Штам бактерій bacillus subtilis – продуцент протипухлинних цитотоксичних речовин

Штам бактерій Bacillus subtihs 1MB B-7025 продуцент протипухлинних цитотоксичних речовин Винахід відноситься до області мікробіологи, а саме штамів бактерій Bacillus subtihs і може бути використаний для одержання біологічно активних речовин пектинової та протеазної природи з цитотоксичною активністю по відношенню до пухлинних клітин ВІДОМІ штами Вас subtihs 316М і Вас polymyxa 102 КДУ, які продукують біологічно активні речовини пектинової природи з протипухлинною активністю [1] Однак продуктивність даних штамів не забезпечує необхідний рівень цитотоксичної протипухлинної активності Найбільш близьким штамом до запропонованого є штам Вас subtihs 668 1MB, який продукує біологічно активні речовини пектинової природи з цитотоксичною протипухлинною активністю по відношенню до карциноми Уокера, аденокарциноми молочної залози, саркоми 180 і саркоми 45 [2] У порівнянні з вищеописаними штам Вас subtihs 668 1 MB є більш ефективним по продукуванню протипухлинної пектинової активності Однак використання цього штаму не завжди ефективне через недостатньо високу його цитотоксичну протипухлинну активність В основу винаходу поставлена задача одержати більш продуктивний штам Вас subtihs (шляхом використання методів аналітичної селекції), який би синтезував цитотоксичні речовини з вищою протипухлинною активністю Поставлена задача вирішена шляхом одержання нового штаму Bacillus subtihs, який виділений методами аналітичної селекції із штаму Вас mesentencus АБ-56, депонований у колекції Інституту мікробіологи та вірусологи (1MB) НАН України під номером 1MB В-7025 Штам ідентифікований по «Краткому определителю бактерий» Берп [3] У результаті селекційної роботи вищезгаданий штам набуває таких культуральноморфолопчних та фізюлого-бюхімічних властивостей, які і забезпечують його високу продуктивність протипухлинних цитотоксичних речовин Культурально-морфолопчні ознаки Даний штам добре росте при температурі 2840°С на МПБ, МПА, 5% екстракті вівсяних пластивців, 10% екстракті пшеничних висівок Грампозитивна, паличковидна клітина, ширина 0,7-0,8мкм, довжина - 2-Змкм, наявність ендоспор, які утворюються в присутності кисню, форма - овальна, клітини розташовуються поодиноко або ланцюжком Вирощуючи 24-48 годин на МПА, спостерігаємо дисоціацію колоній таких варіантів (типів) R-форма - плоска, шероховата, матова, суха, порізаний край, розмір колоній 4-5мм, Оформа -випукла, гладенька, слизиста, рівний край, розмір колоній 3-4 mm, S-форма - плоска, гладенька, пастоподібна, злегка хвилястий край, розмір колоній 3-5мм При культивуванні на рідких живильних (21)2001042565 ( 2 2 ) 1 7 04 2001 ( 2 4 ) 1 5 05 2003 О 00 ^со (О ю 56348 середовищах (МПБ, 10% екстракт пшеничних висівок, 5% екстракт вівсяних пластівців) бактерії утворюють щільну поверхневу плівку Оптимальні умови вирощування - температура 37°, рН середовища 6,5-8,5 Фізюлого-бюхімічні властивості Аероб Гідролізує крохмал, зменшує в'язкість желатини, розкладає казеїн, утворює кислоту з глюкози Генетичні особливості штама (ауксотрофність) - неауксотрофний Даний штам продукує комплекс цитотоксичних пектинів та протеаз Культуральна рідина має вибіркову антимікробну активність тільки у відношенні до Вас megatenum H, якій властива антигенна схожість з пухлинними клітинами, та протипухлинну цитотоксичну і цитолітичну активніть по відношенню до пухлинних клітин різного гістогенезу (саркома 37, аденокарцинома Ерліха, лімфома NK/Ly, лімфосаркома ОН-2, плазмоцитома ОН-3, карцинома Л'юіс) Ефективність процесів бактеріального біосинтезу залежить від багатьох причин Суттєво впливають різні фактори зовнішнього середовища та умови культивування Під впливом різних умов вирощування одна і та ж бактеріальна культура може повністю припинити утворення тих чи інших біологічно активних речовин і навпаки - одночасно продукувати різні сполуки До ЗОВНІШНІХ факторів, що впливають на бюсинтетичну активність бактерій, відносяться склад поживного середовища, природа і концентрація джерел вуглецю і азоту, рН середовища, а також способи ведення процесу культивування Для відпрацювання режиму культивування Вас subtihs 