Спосіб визначення власної провідності клітин тварин у розчинах

Спосіб визначення власної провідності клітин тварин у розчинах, що включає подачу на занурені у розчин електроди імпульсів напруги зростаючої 3 допробійній області напруженості поля, тобто дослідженні електропорації мембрани у діелектричних водних розчинах, внесок останніх в загальну провідність приводить вже до небажаних її варіацій, які вносять помітну погрішність. А у разі застосування поживних клітинних середовищ, що містять значні кількості різних іонів, їх провідністю нехтувати вже так просто не можна. Тому в таких умовах для отримання чистої провідності клітки необхідно обов'язково враховувати провідність середовища, яка може складати значну частину загальної провідності. Але цей спосіб не дозволяє досліджувати характер провідності клітки в розчинах із значною власною провідністю. Найближчим до того, що заявляється є спосіб визначення провідності рідких середовищ (G01N27/06, G01R27/22, UA, №20187, 2007). Спосіб включає подачу на електроди, занурені в рідке середовище, прямокутних імпульсів напруги із зростаючою від нуля за заданим законом амплітудою, обчислення провідності і побудову графіка її залежності від напруженості поля між електродами. За графіком судять про характер зміни провідності середовища в даному інтервалі напруженості. Проте і цей спосіб не зможе забезпечити коректного і точного визначення власної провідності клітки, що знаходиться в середовищі, все з тієї ж принципової причини аддитивності провідності об'єкту між електродами. Тут також зміни провідності, що відбуваються у середовищі і клітці під дією на них змінної по амплітуді напруги, складатимуться один з одним і дадуть у результаті загальне значення провідності: клітка плюс середовище. Тому все, що може бути джерелом додаткових іонів, обов'язково приведе до неконтрольованих сумарних змін провідності об'єкту між електродами. Це багаторазовий скляний посуд для розведення розчинів, піпетки, предметне скло, мікроінструмент для маніпуляцій з клітками і навіть самі клітки, будучи погано відмиті від залишків сольового буфера. Застосування одноразового посуду на деяких етапах маніпуляцій з розчинами і клітками не тільки лише частково вирішує цю проблему, але вимагає часу і витрат. При цьому залишаються без компенсації інші фактори довільного впливу на провідність об'єкту - невеликі коливання температури, мікрозабруднення і т.п. Все це стає, з одного боку, особливо відчутним в малопровідних розчинах при вивченні провідності таких мікрооб'єктів, як клітки тварин, і приводить до додаткових погрішностей. З другого боку, цей спосіб теж не може забезпечити визначення провідності клітки в розчинах із значною провідністю (поживні середовища). Тому найрадикальнішим рішенням більшості цих проблем було б повне виключення провідності розчину з сумарної провідності. У основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб визначення провідності рідких середовищ так, щоб можна було визначати власну провідність клітки тварини в розчині з довільною провідністю шляхом виключення її із загальної провідності клітки і розчину. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі визначення провідності розчинів, 54779 4 який включає подачу на занурені у розчин електроди імпульсів напруги зростаючої амплітуди, вимірювання електричних параметрів об'єкту для обчислення його провідності, побудову графіка залежності провідності від напруженості поля, згідно корисної моделі, послідовно і незалежно одна від одної визначають провідність клітки у розчині і провідність розчину між тими ж електродами, після чого віднімають останню з першої графічно, аналітичне або апаратно на етапі вимірювань електричних параметрів цих об'єктів. Суть корисної моделі пояснюється графіками. На них зображені експериментальні залежності провідності чотирьох яйцеклітин (ооцитів) миші від напруженості поля. Фіг.1 - 1-а клітка у водному розчині чистої 0,3М сахарози; Фіг.2 - 2-а клітка в сахарозі з домішкою фосфатно-сольового буфера (ФСБ); Фіг.3 - 3-я і 4-а клітки у ФСБ сумісно з ним; Фіг.4 - вони ж за вирахуванням провідності ФСБ. Заявлена корисна модель реалізується таким чином. Наносять краплю розчину з кліткою на предметне скло мікроскопа. Занурюють в неї мікроелектроди, розташовують між ними клітку і подають на них імпульсну напругу із зростаючою від нуля амплітудою. Кінцеве значення амплітуди визначається умовами експерименту. Потім визначають падіння напруги на клітці в розчині між мікроелектродами у момент проходження імпульсу. Після цього, залишаючись в краплі розчину, відводять мікроелектроди убік від клітки і повторюють