Спосіб визначення інтенсивності поглинання мікобактерій туберкульозу адгерентними фагоцитуючими клітинами in vitro

Спосіб визначення інтенсивності поглинання мікобактерій туберкульозу адгерентними фагоцитуючими клітинами in vitro шляхом їх інкубації з нативними мікобактеріями туберкульозу, мікроскопи отриманих препаратів з підрахуванням відсотка клітин, які містять мікобактерії туберкульозу внутрішньоклітинно, який відрізняється тим, що додатково проводять інкубацію адгерентних фагоцитуючих клітин з мікобактеріями туберкульозу, попередньо опсонізованими декомплементованою та свіжою аутосироваткою, фарбування мікобактерій туберкульозу здійснюють фуксином Цилю при кімнатній температурі з подальшим дофарбовуванням адгерентних фагоцитуючих клітин діамантовим зеленим, і при отриманні показників ш тенсивності поглинання нейтрофілоцитами нативних мікобактерій туберкульозу менше 20 %, моноцитами - менше 18 %, показників інтенсивності поглинання нейтрофілоцитами мікобактерій туберкульозу, опсонізованих декомплементованою аутосироваткою менше 45 %, моноцитами - менше ЗО %, показників інтенсивності поглинання нейтрофілоцитами мікобактерій туберкульозу, опсонізованих комплементом менше 20 %, моноцитами менше 15 % відносно показників здорових осіб визначають пригнічення інтенсивності поглинання мікобактерій туберкульозу, а при отриманні показників інтенсивності поглинання нейтрофілоцитами нативних мікобактерій туберкульозу понад ЗО %, моноцитами - понад 25 %, показників інтенсивності поглинання нейтрофілоцитами мікобактерій туберкульозу, опсонізованих декомплементованою аутосироваткою, понад 55 % та моноцитами - понад 35 %, показників інтенсивності поглинання нейтрофілоцитами мікобактерій туберкульозу, опсонізованих комплементом, понад 25 % та моноцитами - понад 20 % відносно показників здорових осіб - визначають посилення інтенсивності поглинання мікобактерій туберкульозу цими адгерентними фагоцитуючими клітинами ю Винахід відноситься до галузі медицини та експериментальної біологи і може бути використаний в КЛІНІЧНІЙ практиці та експериментальних дослідженнях для визначення інтенсивності поглинання адгерентними фагоцитуючими клітинами нативних та опсонізованих мікобактерій туберкульозу in vitro з метою оцінки їх поглинальної здатності та з'ясування можливих механізмів и порушення, як першого етапу двох головних механізмів елімінації внутрішньоклітинних патогенів - фагоцитозу та апоптозу Відомий спосіб визначення інтенсивності поглинання мікобактерій туберкульозу фагоцитуючими клітинами in vitro шляхом інкубації фагоцитуючих клітин з нативними мікобактеріями, які попередньо покривають флюорохромами (флюоресцеїном, Lucifer yello або phycoerythryn), з пода льшою мікроскопією отриманих препаратів на люмінесцентному мікроскопі або обліком їх на проточному цитофлюориметрі з підрахуванням відсотку клітин, що містять мікобактерії туберкульозу внутрішньоклітинно (див Bonecim-Almeida М G Flow cytometry as a tool to identify Mycobactenum tuberculosis interaction with the immune System and drug Suscebihty // J Immunol — 2000 — V 95 (4), № 8 — P 491-494) Однак даний спосіб має такі недоліки - спосіб недостатньо точний, тому що визначають інтенсивність поглинання лише нативних мікобактерій туберкульозу, і це не відображує стан ще двох основних шляхів, якими здійснюється поглинання збудників фагоцитуючими клітинами m vivo - за участю антитіл та комплементу (тобто, опсонізованих), (О 61592 - можлива наявність спонтанної (власної) люмінесценції сироваточних факторів, яка також зменшує точність отриманих результатів, спотворення фарбування флюорохромами мікобактерій, поверхня яких при опсонізацй стає вкритою антитілами та/або комплементом, - висока вартість як устаткування, так і реактивів, що використовуються в даному способі, обмежують широке його застосування в лікувальних закладах та науково-дослідних установах нашої країни В основу винаходу поставлена задача удосконалення способу визначення інтенсивності поглинання мікобактерій туберкульозу адгерентними фагоцитуючими клітинами in vitro, в якому шляхом додаткової інкубації фагоцитуючих клітин з мікобактеріями туберкульозу, попередньо опсонізованими свіжою та декомплементованою аутосироваткою, досягається підвищення точності та зменшення вартості дослідження, що дозволяє