Спосіб спектрофотометричного визначення гідроксикоричної кислоти та її похідних у лікарських рослинах та їх препаратах

Спосіб спектрофотометричного визначення пдроксикоричної кислоти та її похідних у лікарських рослинах та їх препаратах шляхом вимірювання поглинання розчину, який відрізняється тим, що пробу попередньо обробляють 0,045 - 0,225 М розчином солі алюмінію (III) при рН 4,5 - 5,5 і вимірюють поглинання при 355 нм проти розчину порівняння, який містить усі ті ж компоненти, крім солі алюмінію (III) етанольним (1 1) розчином, з наступним 50кратним розведенням екстракту цим же розчином та вимірювання поглинання отриманого розчину при ЗЗОнм у кюветі товщиною 10мм Сумарний вміст ГК визначають у перерахунку на цикорієву кислоту (кон'югат пдроксикоричної кислоти з тартратною) Спосіб дозволяє визначати суму похідних пдроксикоричної кислоти у кореневищах з коренями ехінацеї пурпурової при їх ВМІСТІ -2,5% Принциповими недоліками методу [2, 3] є недостатня вибірковість і недостатня правильність Причина полягає утому, що свппопоппинання розчину при ЗЗОнм, за величиною якого розраховують вміст ГК, обумовлене наявністю не тільки ГК, які, в основному, обумовлюють імуномодулюючу дію ехінацеї [4], але й продуктів їх окиснення хинонів, які також поглинають в цій області [5] Наприклад, результати аналізу цим методом [2, 3] настойки ехінацеї показують майже незмінний вміст ГК у препаратах з непросроченим і просроченим терміном дії, що викликає сумнів Крім того, метод вимагає використання високоточних сучасних спектрофотометрів та стандартів, затверджених для певної лікарської речовини [6] Цикорієва кислота у теперішній час не може бути стандартом, оскільки не відповідає вимогам, що висуваються до стандартних речовин у фармакології [6], зокрема, цей реактив є малодоступним, не виробляється, синтез його є складним [7] Крім того, щодо величини питомого показника поглинання цикорієвої кислоти при ЗЗОнм у літературі існують розбіжності у роботі [2] вміст ГК розраховували за Е 1сн 1% = 740, а у роботі [3] - 782 1 00 00 ю 54887 В основу винаходу поставлено задачу створення способу спеїсгрофотометричного визначення пдроксикоричної кислоти та и похідних у лікарських рослинах та їх препаратах шляхом застосування реагенту, який взаємодіяв би лише з ГК і не взаємодіяв би з іншими компонентами аналізованих об'єктів, що забезпечило б підвищення вибірковості та правильності визначення Вирішення задачі досягається тим, що у способі спектрофотометричного визначення пдроксикоричної кислоти та и похідних у лікарських рослинах та їх препаратах шляхом вимірювання поглинання розчину пробу попередньо обробляють 0,045 - 0.225М розчином солі алюмінію (III) при рН 4,5 - 5,5 і вимірюють поглинання при 355нм проти розчину порівняння, який містить усі ті ж компоненти, крім алюмінію (III) Таким чином, суттєвими ознаками запропонованого способу спектрофотометричного визначення пдроксикоричної кислоти та її похідних у лікарських рослинах та їх препаратах є те, що розчин попередньо обробляють 0,045 - 0.225М розчином солі алюмінію (III) при рН 4,5 - 5,5, поглинання вимірюють при 355нм проти розчину порівняння, який містить усі ті ж компоненти, що й досліджуваний розчин, крім солі алюмінію (III) Використання способу, що заявляється, для спектрофотометричного визначення ГК у лікарських рослинах та їх препаратах є необхідним і достатнім для досягнення технічного результату, який полягає у підвищенні вибірковості та правильності визначення Крім того, пдроксикорична кислота, обрана як стандартна, відповідає вимогам до стандартних речовин у фармакологи, на відміну від цикорієвої