а при тривалому дефіциті та гибелі частини клітин в популяції. Введення азоту до середовища інкубації у більшості клітин викликає швидке відновлення ефективності фотосинтезу та повільне збільшення вмісту хлорофілу. Гетерогенність клітин популяції, що пройшли етап азотного голоду, але відновилися після вводу до живильного середовища необхідних азотних сполук, незначно менше, ніж в контрольній пробі.

6. Аналіз функціональної структури популяції мікроводоростей, в основу якого покладено визначення розподілення клітин водоростей за ефективністю первинних стадій фотосинтезу та вмісту хлорофілу, дозволяє прогнозувати розвиток популяцій з виявленням біфуркаційних переходів з одного стану до іншого.

7. Використання способу визначення функціональної структури популяції мікроводоростей, що розглядується, дозволяє проводити оперативний контроль стану в екологічному моніторингу або при біотестуванні контролю токсичності водяного середовища, а також при організації технологічного контролю біотехнології зрощування мікроводоростей. При цьому існує можливість організації автоматизованого методу дослідів.

8. Необхідно спеціально розглянути можливості статистичних методів математичного моделювання позначених процесів, в тому числі з області теорії біфуркацій дисипативних структур. Разом з тим, корисними можуть виявитись й більш ординарні засоби обробки обчислювальної інформації, включаючи апроксимацію тригонометричними рядами функцій розподілення із наступним виявленням часової організації популяції мікроводоростей, а також дослідження залежностей відповідних градієнтів від параметрів отриманих розподілень в конкретних задачах.

Спосіб визначення функціональної структури популяції мікроводоростей Chlorella vulgaris здійснюється за алгоритмом, який поданий на Фіг.31, де:

39. Відбір проби з природної або лабораторно культивованої популяції мікроводоростей.

40. Ввід проби до вимірювальної камери для мікроскопіювання та виміру флуоресценції.

411, 412. Наведення оптичної системи ФЕМ на окрему клітину водоростей в умовах її опромінювання низькою інтенсивністю світла.

42. Опромінювання клітини водоростей низькою інтенсивністю світла Ф1, що збуджує, в границях від 0,5 до 2,0Вт/м2 на протязі всього часу виміру.

43. Вимір інтенсивності флуоресценції її при інтенсивності світла ,від 0,5 до 2,0Вт/м2 на протязі 1...3сек.

44. Запам'ятовування значень величин інтенсивності флуоресценції та інтенсивності світла І1 та Ф1.

45. Зміна інтенсивності світла Ф2, до величин в границях від 50 до 100Вт/м2, при цьому світло перекрито і не опромінює клітину, що досліджується.

46. Вимір інтенсивності флуоресценції І2 при інтенсивності світла в границях від 50 до 100Вт/м2 через інтервал часу 1...3сек. після опромінювання клітини водоростей на протязі 1...2сек.

47. Запам'ятовування значень величин інтенсивності флуоресценції та інтенсивності світла І2 та Ф2.

48. Розрахунок показника вмісту хлорофілу та ефективності фотосинтезу за формулою:

де І1та І2 - інтенсивність слабкого світла та світла, що насичує, відповідно, Вт/м2; Ф1 та Ф2 - інтенсивність максимумів індукції флуоресценції при слабкому світлі та світлі, що насичує, відповідно, Ум. од.

49. Сканування мікрофлуориметром зразка проби мікроводоростей Chlorella vulgaris за певною програмою з ціллю отримання репрезентативної вибірки.

50. Встановлення циклів повторювання вимірів на іншій клітині водоростей з отриманням статистики 30... 100од. контролю.

51. Графічна побудова розподілення частоти виявлення клітин водоростей в залежності від встановленої величини ефективності фотосинтезу та вмісту хлорофілу.

52. Статистичний аналіз імперичного розподілення функціональної структури популяції мікроводоростей Chlorella vulgaris із встановленням достовірного інтервалу за одним з прийнятих критеріїв.

53. Оцінка функціональної структури популяції мікро водоростей.

54. Завершення програми.

Загальні висновки.

1. Функціональна структура популяції мікроводоростей Chlorella vulgaris являє собою гетерогенну систему за токсикорезистентністю до дії хімічних факторів.

2. Гетерогенність токсикорезистентності належить до фізіологічного поліморфізму популяцій мікроводоростей.

3. Внутрішньовидовий поліморфізм є механізмом пристосування популяції одноклітинних до токсичного фактору.

4. В умовах тривалої дії токсикантів в екстремальних умовах виявлені адаптивні реакції, які проявляються у підвищені стійкості популяції до дії металів та ін. токсикантів.

5. Адаптивні реакції необхідно враховувати при розробці регламентів зливу стічних вод до водойми.

Таким чином, запропонований спосіб дозволяє:

1. Здійснювати оперативний контроль.

2. Оцінювати поріг токсичної дії.

3. Надати оцінку резервних можливостей біосистеми на популяційному рівні організації по забезпеченню цільової функції в умовах короткострокової дії пошкоджуючих факторів.

4. Здійснювати оцінку ефективності дії хімічних регуляторів, забезпечуваних токсикорезистентність та стимуляції фотосинтетичної активності мікроводоростей.