всебічно оцінити їх поглинальну здатність та з'ясувати можливий механізм порушення останньої Поставлене завдання вирішується тим, що у способі визначення інтенсивності поглинання мікобактерій туберкульозу адгерентними фагоцитуючими клітинами in vitro шляхом їх інкубації з нативними мікобактеріями туберкульозу, мікроскопи отриманихпрепаратів з підрахуванням відсотку клітин, які містять мікобактерії туберкульозу внутрішньоклітинно, згідно з винаходом, додатково проводять інкубацію адгерентних фагоцитуючих клітин з мікобактеріями туберкульозу, попередньо опсонізованими декомплементованою та свіжою аутосироваткою, фарбування мікобактерій туберкульозу здійснюють фуксином Цилю при кімнатній температурі з подальшим дофарбовуванням адгерентних фагоцитуючих клітин діамантовим зеленим, і при отриманні показників інтенсивності поглинання нейтрофілоцитами нативних мікобактерій туберкульозу менше 20%, моноцитами - менше 18%, показників інтенсивності поглинання нейтрофілоцитами мікобактерій туберкульозу, опсонізованих декомплементованою аутосироваткою менше 45%, моноцитами - менше 30%, показників інтенсивності поглинання нейтрофілоцитами мікобактерій туберкульозу, опсонізованих комплементом менше 20%, моноцитами менше 15% відносно показників здорових осіб визначають пригнічення інтенсивності поглинання мікобактерій туберкульозу, а при отриманні показників інтенсивності поглинання нейтрофілоцитами нативних мікобактерій туберкульозу понад 30%, моноцитами - понад 25%, показників інтенсивності поглинання нейтрофілоцитами мікобактерій туберкульозу, опсонізованих декомплементованою аутосироваткою, понад 55% та моноцитами - понад 35%, показників інтенсивності поглинання нейтрофілоцитами мікобактерій туберкульозу, опсонізованих комплементом, понад 25% та моноцитами понад 20% відносно показників здорових осіб визначають посилення інтенсивності поглинання мікобактерій туберкульозу цими адгерентними фагоцитуючими клітинами Відомо, ЩО проникнення мікобактерій туберкульозу (МВТ) в нейтрофілоцити, моноцити та макрофаги відбувається за рахунок активного їх по глинання цими фагоцитуючими клітинами за участю різних рецепторних структур, розташованих на їх поверхні та гуморальних факторів - ОПСОНІНІВ, до яких відносяться антитіла та компоненти комплементу Так, поглинання нативних мікобактерій здійснюється через манозні рецептори фагоцитуючих клітин і відноситься до уроджених механізмів природного протитуберкульозного імунітету Його стимуляція свідчить про посилення експресії манозних рецепторів фагоцитуючими клітинами, а пригнічення цієї функції може мати місце як при зменшенні експресії цих рецепторів, так і при блокуванні їх сироваточними факторами (наприклад, специфічними антиманозними антитілами, або циркулюючими імунними комплексами, або антигенами МБТ при антигенемм) Поглинання мікобактерій, опсонізованих протитуберкульозними антитілами, здійснюється через рецептори до Fcфрагменту Ig G, і характеризує у осіб, старших 0,51,5 року, набутий специфічний протитуберкульозний імунітет (у немовлят перших 6 МІСЯЦІВ життя материнський) Його інтенсивність залежить ВІД ЩІЛЬНОСТІ експресії цих рецепторів на поверхневій мембрані клітин, вмісту протитуберкульозних антитіл в сироватці крові та наявності в ній блокуючих факторів, наприклад, циркулюючих імунних комплексів Поглинання мікобактерій туберкульозу, опсонізованих компонентами комплементу, здійснюється через рецептори до компонентів комплементу, які у людини з'являються через 2 тижні після народження Воно характеризує набутий природний неспецифічний механізм протитуберкульозного захисту Таким чином, інтенсивність поглинання МБТ, яке in vivo реалізується усіма трьома автономними механізмами, залежить як від функціонального стану самої фагоцитуючої клітини (тобто експресії на и поверхні ВІДПОВІДНИХ рецепторів до Fcфрагменту Ig G, до компонентів комплементу типів 1 (CR1), З (CR3), 4(CR4) та манозних), так і від якості опсонізацм, порушення якої можуть бути обумовлені низьким вмістом антитіл внаслідок гальмування антитілоутворення та/або низьким рівнем комплементу чи його окремих компонентів в сироватці крові Пригнічення поглинання МБТ також може бути обумовлено присутністю в сироватці крові факторів, що блокують ВІДПОВІДНІ мембранні рецептори клітин Тому одночасне визначення інтенсивності