Спосіб оцінки порушень тромбоцитарного гемостазу у хворих з високим ризиком тромботичних ускладнень

Спосіб оцінки порушень тромбоцитарного гемостазу у хворих з високим ризиком тромботичних ускладнень, у якому досліджують збагачену тромбоцитами плазму крові хворих, індуковану агрегаційну активність тромбоцитів оцінюють за зміною оптичної щільності плазми, багатої тромбоцитами, до та після агрегації цих клітин (Е1 та Е2 відповідно) і порівнюють з різницею оптичної щільності багатої і бідної тромбоцитами плазми (Е1 та Ебідн відповідно), як оціночний критерій, що найбільш повно відображає функціональний стан тромбоцитів, розраховують величину сумарного індексу агрегації тромбоцитів (СІАТ) за відомою формулою: СІАТ = ((Е1-Е2)/(Е1-Ебідн.)) 100 %, який відрізня U 2 (19) 1 3 Відомий спосіб оцінки агрегаційної активності тромбоцитів шляхом проточної цитометрії [див. Gachet С, Aleil В. Testing antiplatelet Therapy - 2008. - V.10, Suppl. A. P. A28-A 34]. При цьому суспензію клітин пропускають через камеру, де при спалаху лазерного світла визначають розмір та якості тромбоцитів. Для дослідження можна використовувати цільну кров, багату тромбоцитами плазму або суспензію відмитих тромбоцитів. Клітини красять одним або декількома флюоресцентними фарбами, зміни цитометрії оцінюють під впливом відомих індукторів (АДФ, адреналін, колаген та ін.). Про агрегацій ний стан тромбоцитів та лейкоцитарнотромбоцитарні взаємодії судять за інтенсивністю спалаху лазерного світла. Перевагою цитометрії є: можливість швидко одержувати результати, використання цільної крові, широкий спектр використання у наукових дослідженнях. Недоліком метода є те, що незважаючи на високу наукову цінність, результати не мають практичного значення. Метод затратний, потребує наявності висококваліфікованого персоналу, що не дозволяє використовувати його у клінічній практиці. Відомий метод оцінки морфофункціонального стану тромбоцитів шляхом суправітального фарбування тромбоцитів акридіновим оранжевим с подальшою люмінесцентною мікроскопією в ультрафіолетових промінях [Ладный А. И., Кондаков И. К., Ермакович И. И. Экспресс-метод оценки морфофункционального состояния тромбоцитов.// Лаб. дело. - 1988. - № 2. - С. 27-29.]. Метод дозволяє виявляти стан секреторної активності альфа гранул тромбоцитів та виділяти на цій основі різні морфологічні типи клітин: дискоцити, сфероцити, мега-тромбоцити; дегранульовані та агреговані клітини. Недоліком методу є те, що відсутня можливість оцінювати потенціальну активність тромбоцитів у відповідь на додавання індуктора агрегації, що знижує ефективність оцінки агрегаційного стану тромбоцитів. „Золотим" стандартом оцінки індукованої агрегації тромбоцитів є відомий фотометричний метод агрегометрії (ФМА) [див. Gachet С, Aleil В. Testing antiplatelet Therapy - 2008. - V. 10, Suppl.A. P. A28A 34.], який є найближчим аналогом і обраний у якості прототипу. Суть прототипу. Для оцінки індукованої агрегації тромбоцитів досліджують збагачену тромбоцитами плазму крові хворих. При цьому, у клінічній практиці використовують цитратну кров [1,0мл 3,8 цитрат натрію на 9мл цільної крові). У якості індукторів використовують: ендогенні (АДФ, адреналін, колаген, тромбін, арахідонову кислоту), фактори активації тромбоцитів або лабораторні реагенти. Індуковану агрегаційну активність тромбоцитів оцінюють за зміною оптичної щільності плазми, багатої тромбоцитами, до та після агрегації цих клітин (Е1 та Е2 відповідно) і порівнюють з різницею оптичної щільності багатої і бідної тромбоцитами плазми (Е1 та Ебідн відповідно), у якості оціночного критерію, що найбільш повно відображає 50676 4 функціональний стан тромбоцитів, розраховують величину сумарного індексу агрегації тромбоцитів (СІАТ) за відомою формулою: СІАТ, =((Е1Е2)/(Е1-Ебідн.)) 