Спосіб спектрофотометричного визначення рибофлавіну у лікарських формах аптечного виготовлення

Спосіб спектрофотометричного визначення концентрації рибофлавіну у лікарських формах аптечного виготовлення, що включає приготування аналітичного розчину та розчину стандартного 3 печити необхідну точність та відтворюваність результатів аналізу при проведенні контролю якості. Поставлене завдання вирішується таким чином, що концентрацію рибофлавіну у 0,02% розчині визначають спектрофотометричне, методом стандарту, який включає приготування розчину стандартного зразку шляхом розчинення точної наважки 0,0200г рибофлавіну у воді при нагріванні до заданого розведення з подальшим вимірюванням оптичної густини аналітичного розчину та робочого стандарту. Згідно з корисною моделлю передбачено, що концентрацію рибофлавіну визначають у 0,02% розчині аптечного виготовлення у порівнянні з розчином робочого стандартного зразку при розведенні розчинів 2.10-5г/мл і вимірюванні їх оптичної густини за довжини хвилі 373нм, використовуючи в якості розчину порівняння - воду Р, оптичну густину кожної проби вимірюють тричі з використанням кювети з товщиною шару 1см. Всі параметри заявленого способу визначені дослідним шляхом. Оптичну густину досліджуваних розчинів доцільно визначати спектрофотометричним методом за довжини хвилі 373нм, оскільки на даній ділянці спектру для молекули рибофлавіну спостерігається пологий максимум поглинання. Розведення досліджуваних розчинів до 2.105 г/мл забезпечує величину значення оптичної густини в межах 0,4-0,7, що суттєво підвищує точність заявленого способу. Заявлений спосіб здійснюється наступним чином: Аналітичний розчин препарату: 5 мл 0,02% розчину рибофлавіну переносять у мірну колбу місткістю 50мл, доводять водою Р до мітки. Розчин робочого стандартного зразку: 0,0200г(т.н.) субстанції рибофлавіну (що відповідає вимогам ДФУ) переносять в мірну колбу місткістю 100 мл, суспендують у 15мл води Р, потім додають 50мл води Р перемішують при нагріванні не доводячи до кипіння. Після охолодження до 20°С±2°С об'єм розчину доводять до 100мл. 5,0мл отриманого розчину переносять у мірну колбу місткістю 50мл, доводять водою Р до мітки. Оптичну густину аналітичного та робочого стандартного розчинів вимірюють за аналітичної довжини хвилі 373нм відносно розчину порівняння - вода Р. Вимірювання оптичної густини отриманих розчинів проводять тричі з вийманням кювети з використанням кювети завдовжки 1 см при температурі 20±2°С за однакових умов з мінімальним інтервалом у часі. Порівнюючи з аналогічними способами, запропонований спосіб характеризується рядом переваг: для кількісного вмісту рибофлавіну запропоновано використання методу стандарту, який дозволяє нівелювати похибку обладнання, вплив температури і враховує вплив мірного посуду та пробопідготовки на невизначеність аналізу. Концентрація аналітичного розчину і розчину робочого стандарту підібрана таким чином, що оптична густина на спектральній ділянці, що досліджується, 55059 4 знаходиться в межах від 0,4-0,7, що сприяє підвищенню точності аналізу. Для запропонованого способу кількісного визначення проведено вивчення наступних метрологічних характеристик: діапазон застосування, робасність, точність, прецизійність на рівні внутрішньо лабораторної точності, а також відтворюваність в умовах різних лабораторій. Отриманні валідаційні характеристики узгоджені з критеріями відповідності згідно до вимог ДФУ [7, 8]. Корисна модель ілюструється прикладами. Приклад 1 Заявлений спосіб був апробований на модельних розчинах рибофлавіну, та була проведена оцінка правильності та збіжності даного способу для серії з п'яти модельних розчинів з різною концентрацією у трьох повтореннях. Одержали перший розчин - аналітичний розчин 0,02% лікарської форми рибофлавіну з розведенням 2.10-5г/мл. Розведення готували наступним чином: 5мл 0,02% розчину рибофлавіну переносили у мірну колбу місткістю 50мл, доводили водою Р до мітки. Розчин стандарту зразку одержали шляхом відважування наважки 0,0200г (т.