кислоти у прототипі Оптимальні умови визначення пдроксикоричної кислоти та и похідних Концентрація солі алюмінію (III) 45 225ммоль/дм3, значення рН розчину 4,5 - 5,5, поглинання вимірюють при довжині хвилі 355нм Зміна забарвлення при утворенні комплексу з алюмінієм (III) спостерігається у діапазоні концентрацій ГК 0,1 - 8,0мг/дм3 Межа виявлення ГК становить 0,1мг/дм3 Застосування для спектрофотометричного визначення пдроксикоричної кислоти та и похідних солей алюмінію (III) у літературі не відомо, що дозволяє вважати запропонований спосіб таким, що відповідає критеріям "новизна" та "суттєві ВІДМІННОСТІ" Винахід ілюструється наступними прикладами Приклад 1 У колбу ємністю 25см3 вносили аліквотну частину розчину, що містив 0,1 - 8,0мг/дм3 ГК, 2,0см3 0.045М розчину хлориду алюмінію (III) 0,01 н відносно НСІ, створювали рН розчину 4,5 - 5,5 додаванням 0,01 н розчину ІЧЬЦОН (контролювали рНметром), доводили дистильованою водою до мітки, перемішували і вимірювали оптичну густину розчину при 355нм проти розчину порівняння Для приготування розчину порівняння у колбі ємністю 25см3 змішували всі компоненти, як вказано вище, крім розчину хлориду алюмінію (III), встановлювали рН 4,5 - 5,5, доводили водою до мітки і перемішували Концентрацію ГК знаходили за градуювальним графіком у координатах А355 - концентрація 4 пдроксикоричної кислоти, мг/дм3 Рівняння градуювального графіка А355 = (0,002 ± 0,001) + (0,0841 ± 0,0005)С(мкг/мл) Градуювальний графік ЛІНІЙНИЙ В інтервалі концентрацій пдроксикоричної кислоти 0,1 - 8,0мг/дм3 Межа виявлення дорівнює 0,1 мг/дм3 Приклади 2 - 9 Обгрунтування оптимального інтервалу рН визначення ГК В колби ємністю 25см3 вносили 1,0см3 розчину із вмістом ГК 0,2мг/дм3, додавали всі компоненти, як у прикладі 1, крім розчину NH4OH, який додавали у КІЛЬКОСТІ, необхідній для створення рН 3,5, 4,0, 4,2, 4,5, 5,0, 5,5, 5,7 або 6,0, контролюючи його значення рН-метром Далі проводили всі операції як вказано у прикладі 1 Вміст ГК знаходили за градуювальним графіком Результати наведені в таблиці 1 Видно, що оптимальним є значення рН в інтервалі 4,5 - 5,5 Таблиця 1 Вплив рН розчину на правильність визначення ГК Приклад № 2 3 4 5 6 7 8 РН 3,5 4,0 4,2 4,5 5,0 5,5 5,7 9 6,0 Помилка визначення, % ЗО 12 8 3 2 2 4,8 розчин мутніє внаслідок гідролізу АІ (III) Приклади 10-11 Обгрунтування застосування різних солей алюмінію (III) В колби ємністю 25см3 вводили 4,0мг/дм3 пдроксикоричної кислоти і всі компоненти як у прикладі 1, крім розчину хлориду алюмінію (III) Замість нього вводили таку ж КІЛЬКІСТЬ 0.045М розчину сульфату алюмінію (III) 0,01 н відносно H2SO4 або 0.045М розчину нітрату алюмінію (III) 0,01 н відносно НІЧОз і далі проводили всі операції як вказано у прикладі 1 Вміст ГК знаходили за градуювальним графіком Результати наведені в таблиці 2 Видно, що заміна хлориду на сульфатанюн не впливає на результати аналізу ГК Використання азотнокислого нітрату алюмінію небажане внаслідок окиснювальної здатності нітрат-юну Таблиця 2 Вплив аніонів солей алюмінію на визначення пдроксикоричної кислоти в стандартному розчині (п = 5, Р = 0,95) Приклад № Аніон 1 10 11 СІ SO4" NO3 Гидроксикорична кислота, мг/дм3 Введено Знайдено 4,00 ± 0,02 4,0 4,01 ±0,02 3,7 ±0,03 54887 Приклади 12-17 Обґрунтування оптимальної концентрації хлориду алюмінію (III) В колби ємністю 25см вносили 1,0см3 розчину із вмістом ГК 0,2мг/дм3, додавали всі компоненти, як у прикладі 1, крім розчину хлориду алюмінію (III), який вносили у КІЛЬКОСТІ ВІД 2,5 до 225ммоль/дм Далі проводили всі операції як вказано у прикладі 1 Вміст ГК знаходили за градуювальним графіком Результати