1 MB B-7025 ми використали загальноприйняте стандартне середовище - м'ясо-пептонний бульон (МПБ) Суттєвий вплив на біосинтез цитотоксичних речовин чинить вік і КІЛЬКІСТЬ посівного матеріалу Для засіву живильного середовища МПБ використовували вегетативні (20-24-годинні) форми культури, попередньо вирощені в стаціонарних умовах при 37°С Одержану культуру вносили в середовище для культивування в КІЛЬКОСТІ ВІД 1,5 до 15% (об'ємних) і визначали в динаміці інтенсивність накопичення синтезуємих цитотоксичних речовин 3 одержаних даних було встановлено, що максимальний біосинтез цитотоксичних речовин продуцентом спостерігався при використанні 7-10% посівного матеріалу При вирощуванні штаму Вас subtihs 1MB В7025 в стаціонарних умовах в термостаті оптимальні параметри біосинтезу цитотоксичних речовин були майже такими, як і в умовах періодичного культивування з тією тільки різницею, що ріст і розвиток продуценту в термостаті, тобто накопичення активних речовин, подовжувалось в часовому проміжку В подальших дослідженнях нами було встановлено, що цитотоксична дія культуральної рідини Вас subtihs 1 MB B-7025 на пухлинні клітини складається з двох етапів на першому етапі інкубації - пухлинні клітини аглютинуються, утворюючи конгломерати клітин, на другому - при більш тривалій інкубації відбувається лізис пухлинних клітин Це може свідчити про те, що культуральна рідина має як аглютинуючу, так і ферментативну активність, в даному випадку протеолітичну, тобто є біфункцюнальною або містить, як мінімум, дві речовини з різною біологічною активністю Виходячи з цього, для культивування даного штаму нами були досліджені поживні середовища, оптимізовані для синтезу пектинів напівсинтетичне середовище Гаузе, і середовище на основі пшеничних висівок - 10% екстракт, яке використовують для біосинтезу протеолітичних ферментів В процесі росту Вас subtihs 1MB В-7025 на досліджуваних живильних середовищах вивчали гемаглютинуючу активність (ГАА) культуральної рідини на еритроцитах кролика [4] і цитотоксичну активність in vitro на асцитних клітинах саркоми 37 та аденокарциноми Ерліха [5] Порівняльне вивчення динаміки накопичення цитотоксичних речовин в культуральній рідині Вас subtihs 1MB В-7025 показало, що вони синтезуються на всіх досліджуваних середовищах Пік цитотоксичної дії на пухлинні клітини культуральної рідини бактерій, які вирощені на всіх трьох поживних середовищах ( МПБ, Гаузе і 10% екстракт пшеничних висівок), спостерігаємо на 5-7 добу росту культури, однак кількісне співвідношення синтезуємих цитотоксичних речовин, а можливо і їх природа, різні Суть винаходу підтверджують приклади (1,2), таблиці (1-3) і рисунки (1,2) Приклад 1 Культуральна рідина бактерій, культивованих на МПБ і середовищі Гаузе, в перші 10-15 хвилин інкубації з пухлинними клітинами аглютинувала 90-100% їх, а в КІНЦІ інкубації викликала повний або частковий лізис пухлинних клітин (табл 1,2) Для дослідження гемаглютинуючих властивостей культуральної рідини використовували реакцію гемаглютинації, в основі якої лежить специфічне зв'язування пектинів з розміщеними на поверхні еритроцитів вуглеводами і виражали як титр 1 РГА(рис1,2) На рис 1 та 2 показана порівняльна характеристика пектинової активності культуральної рідини прототипу - штаму Вас subtihs 668 1MB та заявляемого штаму Вас subtihs 1MB В-7025 Як бачимо з наведених графіків, ГАА культуральної рідини заявляемого штаму була в 2 рази вищою у порівнянні з ГАА культуральної рідини штаму прототипу Приклад 2 Культуральна рідина бактерій, які вирощували на 10% екстракті пшеничних висівок, проявляла 100%-ну лізуючу дію на пухлинні клітини при повній відсутності аглютинуючої активності по відношенню до останніх (табл 3) Це пов'язано з синтезом на даному середовищі окрім цитотоксичних речовин з пектиновою активністю, також речовин з протеолітичною активністю Підтвердженням цього є наявність в культуральній рідині загальної протеолітичної 56348 активності, виявленої електрофоретичне з використанням желатини в якості субстрату [6] Таблиця 1 Цитотоксична та аглютинуюча активність культуральної рідини Вас subtihs 1 MB В-7025 при культивуванні на середовищі МП Доба 