н.) субстанції рибофлавіну та її кількісного перенесення в мірну колбу місткістю 100мл. Перенесену субстанцію суспендували у 15мл води Р, після додавання 50мл води Р перемішували при нагріванні до повного розчинення рибофлавіну. Після охолодження до 20°С об'єм розчину доводили до 100мл 5,0мл отриманого розчину переносили у мірну колбу місткістю 50мл, доводили водою Р до мітки. Оптичні густини аналітичного та стандартного розчинів вимірювали за довжини хвилі 373нм. Кількісний вміст рибофлавіну розраховували за формулою: A i Cst , де A st Аi - оптична густина аналітичного розчину; Ast - оптична густина розчину стандартного зразку; Сst - концентрація розчину стандартного зразку, (в г/мл). Знайдені середні значення трьох вимірів оптичної густини для аналітичного розчину і розчину стандарту Арозчину=0,4876, Аst=0,4896 і Сst=0,0002г/мл, то 0,4876 0,0002 C X,г / мл 199 10 4 (г / мл). , 0,4896 Одержаний результат відповідає вимогам до вмісту рибофлавіну у даній лікарській формі ±15% відносно прописаної кількості рибофлавіну у лікарській формі, що складає 1,7.10-4-2,3.10-4(г/мл). Для підтвердження точності та збіжності заявленого способу були досліджені метрологічні характеристики методики для п'яти модельних розчинів різних концентрацій. Результати дослідження наведені у таблиці 1. Аналітичні розчини та розчин стандартного зразку одержували згідно з заявленим способом, який описаний вище. Cx 5 55059 6 Таблиця 1 Результати аналізу модельних розчинів та їх статистична обробка № модельного розчину Наважки рибофлавіну, мг (mst=0,2000) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 0,0350 0,0425 0,0500 0,0575 0,0650 Знайдено в % до Введено в % до конЗнайдено в % до Оптична густина концентрації розцентрації розчину введеного А; (Ast=0,4896) чину порівнянпорівняння (Хіфакт %) Z1=100(Yi/Xi) ня(Yi %) 0,341 69,65 99,50 70,00 70,00 0,340 69,44 99,21 70,00 0,340 69,44 99,21 0,409 83,54 98,28 85,00 85,00 0,410 83,74 98,52 85,00 0,409 83,54 98,28 0,486 99,26 99,26 100,00 100,00 0,489 99,88 99,88 100,00 0,488 99,67 99,67 0,556 113,56 98,75 115,00 115,00 0,556 113,56 98,75 115,00 0,554 113,15 98,39 0,632 129,08 99,30 130,00 130,00 0,630 128,68 98,98 130,00 0,633 129,29 99,45 середнє Z%= 99,03 відносне стандартне відхилення, Sz%= 0,51 0,90 відносний довірчий інтервал as%= 4,80 критичне значення для збіжності результатів as%= -0,97 систематична похибка = критерій невизначеності систематичної похибки: 1. практична невизначеність = 0,40 1,54 2. якщо не виконується 1, то статистична невизначеність загальний висновок щодо прийнятності методики коректна Вимоги до параметрів правильності і збіжності для запропонованого методу виконуються на всьому діапазоні застосування методики (70%130%). Приклад 2 Для оцінки робасності проводили дослідження впливу рН середовища на стабільність. Перевірку стабільності аналітичних розчинів (випробуваного та стандартного) проводили шляхом виміру оптичної густини за аналітичною довжиною хвилі 373нм протягом години через кожні 15хв з послідуючою статистичною обробкою експериментальних даних та їх оцінкою шляхом порівняння з критичними значеннями (результати наведені в табл.2). Таблиця 2 Результати дослідження стабільності № модельного розчину досліджуваного порівняння 0 0,4903 0,4770 період часу nt, хв. 15 30 45 0,4896 0,4916 0,4900 0,4763 0,4756 0,4763 Статистична оцінка впливу часу на аналізований розчин відповідає критеріям прийнятності, тобто не перевищує систематичну похибку max,%=1,54, та дозволяє зробити висновок, що при проведенні аналізу протягом години за даною методикою будуть отримані коректні результати. Приклад 3 Вивчення впливу незначних коливань рН на оптичну густину досліджуваних розчинів проводи 60 0,4883 0,4760 середнє RSDt,% 0,4902 0,4762 0,2505 0,1077 t,% 0,5339 0,2296 max ,% 1,54 ли за схемою: до модельних розчинів (85%, 100%, 115%) додавали по 1 краплі 0,01М розчину соляної кислоти або 0,01М розчину гідроксиду натрію, щоб відтворити коливання рН±10% (від 4,97 до 6,07). Для отриманих модельних розчинів вимірювали оптичну густину при 373нм (табл.3). 