100 . За підвищенням кількісного значення СІАТ при патологічних станах судять про порушення тромбоцитарного гемостазу у хворих, які характеризуються схильністю до тромбоутворення. Метод ФМА більш точний та розповсюджений, ніж інші фотометричні та деякі мікроскопічні методи, характеризує процес агрегації у цілому, тобто за кінцевим результатом; більш відтворюваний і надає найменший разброс нормальних показників. Але недоліком прототипу є те, що використання методу фотометричної оцінки індукованої агрегації тромбоцитів у хворих з високим ризиком тромботичних ускладнень, а саме: при гострому коронарному синдромі, тяжкому перебігу стенокардії, локалізації атеротромбозу у багатьох органах, обмежено з огляду на наявність високого рівня внутрішньо судинної активації тромбоцитарного ланцюга гемостазу, що унеможливлює об'єктивність оцінки порушень у цілому. Це обумовлено тим, що при такому роді захворюваннях може спостерігатися хибно низька АДФ- індукована агрегація тромбоцитів при послабленні процесу фізіологічної дезагрегації. При цьому, реакція звільнення факторів гемостазу та агрегація відбувається в організмі (у судинному руслі) і продовжується після взяття крові "in vitro", в результаті чого амплітуда, швидкість агрегації і, як наслідок, кількісне значення СІАТ виявляється зниженим і не відображає дійсний стан тромбоцитарного гемостазу. Тому відбуваються хибні результати оцінки. Задача корисної моделі - підвищити об'єктивність оцінки індукованої агрегації тромбоцитів у хворих з високим ризиком тромботичних ускладнень з можливістю кількісної оцінки рівня внутрішньо судинної активації тромбоцитарного ланцюга гемостазу. А це дозволить здійснювати поглиблений аналіз та одночасну оцінку як функціонального, так і морфологічного стану тромбоцитів у периферичній крові хворих з серцево-судинними захворюваннями та, за необхідністю, контролювати ефективність антитромботичної терапії. Задача вирішується шляхом удосконалення відомого способу оцінки порушень тромбоцитарного гемостазу для можливості його використання у хворих з високим ризиком тромботичних ускладнень, у якому досліджують збагачену тромбоцитами плазму крові хворих, індуковану агрегаційну активність тромбоцитів оцінюють за зміною оптичної щільності плазми, багатої тромбоцитами, до та після агрегації цих клітин (Е1 та Е2 відповідно) і порівнюють з різницею оптичної щільності багатої і бідної тромбоцитами плазми (Е1 та Ебідн. відповідно), у якості оціночного критерію, що найбільш повно відображає функціональний стан тромбоцитів, розраховують величину сумарного індексу агрегації тромбоцитів (СІАТ) за відомою формулою: СІАТ = ((Е1-Е2)/(Е1-Ебідн.)) 100 , Ознаки, що відрізняють корисну модель від прототипу, є такі: 5 - розраховану величину сумарного індексу агрегації тромбоцитів (СІАТ) вважають за вихідне його значення (СІАТВИХ); - додатково та одночасно проводять морфологічний аналіз тромбоцитарного ланцюга гемостазу, для цього у тому ж зразку збагаченої тромбоцитами плазми виявляють структурно-морфологічні зміни (типи) тромбоцитів та спочатку здійснюють кількісну оцінку здатних та не здатних до агрегації тромбоцитів з визначенням дійсної питомої кількості тромбоцитів (Тдійне), що прийняли участь у агрегації, як виражену у відсотках різницю між вихідною кількістю тромбоцитів, прийнятою за 100 , та питомою кількістю тромбоцитів, не здатних до агрегації (ТН/ЗД) після введення індуктора, а саме: Тдійне = (100 - ТН/ЗД) , далі, у якості оціночного критерію, що враховує рівень внутрішньо судинної активації тромбоцитів, розраховують дійсне значення величини сумарного індексу агрегації тромбоцитів (СІАТдійсне) за формулою: СІАТдійсне = (СІАТВИХ / Тдійне) 100 і, якщо СІАТдійсне перевищує 50 , судять про високий ризик тромботичних ускладнень у вище означеної категорії хворих, що може бути підставою для корекції призначеної антитромботичної терапії. Додаткове та одночасне проведення морфологічного аналізу з виявленням та кількісною оцінкою структурно-морфологічні змін тромбоцитів (за даними власних оригінальних досліджень) дозволить: - об’єктивізувати результати оцінки завдяки одночасного аналізу як функціонального, так і морфологічного стану тромбоцитів; - поширити область використання цієї методики з метою оцінки у клінічних умовах порушень тромбоцитарного гемостазу у хворих з різними