наведені в таблиці 3 Видно, що оптимальною є концентрація хлориду алюмінію (II І) 45 - 225ммоль/дм3 Таблиця З Вплив концентрації хлориду алюмінію на визначення пдроксикоричної кислоти в стандартному розчині (п 5, Р = 0,95) Приклад № Сді, ммоль/дм'5 Помилка визначення, % 12 13 14 15 16 1 17 18 2,5 7,5 15 25 ЗО 45 100 225 22 13 10 6 4 2 2 2 Приклади 19- 21 Обґрунтування складу розчину порівняння У колби ємністю 25см вводили 4,0мг/дм3 пдроксикоричної кислоти та всі компоненти, як у прикладі 1 Поглинання розчину вимірювали, як у прикладі 1, але як розчин порівняння використовували дистильовану воду, розчин NH4CI з рН 4,5 - 5,5 у відсутності та у присутності 0,045моль/дм3 хлориду алюмінію (III) Концентрацію ГК знаходили за графіком, побудованим в координатах А355 - концентрація пдроксикоричної кислоти у розчині, мг/дм3 Результати наведені у таблиці 4 Таблиця 4 Статистична обробка результатів визначення ГК у стандартних розчинах залежно від складу розчину порівняння (п = 5, Р = 0,95) Приклад № 1 19 20 21 Розчин порівняння 4.00МГ/ДМ' ГК + розчин NH4CI з рН 4,5 - 5,5 Дистильована вода Розчин NH4CI з рН 4,5 - 5,5 у відсутності АІСІз Розчин NH4CI з рН 4,5 - 5,5 у присутності 0.045М АІСІз З даних таблиці 4 видно, що при визначенні індивідуальної сполуки (пдроксикоричної кислоти) результати, отримані за прикладами 1 та 19 - 21, співпадають, що свідчить про правомірність застосування як розчину порівняння розчину, що містить всі компоненти реакційної суміші, крім хлориду алюмінію (III) Концентрація ГК, мг/дм'5 Введено Знайдено х ± Дх 4,00 ± 0,03 3,99 ± 0,03 4,00 4,00 ± 0,04 3,98 ± 0,04 Приклади 22-25 Визначення пдроксикоричної кислоти у стандартних розчинах В таблиці 5 наведена статистична обробка результатів визначення ГК в стандартних розчинах З даних таблиці 5 видно, що даний спосіб є достатньо точним та має задовільну відтворюваність Таблиця 5 Статистична обробка результатів визначення ГК в стандартних розчинах спектрофотометричним методом (п = 5, Р = 0,95) Приклад № 22 23 24 25 Концентрація пдроксикоричної кислоти, мг/дм'5 Введено Знайдено х ± Дх 0,20 0,20 ± 0,02 1,20 1,20 ±0,02 4,0 4,03 ± 0,04 8,0 8,0 ±0,1 Відносне стандартне відхилення при спектроскопічному детектуванні не перевищувало 0,1 Приклад 26-29 Обґрунтування складу розчинів порівняння при аналізі настоянок ехінацеї При аналізі модельної суміші у колби ємністю 54887 25см3 вводили 0,3см3 "Настойки", 0, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0мг/дм3 пдроксикоричної кислоти та всі компоненти, як у прикладі 1 Поглинання розчину вимірювали, як у прикладі 1, але як розчини порівняння використовували розчини як в прикладах 1 та 19 21 Концентрацію ГК знаходили за графіком, побудованим в координатах А355 - концентрація пдроксикоричної кислоти у розчині, мг/дм Правильність одержаних результатів підтверджена 8 методом внутрішнього стандарту ("введенознайдено") Результати наведені у таблиці 6 В таблиці 6 наведена статистична обробка результатів визначення ГК у «Настойці ехінацеї» залежно від складу розчину порівняння 3 таблиці 6 видно, що при визначенні ГК в препаратах ехінацеї слід застосовувати розчин порівняння, приготовлений як той, що аналізують, з додаванням всіх компонентів, крім хлориду алюмінію (III) Таблиця 6 Статистична обробка результатів визначення ГК у «Настойці кореневищ з коренями ехінацеї пурпурової» Приклад № 1 26 27 29 Розчин порівняння Аліквотна частина настоянки + розчин NH4CI з рН 4,5 - 5,5 Дистильована вода Розчин NH4CI з рН 4,5 - 5,5 у відсутності АІСІ3 Розчин NH4CI з рН 4,5 - 5,5 у присутності 0.045М АІСІ3 Приклади ЗО, 31 Визначення ГК в складних сумішах