поглинання і нативних мікобактерій, і мікобактерій, опсонізованих декомплементованою та свіжою аутосироваткою, поперше, дозволяє підвищити точність визначення здатності фагоцитуючої клітини до поглинання даного патогену за рахунок оцінки активності не лише одного з шляхів реалізації цієї функції, але й двох інших основних шляхів - за участю антитіл та комплементу, і по-друге, дозволяє визначити ймовірний механізм порушення цієї функції, яке перш за все буде проявлятисязниженням ВІДПОВІДНОГО показника Здійснення фарбування МБТ фуксином Пилю при кімнатній температурі перешкоджає злущуванню фагоцитів з предметного скельця, а дофарбовування клітин саме діамантовим зеленим створює контрастний фон, який дозволяє добре бачити малинові МБТ, що містяться внутрішньоклітинно 61592 Спосіб здійснюють таким чином З гепаринізованої крові хворого (2мл) на одинарному (1,078) чи подвійному (1,090 та 1,078) градієнті ЩІЛЬНОСТІ виділяють популяції нейтрофілоцитів та моноцитів, їх моношар отримують шляхом адгеренцм до скла - інкубацією 50мкл суспензії цих фагоцитуючих клітин в робочій концентрації 6 10 мл в 3-х лунках предметних скелець діаметром 5мм у вологій камері при температурі 37°С протягом 10-15 хвилин (для нейтрофілоцитів) та 60 хвилин (для моноцитів), та наступного відмивання препаратів в фосфатному буфері (рН-7,2) З сухої культури МБТ (живої або вбитої) готують робочу суспензію нативних мікобактерій (ЮОмкг на 1мл поживного середовища 199 або розчину Хенксу) та суспензію МБТ, опсонізованих декомплементованою та свіжої аутосироваткою Для опсонізацм по ЮОмкл суспензії МБТ в концентрації 1000мкг/мл вміщують в 2 пробірки, в першу додають ЮОмкл аутосироватки, прогрітої ЗО хвилин на водяній бані при температурі 56°С (тобто декомплементованої), в другу - ЮОмкл свіжої аутосироватки, шкубують протягом 60 хвилин при 37°С при постійному (кожні 10 хвилин) перемішуванні Після завершення опсонізацм доводять суспензію мікобактерій поживним середовищем до робочої концентрації ЮОмкг/мл В лунки предметних скелець з моношаром адгерентних фагоцитуючих клітин вміщують по 50мкл суспензії нативних та опсонізовованих МБТ, ВІДПОВІДНО, та шкубують у вологій камері 60 хвилин при 37°С, після чого скельця промивають ДВІЧІ В фосфатному буфері, висушують, фіксують додаванням 50мкл метанолу Фарбування отриманих в лунках скелець препаратів здійснюється в 2 етапи на першому протягом 4 хвилин карболовим фуксином Циля, розведеним у 10 разів, фарбують мікобактерії, скельця промивають водою та 96° етанолом і висушують На другому етапі протягом 4 хвилин діамантовим зеленим дофарбовують фагоцитуючі клітини з подальшим промиванням у воді, етанолі, воді Після остаточного висушування препаратів здійснюють їх мікроскопію під масляною імерсією на світловому мікроскопі (при збільшенні х 500-х 900), підраховують відсоток клітин, які містять внутрішньоклітинно нативні МБТ (показник інтенсивності поглинання нативних мікобактерій туберкульозу), відсоток клітин, які містять МБТ, опсонізовані декомплементованою аутосироваткою (показник інтенсивності поглинання МБТ, опсонізованих антитілами) та відсоток клітин, які містять внутрішньоклітинно МБТ, опсонізовані свіжою аутосироваткою, після чого розраховують показник інтенсивності поглинання МБТ, опсонізованих комплементом, який дорівнює різниці між двома останніми показниками І при отриманні показників інтенсивності поглинання неитрофілоцитами нативних мікобактерій туберкульозу менше 20%, моноцитами - менше 18%, показників інтенсивності поглинання неитрофілоцитами мікобактерій туберкульозу, опсонізованих декомплементованою аутосироваткою менше 45%, моноцитами - менше 30%, показників інтенсивності поглинання неитрофілоцитами мікобактерій туберкульозу, опсонізованих комплементом менше 20%, моноцитами менше 15% відносно показників здорових осіб визначають пригнічення інтенсивності поглинання мікобактерій туберкульозу, а при отриманні показників інтенсивності поглинання неитрофілоцитами нативних мікобактерій туберкульозу понад 30%, моноцитами - понад 25%, показників інтенсивності поглинання неитрофілоцитами мікобактерій туберкульозу, опсонізованих декомплементованою аутосироваткою понад 55% та моноцитами - понад 35%, показників інтенсивності поглинання неитрофілоцитами мікобактерій туберкульозу, э опсонізованих