Спосіб одержання регулятора росту рослин

Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии, а именно к способу получения препарата, регулирующего развитие широкого круга растений. В связи с острой необходимостью расширения производства продуктов питания на первый план выдвигается проблема получения регуляторов роста растений, позволяющих не только повысить продуктивность культур и сохранить урожай, но и обеспечить регулирование процессов метаболизма сельскохозяйственных культур. В настоящее время доказана целесообразность применения регуляторов роста в сельскохозяйственной практике, особенно в повышении устойчивости растений к экстремальным условиям, регулировании процессов вегетативного роста, корнеобразования, прорастания семян и клубней, в управлении процессами цветения, в ускорении созревания и облегчения уборки плодов, а также в предупреждении опадания плодов и семян, регулировании пола и состояния покоя у растений, повышения устойчивости и сроков хранения плодов, применения в моноклональном размножении. В то же время масштабы производства регуляторов роста не соответствуют реальным потребностям производства, сфера их практического применения довольно ограничена, этому препятствует ряд факторов: недостаточное количество доступных дешевых отечественных препаратов, способов их получения, транспортировки, хранения. Известны способы, в которых получение биопрепаратов достигается культивированием различных микроорганизмов с последующим выделением и использованием определенных веществ в качестве препарата (Япония з. №62 20163, з. №1 - 79101, PCT №87/06796). Однако, этот п уть сложен, многоступенчат и ведет к получению узконаправленных препаратов. Известны регуляторы роста растений, обладающие широким спектром действия (гиббрелин, гибберсиб) для широкого круга растений и повышающие урожай на 15 - 20%. Однако эти препараты нерастворимы в воде, а в 0,5% водном растворе аммиака плохо сохраняются (Микробные фитогармоны в растениеводстве. Рига, Зенитне, 1988). Известны способы получения биопрепаратов, в основе которых положено культивирование микроорганизмов с последующим суспензированием их биомассы в воде либо физиологическом растворе (А.с. СССР №1423550, 1555320, 1698242, 1699990. 1712348, э.п. ГДР №272986, а.с. ЧССР №256150, патент США №4818530, №4718935). Известен способ получения регулятора роста растений из фильтрата культуральной жидкости микроорганизмов, однако, он характеризуется многоступенчатостью, использованием разнообразных экстрагентов и растворителей (Stowe B.B. Yamaki T. Ann&Reu& Plant Phusiol., 1956, 8, 181 - 216). Получение регуляторов роста путем микробиологического синтеза имеет преимущество перед химическими способами, так как позволяет получать природные соединения мягкого действия. Однако известные методы включают многоступенчатую систему фракционирования и очистки препаратов, что усложняет процесс, ведет к его удорожанию и снижает выход препарата изза потерь. В основу изобретения поставлена задача создания способа получения регулятора роста растений, в котором за счет выращивания штамма микроскопического гриба в оптимальных для него условиях и последующего выделения продуктов метаболизма обеспечивается простота получения биологически активного препарата широкого спектра действия, недорогого и удобного в применении. Поставленная задача решается тем, что в способе получения регулятора роста растений, включающем культивирование микроорганизма на жидкой питательной среде с последующим выделением продуктов метаболизма, согласно изобретению культивируют штамм микроскопического гриба Mycelia sterilia ИМБ F100005 на жидкой питательной среде в условиях ограниченной аэрации при t 22 - 24°C в течение 60 суток с последующим экстрагированием продуктов метаболизма 70% этиловым спиртом при объемном соотношении компонентов культуральная жидкость: спирт 2,5 : 1. Способ осуществляют следующим образом. Культивируют штамм Mycelia sterilia ИМВ F100005, имеющий такие характеристики: Штамм выделен из корневой системы женьшеня. Идентифицирован по Кирилденко Т.С. Атлас родов почвенных Грибов (Ascomycetes и Fungi Imperfecti). - К.: Наук. думка, 1977. - 127с.; Пидопличко Н.