Запропонований спосіб контролю може бути реалізований у лабораторії фахівцем-мікробіологом або альгологом (лаборантом). Тривалість аналізу однієї проби становить (з урахуванням тривалості виміру показника для однієї клітини водоростей, що дорівнює 1,5...2,0 хвилини та кількість клітин, що аналізуються, для статистичної обробки, що дорівнює 30...100од.) від 45 до 200 хвилин - не автоматизований режим контролю (кількісний облік, розрахунок і аналіз результатів), тобто його можна віднести до експрес-способів контролю.

Використання способу найбільш ефективно в токсикології та екологічному моніторингі, а також в біотехнології промислового культивування водоростей.

Джерела інформації

1. Сиренко Л.А., Марценюк И.И. О количественной регистрации интенсивности флуоресценции микроскопических препаратов. - В сб.: Методы изучения и практического использования почвенных водорослей. - К.: Наукова думка, 1972. -С.118-124.

2. А.с. №1505471, СССР, A01N7/00, БИ N33/89 от 07.09.89. Способ оценки уровня допустимых воздействий повреждающего фактора на фотосинтезирующие организмы // В.А.Веселовский, Т.В.Веселова, А.Б.Рубин, В.И.Мацкивский, Г.В.Хомяков, Д.С.Чернавский.

3. Погосян С.И., Лебедева Г.В., Резниченко Г.Ю. Связь функциональной структуры популяции одноклеточных водорослей с ее динамикой. - В кн.: Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем. - Л.: Гидрометеоиздат, 1991. -Т.13. -С.280-297.

4. Сверижев Ю.М. Нелинейные волны, диссипативные структуры и катастрофы в экологии. - М.: Наука, 1987. - 366с.

5. Тарусов Б.Н., Веселовский В.А. Сверхслабые свечения растений и их прикладное значение. - М.: МГУ, 1978. - 151с.

6. Веселовский В.А., Веселова Т.В. Люминесценция растений. - М.: Наука, 1990. - 200с.

7. Веселовский В.А. Структурно-функциональные изменения мембран растительной клетки при адаптации к повреждающим воздействиям.: Дисс. на соиск. уч. степени д. биол. наук. - М.: МГУ, 1990. -46с.

8. Мацкивский В.И. Перспективы использования флуоресцентных методов анализа состояния фитопланктона для экологического мониторинга. - В сб.: Тез. докл. "V съезд Всесоюзного гидробиологического общества". - Тольятти, 1986. -С.198-199.

9. Мацкивский В.И. Экспериментально - методическое исследование действия загрязнителей на гидробионты для разработки контроля качества водной среды: Дисс. на соискание уч. степени канд. биол. наук. - М.: МГУ, 1985. -167с.

10. Браунли К.А. Статистическая теория и методология в науке и технике. -М.: Наука, 1977.-407с.

11. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов.- М.: Высш. шк., 1990. - 352с.

12. Глотов Н.В., Животовский Л.А., Хованов Н.В., Хромов-Борисов Н.Н. Биометрия: Учеб.пособие. - Л.: ЛГУ, 1982. - 264с.

13. Плохинский Н.А. Алгоритмы биометрии. - М.: МГУ, 1980.- 150с.

14. Голоскоков А.Е. Проверка статистических гипотез: Учеб. пособ. - X.: ХГПУ, 1998.- 184с.

15. Бобров Ю.А., Савинов В.М. Определение концентрации хлорофилла флуоресцентным методом. - В сб.: Планктон прибрежных вод Восточного Мурмана. - Мурманск: Апатиты, 1982. -С.33-40.

16. Гольд В.М., Гаевскмй Н.А., Григорьев Ю.С., Гехман А.В., Попельницкий В.А. Теоретические основы и методы изучения флуоресценции хлорофилла. -Красноярск, изд-ио КГУ, 1984. -82с.

17. Клейтон Р. Фотосинтез. Физические механизмы и химические модели. -М.:Мир, 1984.-350с.

18. Тейлор Дж. Введение в теорию ошибок. - М.:, Мир, 1985.

19. Bemecke С, Falke W., Schmidt С. Use of algae fluorescence for an automated biological monitoring system. - Bull. Environ. Contam. Toxicol., 1982. - Vol.28.-№4.-P.385-395.

20. Havaux M., Lannoye R. In vitro chlorophyll fluorescence and delayed light emisson as rapid screening techniques for stress tolerance in crop plants. - Z. Pflanzenzuchtg., 1985. - Bd.95. - S.1-13.

21. Lorenzen C.J. A method for continuous of in vivo chlorophyll concentration. - Deep-Sea., 1966. - Vol.13. - P.223-227.

22. Oguist G., Hagstrom Α., Alm P., Samuelsson G., Richardson K. Chlorophyll a fluorescence an alternative method for estimating of primary production. - Marine Biol., 1982. - Vol.68. - №1. - P.71-75.

23. Samuelsson G., Oguist G. A method for studing of photosynthetic capacities of unicellular algae based on in vivo chlorophyll fluorescence. - Physiol., 1977. - Vol.40. -P.315-319.