Спосіб одержання регулятора росту рослин

Спосіб одержання регулятора росту рослин, який включає культивування штаму Cylmdrocarpon magnusianum 1MB F-100004 на рідкому живильному середовищі при температурі 22 - 28 °С впродовж ЗО діб, який відрізняється тим, що після завершення циклу культивування біомасу грибів ВІДДІЛЯЮТЬ від культуральної рідини шляхом фільтрації або центрифугування, після чого до фільтрату або фугату додають етиловий спирт в об'ємному співвідношенні культуральна рідина етиловий спирт 3 (1 - 1,3) і отримують цільовий продукт Винахід відноситься до біотехнологм і сільськогосподарської мікробіологи, а саме, до способу одержання регулятора росту рослин для широкого кола сільськогосподарських культур Застосування регуляторів росту рослин надає можливість спрямовано регулювати найважливіші процеси в рослинному організмі з метою підвищення продуктивності культур, прискорення строків дозрівання і поліпшення якості продукції В останні роки найбільш перспективними вважаються препарати, які отримують шляхом культивування різних мікроорганізмів В процесі їх ЖИТТЄДІЯЛЬНОСТІ утворюються продукти метаболізму, серед яких є речовини, що мають високу фізіологічну активність Перевагою мікробіологічного способу є те, що він дозволяє в м'яких умовах отримувати сполуки, які складно або неможливо отримати ХІМІЧНИМ шляхом, і не потребує дорогих, часто важкодоступних і високотоксичних ХІМІЧНИХ реагентів і складного обладнання Відомо декілька російських регуляторів росту рослин на основі продуктів метаболізму мікроорганізмів Серед них - Агат-25, Симбюнт-1, Емістим, Фузикокцин, Бюенерпя [Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, Москва, 1999г, Пат РФ №2130261, №2100932] Усі вони характеризуються низькими нормами витрати, високою ефективністю, широким спектром фізіологічної дії Розвиток цього напряму стримується складністю виділення окремих біологічно активних сполук з культурального середовища, внаслідок чого ці препарати виробляються у невеликих обсягах, переважно в лабораторних умовах ВІДОМІ способи [Японія з №62-20163, з №179101, РСТ №87/06796, Краснопольський Л М , Горбатюк М С та ш "Бютехнолопя -1993 -Т 10С 18-21, Пат України №17482 А], які потребують для цього багатоступінчастої системи фракціонування, екстракції або сорбції та очищення окремих сполук з використанням різноманітних розчинників та сорбентів ВІДОМІ [АВТ СВ СРСР №№14223550, 1555320, 16982242, 1699990, 1712348, Пат США №4818530, №4718931] способи отримання регуляторів росту рослин шляхом культивування мікроміцетів грибів з подальшим суспендуванням їх біомаси у воді або фізіологічному розчині Недоліком цих способів є те, що в них використовується монокультура, і отриманий таким чином препарат регулює ріст і розвиток тільки одного виду рослин Найближчим аналогом (прототипом) до запропонованого винаходу є спосіб одержання регулятора росту рослин [пат України №17558 А] шляхом культивування штаму гриба Cylmdrocarpon Продукти метаболізму гриба адсорбуються з культурального середовища активованим вугіллям, а потім екстрагуються з нього 70% етиловим спиртом Недоліком цього способу є високі витрати і низький вихід цільового продукту Проведеними нами дослідженнями встановлено, що значна частина продуктів метаболізму не адсорбується активованим вугіллям, а залишається в культуральному розчині, який в подальшому не використовується В основу винаходу поставлене