7 55059 8 Таблиця 3 Результати вивчення впливу рН на оптичну густину розчинів Модельний розчин 1 2 3 Оптична густина Аi дослід 3: дослід 1: дослід 2: +1крап. +1крап. без змін 0,01М 0,01M HCl NaOH 0,4080 0,4097 0,4087 0,4870 0,4883 0,4887 0,5563 0,5547 0,5557 Статистичні результати впливу коливань рН на результати аналізу свідчать, що дана методика надійна при її виконанні в зазначених умовах. Приклад 4 Для підтвердження відтворюваності заявленого способу проводили серію вимірювань у різних середнє SrрH RSDpH, % 0,4088 0,4880 0,5556 0,0008 0,0009 0,0008 0,0839 0,0882 0,0839 рH,% 0,24 0,26 0,24 max , % 1,54 умовах (у різних лабораторіях, у різний час, на різних приладах, різними методами). Результати вивчення відтворюваності методу в умовах трьох різних лабораторій наведені в таблиці 4. Таблиця 4 Відтворюваність спектрофотометричного методу кількісного визначення рибофлавіну Відтворюваність методики в різних лабораторіях № розчину 1 99,50 2 99,21 3 99,21 4 98,28 5 98,52 6 98,28 7 99,26 8 99,88 9 99,67 10 98,75 11 98,75 12 98,39 13 99,30 14 98,98 15 99,45 середнє 99,03 об'єднане середнє Zintra%= Sintra%= 1,06 об'єднане відносне стандартне відхилення SDintra%= міжлабораторна систематична похибка = intra%= Отримані статистичні характеристики запропонованого методу являють собою результати порівняння статистичних відхилень трьох різних випробувань однієї серії і свідчать, що дана методика може бути коректно відтворена в умовах іншої лабораторії. Отже, запропонований спектрофотометричний спосіб кількісного визначення рибофлавіну в 0,02% розчині аптечного виготовлення відповідає вимогам ДФУ і може бути використаний при аналізі контролю якості в умовах аптек і лабораторій. Джерела інформації: 1. Baker H, Frank O. Analysis of riboflavin and its derivatives in biological fluids and tissues. In: Rivlin Величини Zi 99,89 100,16 100,16 101,37 101,15 101,37 100,18 99,82 100,18 100,27 100,43 100,43 100,62 100,48 100,48 100,47 99,92 0,74 100,51 100,21 100,51 100,17 100,17 100,42 99,94 99,73 99,94 100,13 100,5 100,31 100,44 100,6 100,28 100,26 0,43 0,79 0,08 ±0,30 RS, ed. Riboflavin. New York: Plenum Press, 1975:49-79. 2. Bo¨tticher В, Bo¨tticher D. A new HPLCmethod for the simultaneous determination of B1-, B2- and Вб-vitamers in serum and whole blood. Int J VitamNutrRes 1987;57:273-8. 3. Kodentsova VM, Vrzhesinskaya OA, Spirichev VB. Fluorometric riboflavin titration in plasma by riboflavin-binding apoprotein as a method for vitamin B2 status assessment. Ann Nutr Metab 1995; 39:35560. 4. Chimezie Anyakoral, Ibukun Afolami, Teddy Ehianetal and Francis Onwumere. HPLC analysis of nicotinamide, pyridoxine, riboflavin and thiamin in 9 55059 some selected food products in Nigeria. African Journal of Pharmacy and Pharmacology Vol.2(2) 2008pp. 029-036. 5. Кока І.П., Колтун П.С. Йодометричн визначення рибофлавіну, метилурацилу і рутину в деяких лікарських сумішах / Фармацевтичний журнал. - 1986. - №4. - С.64-65. 6. Шах Ц.І. Спектрофотометричне визначення рибофлавіну в лікарських сумішах / Фармацевтичний журнал. - 1969. - №4. - С.37-44. Комп’ютерна верстка О. Рябко 10 7. Державна Фармакопея України /Державне підприємство «Науково-експертний фармакопейний центр». - Доповнення 1. - Харків: РІРЕГ. 2004. - 520с. 8. Державна Фармакопея України /Державне підприємство «Науково-експертний фармакопейний центр». - Доповнення 2. - Харків: РІРЕГ. -2008. - 608с. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601