серцево-судинними захворюваннями, особливо у хворих з високим ризиком тромботичних ускладнень та, за необхідністю, контролювати ефективність антитромботичної терапії. Необхідність додаткового проведення морфологічного аналізу з виявленням та кількісною оцінкою структурно-морфологічних змін тромбоцитів обумовлено наступним: на основі літературних даних та за даними власних оригінальних досліджень дійшли до висновку, що зменшення світло пропускання суспензії тромбоцитів, що індукується агрегантами, обумовлено структурноморфологічними змінами, у результаті яких тромбоцити приймають неправильну форму з псевдо подіями. Цілий ряд цих змін впливає на результати оцінки. При станах, що передують тромбозам, латентних тромбозах та розсіяному згортанні крові показники агрегації спочатку підвищуються, а потім знижуються за рахунок внутрішньо-судинної агрегації „ in vitro" та звільнення з кровоплину функціонально найбільш активних тромбоцитів. Тому для одержання більш інформативних та об’єтивних результатів оцінки актуальним є розробка нових методик з можливістю одночасної морфологічної та функціональної оцінки тромбоцитарного ланцюга гемостазу та врахування внутрішньо-судинної агрегації тромбоцитів. Ступінь відтворюваності корисної моделі - 9598 . 50676 6 Дослідження за запропонованою корисною моделлю були проведені у відділі атеросклерозу та ішемічної хвороби серця ДУ „Інститут терапії ім. Л. Т.Малої АМН України". Обстежено 25 практично здорових осіб та 58 хворих (38 чоловіків і 20 жінок у віці від 45 до 74 років (середній вік 58,3 1,8 років) з високим ризиком тромботичних ускладнень (хворі на ішемічну хворобу серця ІХС) зі стабільною стенокардією, що перенесли інфаркт міокарда (ІМ). Математичну обробку даних здійснено на персональному комп'ютері з використанням статичної програми „Statistica". Вірогідність різниць оцінювали за критерієм t-Ст’юдента. Взаємозв'язок між показниками встановлювали за коефіцієнтом кореляції Пірсона. Запропоновану корисну модель здійснюють таким чином: Для оцінки порушень тромбоцитарного гемостазу у хворих з високим ризиком тромботичних ускладнень (хворі на ішемічну хворобу серця з важким перебігом стабільної та прогресуючої стенокардії та хворих, що перенесли інфаркт міокарда) досліджують збагачену тромбоцитами плазму (ЗТП) крові . Для одержання плазми, багатої тромбоцитами, забір крові здійснюють у сіліконіровану центрифужну пробірку, у яку попередньо додають 3,8 розчин цитрату натрію (1мл на 9мл крові). Стабілізовану цитратну кров центрифугують при 1000-1500об/хв. протягом 7 хвилин (центрифуга ОПН-8), при цьому необхідно строго додержуватися прийнятого у даній лабораторії режиму центрифугування, що важливо для одержання порівняльних результатів дослідження. Бідну тромбоцитами плазму (БТП) одержують шляхом центрифугування крові при 3000об/хв. протягом 10 хвилин. При цьому підбираються такі умови при центрифугуванні, при яких забезпечується максимальне віддалення з плазми тромбоцитів без підвищення концентрації в плазмі пластинчатих факторів згортання. У якості індуктора використовують аденозіндифосфат (АДФ) у кінцевій концентрації 10-6моль. Індуковану агрегаційну активність тромбоцитів оцінюють за зміною оптичної щільності плазми, багатої тромбоцитами, до та після агрегації цих клітин (Е1 та Е2 відповідно) і порівнюють з різницею оптичної щільності багатої і бідної тромбоцитами плазми (Е1 та Ебідн відповідно). У якості оціночного критерію, що найбільш повно відображає функціональний стан тромбоцитів, розраховують величину сумарного індексу агрегації тромбоцитів (СІАТ) за відомою формулою: СІАТ = ((Е1-Е2)/(Е1-Ебідн.)) 