завдання ство (О о о со ю 53006 технологічного обладнання, зменшується навантаження на нього Важливою особливістю винаходу є те, що в готовому продукті об'ємну частку етилового спирту знижено з 70% до 25-30%, що не тільки економить спирт, але й зменшує пожежобезпечність процесу виробництва і самого продукту Усе наведене вище дозволяє вважати, що запропоноване технічне рішення відповідає критерію "винахідницький рівень" Сутність винаходу пояснюємо прикладами Приклад 1 Одержання регулятора росту рослин Культивують штам Cylmdrocarpon magnusianum 1MB F-100004, що має такі характеристики штам виділений з кореневої системи обліпихи, ідентифікований по Кириленко Т С Атлас родов почвенных грибов (Ascomycetes и Fungi imperfect), К, Наукова думка, 1977, с 127, Підпличко Н М , Грибная флора грубых кормов, К, изд-во АН УРСР 1953, с 485 Штам депонований в Інституті мікробіологи і вірусологи HAH України під №1МВ F 10004 Культивування проводять в конічних колбах Ерленмейера об'ємом 750см3 або плоскодоних скляних судинах об'ємом 1,5дм3 з вузьким горлом в рідкому поживному розчині, що має такий склад, г/л глюкоза - 10,0, L-аспарапн - 0,02, КН2РО4 - 0,9, К2НРО4 - 0,3, MgSO4 - 0,1, K2SO4 - 0,1, MnSO4 0,02, CuSO4 - 0,02, FeSO4 - 0,02, вода дистильована - 1,0дм3 Гриб-продуцент росте в стаціонарних умовах при температурі 22-28°С і щоденній аерації (стряхуванні) для запобігання утворення корки, що перешкоджає проникненню кисню В процесі росту гриб виділяє в культуральне середовище продукти метаболізму, які мають рістрегулюючі властивості по відношенню до широкого кола рослин По завершенні циклу вирощування (30-60 діб) міцелій гриба - слизувату медузоподібну масу - розбивають за допомогою механічної мешалки і відфільтровують від культуральної рідини або ВІДДІЛЯЮТЬ ШЛЯХОМ центрифугування Для більш повного виділення продуктів метаболізму біомасу суспендують в етиловому спирті, об'єм якого відноситься до об'єму культуральної рідини як 1-1,3 3 Біомасу відфільтровують, спиртовий фільтрат об'єднують з профільтрованим розчином культуральної рідини і отримують цільовий продукт -розчин продуктів Таким чином, запропонований винахід не тільметаболізму штаму Cylmdrocarpon mag-nusianum в ки поліпшує КІЛЬКІСНИЙ і якісний склад та збільшує 25-30% (об'єми) спиртовому розчині Препарат фізіологічну активність регулятора росту рослин, містить близько 75 компонентів, в тому числі фітоале й значно підвищує продуктивність технологічгормони (ауксини, пббереліни, ЦИТОКІНІНИ і абного процесу Так, з технологічного циклу виклюсцизову кислоту), насичені і ненасичені вищі карчаються дві трудомісткі стадії (адсорбція продуктів бонови кислоти від Си до С24, поліцукри, амінокиметаболізму з культурального середовища актислоти, аміноцукри, мікроелементи вованим вугіллям та їх подальша екстракція з ву рити спосіб одержання регулятора росту рослин шляхом культивування мікроскопічного гриба в оптимальних для нього умовах, що забезпечує отримання фізіологічне активного препарату широкого спектру дії, недорогого і зручного при використанні Поставлене завдання досягається тим, що в способі одержання регулятора росту рослин, який включає культивування штаму мікроскопічного гриба Cylmdrocarpon magnusianum 1MB F-100004 на поживному середовищі в умовах обмеженої аерації при температурі 22-28°С протягом ЗО діб з послідуючою адсорбцією продуктів метаболізму активованим вугіллям впродовж 6-8 