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Культуральна рідина нативна 12 нативна 12 нативна 12 нативна 12 нативна 12 нативна 12 нативна 12 нативна 12 нативна 12 нативна 12 КІЛЬКІСТЬ пухлинних клітин (%) девіталізо-ваних лізованих аглютинованих 0 0 0 0 0 0 60 0 60 ЗО 0 10 100 40 90 40 0 40 100 50 98 45 0 55 100 100 100 90 40 60 100 100 100 90 90 85 100 100 100 100 80 90 100 100 100 70 40 90 100 100 98 50 50 85 100 100 95 70 50 80 Таблиця 2 Цитотоксична та аглютинуюча активність культуральної рідини Вас subtihs 1 MB В-7025 при культивуванні на середовищі Гаузе Доба 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Культуральна рідина нативна 12 нативна 12 нативна 12 нативна 12 нативна 12 нативна 12 нативна 12 нативна 12 нативна 12 нативна 12 КІЛЬКІСТЬ пухлинних клітин (%) девіталізо-ваних лізованих аглютинованих 0 0 40 0 0 0 0 0 70 0 0 20 98 45 98 15 0 45 100 100 100 15 10 40 100 100 100 20 20 60 100 100 100 20 20 70 100 100 100 ЗО ЗО 90 100 100 98 20 20 90 100 100 98 15 15 85 100 100 95 10 10 80 56348 Таблиця З Цитотоксична та аглютинуюча активність культуральної рідини Вас subtihs 1MB В-7025 при культивуванні на 10% екстракті пшеничних висівок Доба 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Культуральна рідина нативна 12 нативна 12 нативна 12 нативна 12 нативна 12 нативна 12 нативна 12 нативна 12 нативна 12 нативна 12 КІЛЬКІСТЬ пухлинних клітин (%) девіталізо-ваних лізованих аглютинованих 0 0 0 0 0 0 95 85 0 10 20 0 100 100 0 95 20 0 100 100 0 98 ЗО 0 100 100 0 100 35 0 100 100 0 100 80 0 100 100 0 100 60 0 100 60 0 100 15 0 100 60 0 70 10 0 65 60 0 50 10 0 Таким чином, заявляємий штам Вас subtihs 1MB В-7025 продукує цитотоксичні протипухлинні речовини при використанні всіх досліджуваних поживних середовищ (МПБ, Гаузе, 10% екстракт пшеничних висівок) Це свідчить проте, що штам не вимогливий до поживних речовин, необхідних для біосинтезу біологічно активних речовин, що дає можливість використовувати доступні і дешеві поживні середовища Культуральна рідина штаму має біфункцюнальну активність аглютинуючу та ферментативну по відношенню до пухлинних клітин При вирощуванні штаму на середовищах МПБ і Гаузе культуральна рідина аглютиновала 90-100% пухлинних клітин ( що було пов'язано з синтезом на даних середовищах цитотоксичних речовин з пектиновою активністю) і проявляла 100% лізуючу дію на пухлинні клітини при культивуванні штаму на 10% екстракті пшеничних висівок (що пов'язано з синтезом на даному середовищі цитотоксичних речовин з протеолітичною активністю) Гемаглютинуюча активність культуральної рідини заявляемого штаму була в 2 рази вищою у порівнянні з гемаглютинуючою активністю культуральної рідини штаму прототипу Отже заявляємий штам Вас subtihs 1MB В 7025 є більш ефективним відносно синтезу продукуванню протипухлинних цитотоксичних речовин в порівнянні з прототипом Використані джерела 1 Коваленко ЕО Позаклітинні лектини бактерій роду Bacillus Дис докт бюл наук, Київ, 1999 2 Welchinskaya HV, Kuzmenko II, Kudryavtseva IG, et al New molecular complexes of heterocychc bis-adducts with bacterial lectms synthesis and structure-activity relationship studies IntJ.Biol MacromoL4999,26(4), p243-8 3 Bergey's manual of determinative bacteriology - Edition 8-th/ Ed Buchanan PE, Gibbons KE - Baltimore, Williams SWilkms, 1974 1268p 4 Луцик M Д, Панасюк EH, Луцик А Д Лектины Львов Вища школа, 1981 155с 5 Айзенман Б Е, Мандрик Т П, Швайгер М О Быстрый метод выявления in vitro поврежденных и мертвых клеток карциноми Эрлиха Антибиотики 1960, N3 97-102 6 Moll UM, Youngleib GL, Rosmsky KB, Quigley JP Tumor promoter-stimulated Mr 92000 gelatmase secreted by normal and malignant human cells Isolation and characterisation of enzyme from HT 1080 tumor cells Cancer Res 1990, 58(19) 6162-70 56348 1 1 2 2 3 2 8 4 8 2 10 44 48 Час, гсдикк Рис. 1. Динаміка виявлення лектинової активності в культуральній рідині штаму Bac.subtilis 668 1MB при вирощуванні на середовищі Гаузе (прототип). Рис.2. Динаміка виявлення лектинової активності в культуральній рідині штаму Bacsubtilis 1MB В-7025 при вирощуванні на середовищі Гаузе (заявяяємий). Підписано до друку 05 06 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24