100 Згідно корисної моделі розраховану величину сумарного індексу агрегації тромбоцитів (СІАТ) вважають за вихідне його значення (СІАТВИХ). Додатково та одночасно для виявлення структурно-морфологічних змін (типів) тромбоцитів проводять морфологічний аналіз тромбоцитарного ланцюга гемостазу відомими мікролюмінесцетним методом [Ладный А. И., Кондаков И. К, Ермакович И. И. Экспресс-метод оценки морфофункционального состояния тромбоцитов. // Лабораторное дело. - №2. - 1988. - С. 27-29]. Принцип методу полягає у вітальному фарбуванні, попередньої фіксації, 7 підготовці препарату та проведенні люмінесцентної мікроскопії фіксованих тромбоцитів. Для виявлення структурно-морфологічних змін (типів ) тромбоцитів досліджують той же зразок збагаченої тромбоцитами плазми та здійснюють кількісну оцінку здатних (дискоцити, сфероцити, мега- тромбоцити ) та не здатних (де гранульовані та агреганти) до агрегації тромбоцитів. Останні типи тромбоцитів спостерігаються саме у осіб з високою тромбогенною активністю. З огляду на це, згідно корисної моделі, спочатку визначають дійсну питому кількість тромбоцитів (Тдійне), що прийняли участь у агрегації, як виражену у відсотках різницю між вихідною кількістю тромбоцитів, прийнятою за 100 та питомою кількістю тромбоцитів, не здатних до агрегації (ТН/ЗД) після введення індуктора, а саме: Тдійне = (100 - ТН/ЗД) . Далі, у якості оціночного критерію, що відображає дійсний стан агрегації та враховує рівень внутрішньо судинної активації тромбоцитів, розраховують дійсне значення величини сумарного індексу агрегації тромбоцитів (СІATдійсне) за формулою: СІАТдійсне = (СІАТВИХ / Тдійне) 100 і, якщо СІАТдійсне перевищує 50 , судять про високий ризик тромботичних ускладнень у вище означеної категорії хворих, що є підставою для корекції призначеної антитромботичної терапії. У наведених клінічних прикладах підтверджується використання заявляемого способу для об'єктивної оцінки порушень тромбоцитарного гемостазу у хворих з високим ризиком тромботичних ускладнень з можливістю контролю ефективності призначеної антитромботичної терапії. Приклад 1. Пацієнт Г., 53 роки, знаходився на лікуванні у ДУ "Інститут терапії ім. Л. Т.Малої АМН України" з діагнозом: ІХС, стабільна стенокардія напруження та спокою, IV функціональний клас. Постінфарктний (2001) Q- позитивний задньодіафрагмальний і діфузний кардіосклероз. Гіпертонічна хвороба III ст., IІІ ступеня, додатковий ризик високий. Гіпертензивне серце, кардіомегалія. СН ІІ-Б ст., IІІ функціональний клас, зі зниженою систолічною функцією лівого шлуночка. Хворому індивідуально підібрана терапія: нітрати, сечогінні, інгібітори АПФ, статини. У якості антиагреганту призначений аспірин (аспекард) у дозі 100мг/добу. Для оцінки у хворого порушень тромбоцитарного гемостазу досліджують збагачену тромбоцитами плазму (ЗТП) крові. Індуковану агрегаційну активність тромбоцитів оцінюють за зміною оптичної щільності плазми, багатої тромбоцитами, до та після агрегації цих клітин (Е1 та Е2 відповідно) і порівнюють з різницею оптичної щільності багатої і бідної тромбоцитами плазми (Е1 та Ебідн відповідно). У якості оціночного критерію, що найбільш повно відображає функціональний стан тромбоцитів, розраховують сумарний індекс агрегації тромбоцитів (СІАТ) за відомою формулою: СІАТ = ((Е1Е2)/(Е1-Ебідн.)) 100 . Визначений СІАТ, згідно корисної моделі, приймають за вихідне його значення. СІАТ вих становить – 42 , що не перевищує встановлену лабораторну норму (до 50 ). Для більш об'єктивної оцінки процесу агрегації додат 50676 8 ково та одночасно проводять морфологічний аналіз тромбоцитарного ланцюга гемостазу хворого відомим мікро люмінесцентним методом та виявляють структурно-морфологічні зміни (типи) тромбоцитів За даними морфологічного аналізу : питома кількість не здатних до агрегації (де гранульовані та агрегати) тромбоцитів Т н/зд - становить 52 ; дійсна питома кількість тромбоцитів, що прийняли участь у агрегації (дискоцити, сфероцити, мега- тромбоцити), Тдійне = (100-52) =48 , що свідчить про високу ступінь внутрішньо судинної активації тромбоцитів (ех vivo) у хворого. Відповідно величина розрахованого за формулою СІАТдійсне = (СІАТВИХ / Тдійне) 100 становить 87,5 , що значно перевищує показники лабораторної норми (до 50 ). Тому антитромбоцитарна терапія з призначенням тільки аспекарда недостатня. З огляду на це хворому додатково призначають клопідогрель. Через 10 діб прийому „подвійної" терапії здійснюють контроль за ефективністю антитромбоцитарної