аналогічні дії. Далі за виміряними значеннями електричних параметрів об'єктів і геометричними параметрами мікроелектродів, що становлять кондуктометричну ячейку, розраховують обидві провідності: - клітки з розчином і розчину без клітки за одним алгоритмом, використовуючи закон Ома і розраховану наперед константу ячейки. Обчислені значення обох провідностей наносять на графік залежно від напруженості поля. Для отримання власної провідності клітки проводять поточкове віднімання відповідних ординат або її обчислюють аналітичне відразу за нескладною формулою різниці, що введена у алгоритм обчислень провідності, якщо немає необхідності в побудові всіх графіків. Компенсувати провідність розчину шляхом віднімання зручно ще і апаратно на етапі вимірювання електричних параметрів об'єктів для подальшого розрахунку провідності. Ці вимірювання можна виконати, наприклад, за допомогою двоканального цифрового осцилографа із запам'ятовуванням сигналів і вбудованим блоком математичної обробки результатів вимірювання. Можна по одному каналу провести вимірювання електричних параметрів тільки розчину, а по іншому каналу клітки з розчином. За допомогою блоку математики осцилографа можна відняти дані вимірювань першого каналу з другого при однойменних вхідних напругах. Порядок визначення електричних параметрів об'єктів принципового значення не має. В результаті одержують параметри напруги для розрахунку провідності тільки клітки без внеску розчину. Приклад 1 Одержана залежність провідності 1-ї клітки від напруженості поля у 0,3М розчині чистої сахарози, 5 Фіг.1. Клітка тричі відмита від ФСБ сахарозою і перенесена в чисту краплю одноразовою піпеткою. На графіку видно, що провідність клітки з сахарозою мало відрізняється за значеннями від власної провідності клітки і віднімання розчину приводить до помітніших коливань провідності клітки при електропорації мембрани. Проте, значення параметрів електропробою мембрани з розчином та без нього мало відрізняються і у певному ряді практичних випадків це несуттєво. Приклад 2 Одержана залежність провідності 2-ї клітки від напруженості поля у 0,3М розчині сахарози, забрудненої ФСБ, що внесений на кінчику піпетки при перенесенні клітки, а також з не відмитою кліткою, Фіг.2. Тому тут провідність сахарози більш, ніж на порядок вище першої. Проте, при відніманні її одержуємо власну провідність 2-ї клітки, чисельно подібну 1-й до напруженості поля 1,7кВ/см, а далі видно індивідуальні особливості, які виявляються в інтенсивнішому, ніж в 1-й, пробої. Причому, тут значення параметрів електропробою мембрани клітки з розчином та без нього майже втричі відрізняються і це вже дуже суттєво. Приклад 3 Одержані залежності провідності 3-ї та 4-ї кліток від напруженості поля у розчині ФСБ сумісно з ним, Фіг.3 та без нього, Фіг.4. На графіку фіг.3 видно, що провідність ФСБ майже на 3 порядки більше, ніж сахарози, і виявилася навіть вище за значеннями провідності кліток через ізолюючий вплив їх біліпідної мембрани. Тому при відніманні прові 54779 6 дності ФСБ, щоб уникнути парадоксу негативних значень провідності клітки, їх слід брати за модулем. На графіку Фіг.4 видно, що власні провідності кліток за вирахуванням ФСБ сильно відрізняються за значеннями від таких у сахарозі. Це відбувається, на відміну від сахарози, за рахунок зворотного руху іонів з буфера всередину клітки через мембрану під час її електропорації полем, причому, залежності провідностей у кліток 3 і 4 практично конгруентні на початковій ділянці напруженості, що підкреслює аутентичність цього процесу. Перевага способу, що заявляється, полягає у тому, що на відміну від прототипу він враховує аддитивний характер провідності клітки і розчину у міжелектродному просторі. При цьому використовується одна і та ж пара електродів, а, значить, геометричні і електрофізичні параметри кондуктометричної ячейки залишаються незмінними. Спосіб відкриває можливість визначати власну провідність кліток тварин практично в будь-яких розчинах, зокрема, в буферних поживних середовищах з високим вмістом іонів, білкових та гормональних добавок, що також мають свою провідність. На фоні великих значень провідності таких середовищ можна не помітити незначний внесок провідності клітки. Шляхом запропонованого віднімання можна одержати власну провідність клітки в чистому вигляді навіть на такому могутньому іонному фоні. Завдяки пропонованому рішенню експериментатор може застосовувати різні середовища, які при такому підході можуть міняти провідність на свій розсуд, як завгодно. 7 54779 8 9 Комп’ютерна верстка А. Рябко 54779 Підписне 10 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601