годин і подальшим їх екстрагуванням з вугілля протягом 6-8 годин 70% етиловим спиртом виключаються останні дві стадії - адсорбції і екстракції Після культивування біомасу грибів відфільтровують або за допомогою центрифуги ВІДДІЛЯЮТЬ ВІД культуральної рідини, а до останньої додають етиловий спирт в якості антиоксиданта, консерванта і розчинника в об'ємному співвідношенні культуральна рідина етиловий спирт 3 1-1,3 і отримують цільовий продукт - розчин продуктів метаболізму грибів в 25-30% (об'єми ) спирті - регулятор росту рослин широкого спектру дм При цьому усі продукти метаболізму гриба-продуцента залишаються у цільовому продукті, в той час як у прототипі значна частина фізіологічно активних сполук лишається в культуральній рідині, яка не використовується Дослідження, проведені в Національному аналітичному центрі України з використанням найсучаснішого обладнання - високоефективної газорідинної хроматографії, хроматомасспектрометрм, Міжнародного банку даних хроматомасспектрів ХІМІЧНИХ сполук показали, що в прототипі в культуральній рідині після адсорбції продуктів метаболізму активованим вугіллям залишається від 40 до 90% мікроелементів, 18-20% - амінокислот, більша частина пбберелінів, які мають розгалужену просторову будову і не адсорбуються активованим вугіллям, 70-75% цукрів і т і , тобто значна КІЛЬКІСТЬ продуктів метаболізму вилучається з процесу За рахунок цього фізіологічна активність регулятора росту рослин, отриманого запропонованим способом, на 5-10 вища, ніж активність прототипа гілля спиртом) Кожна стадія має тривалість 7-8 годин Завдяки тому, що культуральний розчин використовується повністю, процес отримання регулятора росту рослин є безвідходним, і його продуктивність втричі більша з кожного літра культурального середовища отримується 1,251,33л готового продукту (в прототипі - 0,4л) При цьому зменшуються не тільки витрати на сировину, матеріали, трудовитрати, але й енерговитрати на підтримання температурного режиму при культивації, підвищується пропускна спроможність Ефективність препарату перевіряють біологічним методом по його здатності стимулювати фізіологічні процеси у вищих рослин Фізіологічну активність препарату визначають шляхом порівняння приросту довжини паростків озимої пшениці, вирощених з насіння, обробленого препаратом, та паростків з необробленого насіння Насіння озимої пшениці дезинфікують шляхом занурення на 15 хвилин у 1% розчин КМпО4, промивають дистильованою водою і розкладають по ЗО штук у 3 стерильні чашки Петрі з 5мл водного розчину препарату, розведеного у 1000 разів (1мл препарату розводять дистильованою водою до ЮООмл), і 3 контрольних чашки з 5мл дистильованої води Чашки накривають кришками і витримують в термостаті 3 доби при температурі 20-24°С Потім вимірюють довжину корінців або висоту надземної частини досліджуваних паростків Фізіологічну активність А розраховують за формулою А=(Х 2 Хі)х100% де Хг - середня довжина корінців (висота надземної частини) дослідних паростків, Хі - середня довжина корінців (висота надземної частини) контрольних паростків Препарат вважається активним, якщо його фізіологічна активність не менше 20% Приклад 2 Насіння озимої пшениці сорту Спартанка рів 53006 номірно розкладають в кювети на зволожений фільтрувальний папір , накривають кришками і пророщують 3 доби при 25-26°С Потім однакові за розмірами паростки висаджують в отвори поліетиленових кришок на