Спосіб визначення функціонального стану нейтрофілів крові

Спосіб визначення функціонального стану нейтрофілів крові, що включає дослідження крові, 3 суміші фікол-верографін, збалансованого живильного середовища Хенкса; - хемілюмінометру і відповідного програмного забезпечення для визначення та аналізу даних за допомогою ПК; - спеціалізованої лабораторії та підготованих фахівців; Ознаками, спільними з рішенням, що заявляється, є: - дослідження крові; - визначення фенотипу нейтрофілів у циркуляції крові. Відомий спосіб визначення функціонального стану нейтрофілів [Б.С.Нагоев. Модификация цитохимического метода восстановления НСТ //Лаб. дело - 1983. - №8. - С.7-11], який заснований на визначенні рівня генерації супероксид аніона за його здатністю відновлювати розчинний нітросиній тетразолій (НСТ) до формазану, що утворює в цитоплазмі нейтрофілів осад у вигляді синіх гранул, який включає: - відбір капілярної крові, яку стабілізують гепарином; - приготування ex tempore розчину нітросинього тетразолію у фосфатно-сольовому буфері рН 7,2; - приготування суміші крові та розчину НСТ; - інкубування суміші у водяному термостаті; - фіксацію клітин крові додаванням до суміші рівного об'єму 4% розчину формальдегіду у фізіологічному розчині; - додавання дистильованої води та помішування суміші для лізису еритроцитів; - внесення хлориду натрію для відновлення ізотонічності суміші; - центрифугування суміші для отримання осаду лейкоцитів; - приготування з осаду мазка на предметному склі; - фіксацію мазка у формаліново-спиртовому розчині; - фарбування мазка водним розчином нейтрального червоного; - підрахунок у мазку 100 нейтрофілів і кількості з них, що містять темно-сині грудочки формазану; - діагностування праймованого стану нейтрофілів у циркуляції при перевищенні НСТ - позитивних нейтрофілів більш ніж 18%. Недоліками способу є значна кількість підготовчих не стандартизованих операцій з нейтрофілами крові, які обов'язково змінюють функціональний стан нейтрофілів, праймують їх та вносять невизначеність у кінцевий результат. Ознаками, спільними з рішенням, що заявляється, є: - дослідження капілярної крові; - приготування мазка; - визначення фенотипу нейтрофілів у циркулюючій крові. Відомий спосіб визначення функціонального стану нейтрофілів, а саме їхнього активованого стану, який заснований на визначенні підвищення у сироватці або плазмі крові кількості білкамаркеру азурофільних гранул мієлопероксидази (МПО), тобто на визначенні ступеня звільнення 54766 4 білка-ферменту азурофільними гранулами [Sima Samimi-Fard, Alberto Dominguez-Rodriguez, Pedro Abreu-Gonzalez, Cristina Enjuanes-Grau, Gabriela Blanco-Palacios, Idaira F. Hernandez-Baldomero, Francisco Bosa-Ojeda, Francisco Marrero-Rodriguez Role of Myeloperoxidase as Predictor of Systemic Inflammatory Response Syndrome in Patients With ST-Segment Elevation Myocardial Infarction After Primary Percutaneous Coronary Intervention. American Journal of Cardiology. - 2009. - Vol.104, №5. - P.634-637], що включає: - забір венозної крові; - отримання сироватки крові; - установлення вмісту МПО за допомогою тест-системи зі специфічними до білка- ферменту людини мишиними антитілами; - визначення функціонального стану нейтрофілів, а саме стану активації нейтрофілів: нейтрофіли активовані, якщо вміст МПО сироватки на 20% перевищує вміст ферменту в контролі. Недоліками способу є необхідність: - взяття венозної крові; - тест - систем з моноклональними антитілами до МПО нейтрофілів людини; - комплексу устаткування для проведення твердофазного імуноферментного аналізу з відповідним програмним забезпеченням для визначення та аналізу даних за допомогою ПК. Ознаками, спільними з рішенням, що заявляється, є: - дослідження крові; - визначення мієлопероксидази нейтрофілів. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення функціонального стану нейтрофілів крові, який шляхом цитохімічного виявлення рівня активності лужної фосфатази (ЛФ) та МПО у нейтрофілах мазків крові дозволяє діагностувати їхній функціональний стан, знизити вартість та забезпечити доступність діагностики невідкладних станів у клінічних лабораторіях будьякого рівня акредитації. Суттєвими ознаками способу є: - реєстрація дати дослідження; - забір капілярної крові; - приготування двох мазків крові; - визначення цитохімічними методами з використанням світлового мікроскопа на одному з мазків активності ЛФн, а на другому - МПОн; - розрахунок відносної активності ЛФн та МПОн; - визначення функціонального стану нейтрофілів за значеннями відносної активності ЛФн та МПОн. При значеннях відносної активності ЛФн та МПОн 100±15% діагностують норму - стан спокою нейтрофілів. При значеннях відносної активності: ЛФн більше 115%, а МПОн - більше 85% діагностують праймований стан нейтрофілів. При значеннях відносної активності ЛФн більше 115%, а відносної активності МПОн менше 85% діагностують активований стан нейтрофілів у циркуляції. Відмінними від прототипу ознаками є: - реєстрація дати дослідження; - забір капілярної крові; - приготування двох мазків; 5 - визначення активності ЛФн та МПОн цитохімічним методом з використанням світлового мікроскопа; - визначення функціонального стану нейтрофілів за значеннями відносної активності ЛФн та МПОн з урахуванням сезону року. При значеннях відносної активності ЛФн та МПОн 100±15% діагностують норму - стан спокою нейтрофілів. При значеннях відносної активності: ЛФн більш ніж 115%, а МПОн - більше 85% діагностують праймований стан нейтрофілів. При значеннях відносної активності ЛФн більше 115%, а відносної активності МПОн менше 85% діагностують активований стан нейтрофілів у циркуляції. Теоретичну основу способу склали новітні дані відносно біології нейтрофілів і механізму їхнього праймування та активації. Відомо, що в нормі циркулюючі нейтрофіли крові знаходяться в стані спокою, який характеризується відповідним фенотипом та відсутністю маркерів активації їхнього гранулярного апарату. При станах організму, які супроводжуються підвищенням у крові системних прозапальних цитокінів, останні зв'язуються зі специфічними рецепторами на нейтрофілах й індукують активацію внутрішньоклітинних сигнальних шляхів. При незначному підвищенні концентрації прозапальних цитокінів у цитоплазмі нейтрофілів відбувається обмежене фосфорилювання кількості білків-мішеней без зміни внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію; цей процес викликає мобілізацію секреторних пухирців та включення їхніх мембран у плазматичну мембрану нейтрофілів, що призводить до зміни фенотипу клітин, а також до мобілізації третинних та вторинних гранул. Проявом мобілізації секреторних пухирців є підвищення активності ЛФн; проявом мобілізації третинних гранул - підвищення активності МПО азурофільних гранул. Збільшення концентрації прозапальних цитокінів у циркуляції супроводжується підвищенням внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію, активацією актоміозинового комплексу, який обумовлює дегрануляцію азурофільних гранул та визволення МПОн у кров і, як наслідок, зниження її активності в нейтрофілах, але підвищення у крові. Викладене дозволяє вважати, що показники активності ЛФн та МПОн відображують функціональний стан нейтрофілів, а саме - підвищення активності ЛФн та МПОн відображує стан праймингу циркулюючих нейтрофілів, зниження активності МПОн на фоні підвищеної активності ЛФн - стан їхньої активації. Спосіб здійснюють таким чином: реєструють дату дослідження; проводять забір капілярної крові; готують два мазки, цитохімічними методами з використанням світлового мікроскопа в одному з них визначають в умовних одиницях активність ЛФн, а в другому МПОн; розраховують відносну активність цих ферментів у порівнянні з контролем; діагностують за цими показниками функціональний стан нейтрофілів у циркуляції. Спосіб обґрунтовано дослідженнями активності ферментів у мазках периферичної крові 60 хворих на хронічний обструктивний бронхит (ХОБ), 28 хворих на хронічний середній отит (ХСО), 21 54766 6 хворого на хронічний риносинусит (ХРС), 80 хворих на червоний плоский лишай слизової оболонки ротової порожнини (ЧПЛ СОРП); 85 жінок із загрозою невиношування вагітності та 31 жінки з нормальним перебігом вагітності (контрольна група); контрольну групу для хворих на ХОБ, ХСО, ХРС, ЧПЛ СОРП склали 218 практично здорових осіб, у 15-18 методом випадкової вибірки щомісячно протягом року відбирали кров і досліджували активність ЛФн та МПОн. Статистичний аналіз отриманої бази даних здійснювали за допомогою пакета прикладних програм SPSS, версія 13, для Windows , використовували: методи непараметричної статистики: U test Мана-Уїтні; однофакторний дисперсійний аналіз; достовірними вважали відмінності між досліджуваними групами при значенні Р