М. Грибная флора грубых кормов. К.: Изд-во АН УССР, 1953. - 485с.). Штамм депонирован в Институте микробиологии и вирусологии НАН Украины под № ИМВ F-100005. Морфологическая характеристика штамма Гифы разветвленные с перегородками, от 1,3 до 3,5мкм толщиной, неокрашены, часто образуют тяжи толщиной до 10 - 15мкм. Спороношение отсутствует. На средах с дрожжевым автолизатом четко выражены мицелиальные тяжи и интеркалярные неокрашенные хламидоспоры в гифа х диаметром 5,0 - 20,0мкм. В гифа х большое количество включений жировой природу сферической и овальной формы. Культуральные свойства штамма Штамм хорошо растет на агаризованных питательных средах: пивном сусле, пивном сусле с добавлением дрожжевого автолизата, мясопептонного агара, картофельно-глюкозной, картофельно-морковной, картофельно-соевой, среде Чапека. Развивается на натуральных питательных средах из зерна злаковых (рис, овес, соя). Колонии на агаризованных средах войлочнопушистые, слегка выпуклые, высотою 4 - 5мм, с возрастом светло-желтые, на обратной стороне светло-соломенного цвета. В жидкой среде, содержащей г/л: глюкоза 10,0; аспарагин - 0,02; - 0,9; 0,3; - 0,1; - 0,1; - 0,02; - 0,02; - 0,02 при выращивании в стационарных условиях при температуре 25°C образует слизистые колонии. С возрастом (10 - 30 суток) культура имеет медузовидный рост. Физиологические свойства штамма. Наблюдается рост штамма на вышеуказанных средах в диапазоне температур 19 - 28°C с оптимумом при 28°C. Является мезофильным микроорганизмом. Хорошо растет на безазотной среде, являясь олиго-нитротолерантным микроорганизмом. Фиксирует 0,24мг молекулярного азота на 25мл среды. При добавлении связанных форм азота в среду развитие усиливается. Биомасса увеличивается в среднем в 3,9 раза. На синтетической, обедненной по азоту среде синтезирует комплекс биологически активных веществ ненасыщенные жирные кислоты, углеводы, аналоги фитогормонов цитокининов и гибберрелинов. В качестве источника углеродного питания использует глюкозу, сахарозу, фр уктозу, ксилозу, крахмал. Хорошо усваивает аммонийный и нитратный азот, а также органические источники азота: гидролизаты белков, аминокислоты, Пигмент не образует. При росте культуры на минеральной среде дефицитной по азоту pH культуральной жидкости 7,0 - 7,3. На азотсодержащих средах pH снижается до 6,5 - 3,2. Долгосрочное хранение штамма с периодическими пересевами через 6 месяцев и сохранением биологических свойств осуществляется на жидкой питательной среде следующего состава, г/л: глюкоза - 10,0, аспарагин - 0,02, - 0,9, - 0,3, - 0,1, - 0,02, - 0,02, - 0,02, pH 7, t 5 - 7°C. Возможно хранение на этой же среде с добавлением агара (20г/л). Микромицет Mycelia sterilia ИМВ F-100005 для получения комплекса биологически активных веществ регуляторов роста растений выращивают на жидкой питательной среде следующего состава (г/л): глюкоза - 10,0, аспарагин - 0,02, - 0,9, - 0,3, - 0,1, - 0,02, - 0,02, - 0,10, - 0,02. Культивирование проводят в стационарных условиях в колбах емкостью 750мл с 250мл питательной среды при t 22 - 24°C в течение 60 суток в условиях аэрации. Культура по окончании инкубирования слизистая бесцветная либо слегка кремоватого оттенка, медузовидная. Для экстракции продуктов метаболизма в колбу добавляют 50мл 70% спирта, перемешивают 6 - 8 часов, затем содержимое колбы фильтруют в воронке Бюхнера. Общий выход водно-спиртового раствора-регулятора роста растений составляет 90% за счет потерь при операции фильтрования. Водно-спиртовый раствор регулятора роста хранят в темном месте при комнатной температуре и проверяют его эффективность биологическим методом по способности стимулировать физиологические процессы у высших растений. Определение биологической активности регулятора роста проводят по измерению длины проростков пшеницы в присутствии препарата по сравнению с контролем. Семена пшеницы предварительно стерилизуют в 33% растворе перекиси водорода в течение 5 минут с последующим промыванием в стерильной дистводе. Препарат для испытаний разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1 : 10000. В 8 стерильных чашек Петри раскладывают по 5 штук семена, затем в 4 опытные чашки заливают по 15см 3 раствора препарата, в 4 контрольные - по 15см 3 воды. Чашки инкубируют в термостате при 24°C. Через 7 суток измеряют длину проростков и определяют среднее значение. Биологическую активность выражают в процентах по отношению к контролю. Увеличение длины проростков пшеницы на 15 - 20%. Влияние полученного таким способом регулятора роста растений приведено в табл.1, 2, 3. Как видно из приведенного выше, способ прост, дешев, доступен и приводит к получению эффективного регулятора роста растений.