природних сполук, які мають власне забарвлення 3 3 В колби ємністю 25см вносили 0,3см "Настойки кореневищ з коренями ехінацеї пурпурової" (серія 14 05 99) через 10 та ЗО МІСЯЦІВ ПІСЛЯ виготовлення ВІДПОВІДНО (термін придатності настойки 12 МІСЯЦІВ) Далі проводили всі операції як вказано в прикладі 1 У таблиці 7 наведена статистична обробка результатів визначення суми ГК у настойці ехінацеї залежно від тривалості зберігання Видно, що з часом, внаслідок окиснення та розкладу рослинно Похибка визначення 2,1% 43% 43% 43% го комплексу, в т ч ГК, зменшується загальна інтенсивність поглинання настойки, причому наявність у ній інших забарвлених сполук обумовлює відсутність прямої пропорційності для залежності ДА - ДСгк, що не враховується при визначенні ГК за прототипом Так, результати, отримані запропонованим способом, який враховує власне поглинання інших забарвлених сполук, свідчать про зменшення з часом концентрації ГК, і, ВІДПОВІДНО, імуномодулюючої активності препарату, майже у 5 разів, тоді як результати визначення за прототипом - лише у 1,7 разів Таблиця 7 Статистична обробка результатів визначення ГК у "Настойці кореневищ з коренями ехінацеї пурпурової (серія 14 05 99)" за прототипом та запропонованим способом (п = 6, Р = 0,95) Приклад Строк зберігання настойки (МІСЯЦІВ)* ЗО 31 10 ЗО Сума похідних пдроксикоричної кислоти, мг/дм'5 За прототипом Запропонованим методом 1120 ±11 601 ±10 642 ± 5 123 ± 3 За паспортом термін придатності препарату складає 24 МІСЯЦІ Приклади 32- 40 Результати визначення ГК в препаратах ехінацеї запропонованим способом В таблиці 8 наведена статистична обробка результатів визна чення ГК у препаратах ехінацеї Правильність одержаних результатів підтверджена методом внутрішнього стандарта "введено-знайдено" Таблиця 8 Статистична обробка результатів визначення ГК у настойках кореневищ з коренями ехінацеї пурпурової (1 - 6), екстракті ехінацеї пурпурової рідкому (7) та препаратах Іммуналу (8 - 9) у перерахунку на пдроксикоричну кислоту (п = 5, Р = 0,95) Приклад 32 33 34 35 36 Лікарський препарат 1 2 3 4 5 Виробник, № серії Київ, 05 03 96 Київ, 14 05 99 Київ, 21 10 00 Київ, 03 02 01 Тернопіль, 25 10 01 Термін придатності ГК, мг/дм3 III 1997 V2001 Х2002 II 2003 XI 2003 95 ± 6 123 ± 3 65 ± 5 407 ± 9 229 ± 7 54887 37 38 39 40 6 7 8 9 10 Продовження таблиці 8 Тернопіль, 18 08 01 Лубнифарм, 21100 Лекд д "Любляна", Словенія, 4304509А Лек д д "Любляна", Словенія, 1102810В Практичне застосування спектрофотометричного способу визначення ГК, що заявляється, дозволяє, у порівнянні з прототипом, підвищити вибірковість і правильність визначення ГК у лікарських рослинах та їх препаратах, що мають власне забарвлення Методика проста у виконанні, експресна (час одного визначення обмежується часом вимірів поглинання на фотоелеісгроколориметрі чи спектрофотометрі), не потребує застосування токсичних органічних реактивів, придатний для експресконтролю якості препаратів, що містять ехінацею Джерела інформації 1 ВФС42У-100/38-194-96 2 ФС 42У-44/4-663-00 IX 2003 XII 2002 IX 2001 Х2002 361 3500 170 369 ±4 ± 35 ±9 ±8 3 В А Куркин, О И Авдеева, Е В Авдеева, П Г Мизина // Растительные ресурсы 1998 Вып 2 Т 34 4 Середа А В , Моисеева Г Ф // Фармаком 1998 № 3 С 13-23 5 В А Барабой Биологическое действие растительных фенольных соединений Киев Наукова думка, 1976 С 168 6 В П Георгиевский, А И Гризодуб Стандартизация и контроль качества лекарств в кн Технология и стандартизация лекарств Харьков ООО «РИРЕГ», 1996 7 Scarpati М L , Onente G //Tetrahedron 1958 V 4 Р 43-48 Підписано до друку 03 04 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24