судини з поживним розчином Кноппа, до якого додають розчини регуляторів росту рослин В кожну судину висаджують по 12 паростків в 3-х разовому повторенні Паростки вирощують при освітленості 4-6тис люкс і на 7 добу визначають довжину коренів, висоту надземної частини і сиру масу паростків Концентрації регуляторів росту рослин становлять 0,001% Для порівняння в якості еталону використовують препарати Гумат натрію та Івш Запропонований регулятор росту в цьому і подальших дослідах для зручності викладення матеріалу буде именуватися "Препарат" Результати досліду наведені в таблиці 1 Таблиця 1 Вплив регуляторів росту рослин на початковий ріст паростків озимої пшениці ЛІНІЙНИЙ Варіант досліду 1 2 3 4 5 Контроль Препарат Прототип Івш Гумат натрію мм 119 0 149 9 141 6 136 2 134 2 Корінь % до контролю 100,0 126,0 119,0 114,4 112,8 ріст мм 115,3 125,4 120,3 119,6 118,6 Приклад З Умови проведення досліду ті самі, що в прикладі 1 Мета досліду - вивчення впливу регуляторів росту рослин на початковий ріст і сортову чут Стебло % до контролю 100,0 108,7 104,3 103,7 102,9 Сира маса надземної частини 100 штук паростків г % до контролю 8,7 100,0 10,4 119,5 9,78 112,4 9,42 108,3 9,40 108,1 ливість паростків озимої пшениці Як еталон використовувався регулятор росту озимої пшениці Гумат натрію Вплив регуляторів росту рослин наріст паростків озимої пшениці Варіант досліду Енергія проростання, % Схожість, % Висота паростків мм % до контролю Таблиця 2 Сира маса надземної частини 100шт паростків г % до контролю 1 Контроль 2 Препарат 3 Гумат натрію (еталон) 75 79 Сорт Альбатрос 94 112,8 95 133 100 118 6,42 7,58 100 118 78 94 113 6,87 107 1 Контроль 2 Препарат 3 Гумат натрію (еталон) 72 75 100 113 10,17 11,8 100 116 106 11,6 114 1 Контроль 2 Препарат 3 Гумат натрію (еталон) 78 85 100 116 11,97 13,1 100 116 111 13,17 110 1 Контроль 2 Препарат 3 Гумат натрію (еталон) 73 76 100 114 12,5 14,3 100 114 108 13,2 104 82 75 СЛ CO Сорт Миронівська 27 152,7 172,6 CO CD CD CD 74 127 161,9 Сорт Миронівська ЗО 95 133,9 96 178,5 94 170,8 Сорт Миронівська 31 92 173,2 95 197,2 93 187,4 8 53006 Варіант досліду 1 Контроль 2 Препарат 3 Гумат натрію (еталон) Продовження таблиці 2 Сира маса надземної Енергія проростанВисота паростків Схожість, % частини 100шт паростків ня, % мм % до контролю г % до контролю Сорт Миронівська 61 75 95 115,8 100 Г 8,73 100 76 96 129,7 112 10,04 115 74 1 Контроль 2 Препарат 3 Гумат натрію (еталон) 71 76 74 94 122,7 Сорт Миронівська 63 93 120,6 94 149,4 92 Приклад 4 Умови проведення досліду ті самі, що в прикладі 2 Мета досліду -вивчення впливу препарату 132,9 106 9,6 110 100 118 9,8 11,17 100 118 105 10,39 110 на початковий ріст паростків сільськогосподарських культур Результати представлені в таблиці З Таблиця З Вплив препарату наріст паростків сільськогосподарських культур Варіант досліду 1 Контроль 2 Препарат 1 Контроль 2 Препарат 1 Контроль 2 Препарат 1 Контроль 2 Препарат 1 Контроль 2 Препарат 1 Контроль 2 Препарат Довжина корінця Висота надземної частини Сира маса паростків мм %до контролю мм % до контролю г % до контролю Пшениця яра - сорт Дніпрянка (4-денні паростки) 92,3 52,4 309,8 0,540 93,0 62,5 119,0 32,4 105 0,664 105 Овес - сорт "Скакун" (5-денні паростки) 83,0 51,1 29,6 0,620 85,7 62,3 122,0 32,0 108 0,787 127 Гречка - сорт Крупинка (5-денні паростки) 72,7 83,1 39,7 1,42 73,7 98,6 119,0 41,9 113 1,73 122 Суданка - сорт Миронівська 