терапії. Досягнутий максимальний очікуваний ефект клопідогрелю. Протягом цього періоду підібрана терапія іншими препаратами залишалась незмінною. Розраховане значення СІАТ вих становить 51 , що вище, ніж до призначення клопідогрелю (42 ). При цьому питома кількість не здатних до агрегації тромбоцитів (де гранульовані та агрегати) - Т н/зд суттєво зменшилась і складає 18 . Дійсна питома кількість тромбоцитів, що прийняли участь у агрегації (дискоцити, сфероцити, мега- тромбоцити) Тдійне =(10018) = 82 . Відповідно величина розрахованого СІАТдійсне становить (51:82 100) =62,2 , що нижче, ніж до додаткового призначення клопідогрелю (87,5 ) і свідчить про задовільну ефективність подвійної антитромбоцитарної терапії у хворого. Таким чином, визначення СІАТдійсне дозволяє одержати більш інформативні та об’єктивні результати оцінки порушень тромбоцитарного гемостазу у хворого, здійснити контроль ефективності призначеної антитромбоцитарної терапії та визначити доцільність її корекції. Приклад 2. Хворий В., 52-х років, був обстежений амбулаторно. Встановлено діагноз: ІХС, стабільна стенокардія напруження, II функціональний клас. Постінфарктний (2005) Qнегативний задній кардіосклероз. СН І ст, II функціональний клас, зі збереженою систолічною функцією лівого шлуночка. Діагноз встановлений на підставі: скарг( чуття дискомфорту за грудиною, що виникає при значному навантаженні (піднімання на 3-й поверх, прискорена ходьба 300 метрів), що проходить самостійно при зупиненні навантаження); даних анамнезу (3 роки тому переніс гострий інфаркт міокарду, даних велоергометри («позитивна» проба, II функціональний клас); даних біохімічного аналізу. Після інфаркту регулярно не спостерігався; антитромбоцитарну терапію не приймав. Результати оцінки функціональної активності тромбоцитів: За даними АДФ- індукованої агрегації тромбоцитів розраховують за відомою формулою значення СІАТВИХ, яке становить 58 . Згідно кори 9 50676 сної моделі додатково та одночасно проводять морфологічний аналіз, виявляють та оцінюють структурно-морфологічні зміни (типи) тромбоцитів. Результати морфологічного аналізу: Питома кількість тромбоцитів, не здатних до агрегації, Т н/зд, становить 16 %. Дійсна питома кількість тромбоцитів, що прийняли участь у агрегації, Тдійне =(100-16) =84 . Відповідно, до призначення аспекарду СІАТдійсне=(58:84 100) =69 , що перевищує визначену лабораторну норму (до 50 ), що свідчить про ризик тромбозів у хворого. Призначають аспекард у дозі 100мг/добу. Через 48 годин здійснюють контроль ефективності призначеної антитромбоцитарної терапії, для цього повторно досліджують тромбоцитарний гемостаз. За даними индукованої агрегації СІАТ вих становить 51 . Питома кількість тромбоцитів, не здатних до агрегації, Т н/зд, становить 8 . Відповідно дійсна питома кількість тромбоцитів, що прийняли участь у агрегації, Тдійне – 92 . За цими даними СІАТдійсне=(51:92 100) =55,4 , що наближається до лабораторної норми (до 50 ) Свідчать про ни Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 10 зький ризик тромботичних ускладнень, що є підставою для продовження антитромбоцитарної терапії тільки аспекардом у дозі 100мг/добу. При цьому динаміка значення СІАТдійсне була більш вираженою (від 69 до 55,4) , ніж динаміка СІАТ вих (від 58 до 51) . Таким чином, додаткове визначення СІАТдійсне відображає стан внутрішньосудинної активації та дозволяє підвищити чутливість реакції на антитромбоцитарну терапію у хворого зі стабільним перебігом ішемічної хвороби серця. Технічний результат. Використання корисної моделі у медичній практиці, у порівнянні з прототипом, дозволить: - об’єктивізувати оцінку порушень тромбоцитарного гемостазу завдяки можливості одночасного аналізу як функціонального, так і морфологічного стану тромбоцитів; - поширити область використання цієї методики у хворих з серцево-судинними захворюваннями, особливо у хворих з високим ризиком тромботичних ускладнень та, за необхідністю, контролювати ефективність призначеної антитромботичної терапії. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601