10 (6-денні паростки) 95,0 34,4 14,8 0,350 97,0 406,0 118,0 15,5 105 0,424 121 h Сукурудза - сорт "Пюнер-3978" (2-х тижневі паростки, ґрунтова культура) 93,0 156,4 4,110 95,0 170,5 109 4,520 110 Соняшник - сорт "Козачий" (2-х тижневі паростки, ґрунтова культура) 86,2 910,0 540 86,5 110,1 121 605 112 Схожість Приклад 5 Випробування препарату проводилися в 1998 році на Чернігівській, Черкаській і Тернопільській обласних державних сільськогосподарських дослідних станціях Препарат використовувався при ДОПОСІВНІЙ обробці насіння в дозах 5-20мл на 1 тонну (в залежності від культури і при обприскуванні ПОСІВІВ в дозах 5-10мл в 250-350л води на 1га) Досліди закладалися на облікових ділянках площею 50-70м2 у три- або чотиразовому повторенні Всі агротехнічні заходи (внесення добрив, поживних речовин, засобів захисту рослин і т і виконувались згідно технологічних регламентів для даних регіонів Усереднені результати випробувань наведені в таблиці 4 Ефективність препарату при вирощуванні основних сільськогосподарських культур Культура Озима пшениця Ярий ячмінь Горох Соняшник Передпосівна обробка насіння Урожай, Прибавка урожаю ц/га ц/га % Черкаська станція 57,0 6,3 12,4 22,7 5,8 34,3 19,8 3,2 16,9 18,2 2,2 13,8 Таблиця 4 Обприскування ПОСВІВІВ Урожай, ц/га 46,4 21,7 21,5 18,9 Прибавка урожаю ц/га % 6,5 4,7 3,1 2,8 16,8 28,3 16,8 17,4 9 10 Продовження таблиці 4 Ефективність препарату при вирощуванні основних сільськогосподарських культур Культура Кукурудза (зелена маса) Кукурудза (зерно) Картопля Льон-довгунець соломка насіння Травосуміші сінокоснопасовищні 53006 Передпосівна обробка насіння Урожай, Прибавка урожаю ц/га ц/га % Чернігівська станція 331,0 41,0 14,1 77,0 19,4 33,7 446 48,0 10,8 54,2 8,7 5,6 2,0 10,3 30,0 202 22,4 Обприскування ПОСВІВІВ Урожай, ц/га Прибавка урожаю ц/га % 398 49 80,4 12,8 12,3 18,9 367 42 129 39,8 4,6 5,8 1,2 22,2 35,0 22,4 Тернопільська станція Цукровий буряк (коренеплоди) Збір цукру 408 49 136 508 57 126 75,8 83 12,3 83,4 12,1 17,0 Приклад 6 Випробування проводились в тих же умовах в 1996р Метою досліду було порівняння ефективності українських регуляторів росту рослин з кращими іноземними препаратами Конкурсні випробування проводились на посівах цукрового буряку з насіння німецької селекції (фірма KWS Гала) Регулятори росту рослин використовували при обприскуванні ПОСІВІВ цукрового буряка в фазі змикання листя в рядках Результати випробувань наведені в таблиці 5 Таблиця 5 Вплив препарату на продуктивність цукрового буряка Варіант досліду 1 Контроль 2 Препарат, 10мл/га 3 Лактофол, 8л/га 4 Препарат+лактофол 5 Вукасал, 5л/га 6 Препарат+альто 7 Лактофол+альто 8 Препарати фірми "Інагроса", Зл/га Залікова урожайність ± до контролю, ц/га ц/га 494,8 568,9 +74,1 546,8 +52,0 539,0 +41,2 500,7 +5,5 589,6 +94,8 512,9 +1,81 Цукристість ± Де% ко нтролю 16,21 +1,28 17,49 +0,67 16,88 +0,67 16,88 +0,89 17,10 +0,96 17,17 +0,52 16,73 483,0 17,03 -11,8 Таким чином, поставлене завдання виконано Створено економічно дешевий і технологічно простий спосіб одержання регулятора росту рослин, який підвищує енергію проростання і польову схо +0,82 Збір цукру ± до контроц/га лю 80,2 99,5 +19,3 92,3 +12,1 91,0 +10,8 85,6 +5,4 101,2 +21,0 85,8 +5,6 82,2 +2,0 жість насіння, збільшує врожайність широкого кола важливих сільськогосподарських культур, покращує якість рослинної продукції ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24