комплементом понад 25% та моноцитами - понад 20% відносно показників здорових осіб визначають посилення інтенсивності поглинання мікобактерій туберкульозу цими адгерентними фагоцитуючими клітинами Наводимо конкретні приклади здійснення способу Приклад 1 Хворий Б-к П Н , історія хвороби №1843, госпіталізований у відділення фтизіатрії Інституту фтизіатрії і пульмонології з діагнозом інфільтративний туберкульоз При дослідженні інтенсивності поглинання мікобактерій туберкульозу адгерентними фагоцитуючими клітинами in vitro способом, що заявляється, було отримано такі результати дослідження показник інтенсивності поглинання неитрофілоцитами нативних МБТ становив 42%, МБТ, опсонізованих декомплементованою аутосироваткою (тобто антитілами) - 56%, МБТ, опсонізованих свіжою аутосироваткою, 75%, показник інтенсивності поглинання неитрофілоцитами МБТ, опсонізованих комплементом, дорівнював 19% (75%-56%=19%), ЩО СВІДЧИТЬ про посилення інтенсивності поглинання цими фагоцитуючими клітинами нативних МБТ та пригнічення інтенсивності поглинання МБТ, опсонізованих антитілами та комплементом Показник інтенсивності поглинання моноцитами нативних МБТ склав 23%, МБТ, опсонізованих декомплементованою аутосироваткою (тобто антитілами) - 63%, показник інтенсивності поглинання моноцитами МБТ, опсонізованих свіжою аутосироваткою, - 63%, тобто, показник інтенсивності поглинання моноцитами МБТ, опсонізованих комплементом, дорівнював 0 (63%-63%=0%), Таким чином, можна зробити висновок, що у пацієнта поглинання моноцитами опсонізованих МБТ відбувається лише за участю рецепторів до Fc - фрагменту Ig G, інтенсивність якого посилена майже ВДВІЧІ, а поглинання МБТ, опсонізованих комплементом відсутнє Проведенням ВІДПОВІДНИХ імунологічних тестів було визначено дещо підвищений рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦПС) та зменшення у 4 рази вмісту комплементу в сироватці крові Проте, цієї КІЛЬКОСТІ останнього виявилося досить, щоби забезпечити опсонізацію МБТ комплементом, про що свідчить нормальний показник інтенсивності поглинання неитрофілоцитами МБТ, опсонізованих комплементом Таким чином, можна зробити висновок, що у даного пацієнта пригнічення інтенсивності поглинання моноцитами МБТ, опсонізованих комплементом, обумовлено блокуванням ЦІК моноцитарних рецепторів до компонентів комплементу Приклад 2 Хворий Ч-ка О М , історія хвороби №262, госпіталізований у відділення фтизіатрії 8 61592 Інституту фтизіатрії і пульмонології з діагнозом вогнищевий туберкульоз легень При дослідженні інтенсивності поглинання мікобактерій туберкульозу адгерентними фагоцитуючими клітинами in vitro способом, що заявляється, було отримано такі результати показник інтенсивності поглинання нейтрофілоцитами нативних МБТ склав 11%, МБТ, опсонізованих декомплементованою аутосироваткою (тобто антитілами) - 16%, показник інтенсивності поглинання МБТ, опсонізованих свіжою аутосироваткою - 76%, тобто, показник інтенсивності поглинання нейтрофілоцитами МБТ, опсонізованих комплементом, дорівнював 60% (76%16%=60%) Показник інтенсивності поглинання моноцитами нативних МБТ склав 2 1 % (норма, відносно значень цього показника здорових осіб), МБТ, опсонізованих декомплементованою аутосироваткою (антитілами) - 26%, МБТ, опсонізованих свіжою аутосироваткою, - 70%, тобто показник інтенсивності поглинання моноцитами МБТ, опсонізованих комплементом, дорівнював 44% (70%26%=44%) Таким чином, у даного пацієнта відбувається пригнічення інтенсивності поглинання нейтрофілоцитами нативних МБТ та МБТ, опсонізованих антитілами, пригнічення поглинання моноцитами МБТ, опсонізованих антитілами та посилення інтенсивності поглинання і нейтрофілоцитами, і моноцитами МБТ, опсонізованих комплементом Це було обумовлено блокуванням манознихта Fc - рецепторів фагоцитуючих клітин циркулюючими імунними комплексами, з огляду на те, що у хворого спостерігалося суттєве збільшення рівню ЦІК та зменшення експресії рецепторів до Fc-фрагменту Ig G в тесті ЕАрозеткоутворення, а титр протитуберкульозних антитіл виявився підвищеним Приклад 3 Хв-й Б-в М В, історія хвороби №168, госпіталізований у відділення фтизіатрії Інституту фтизіатрії і пульмонології з діагнозом інфільтративний туберкульоз При дослідженні інтенсивності поглинання мікобактерій туберкульозу адгерентними фагоцитуючими клітинами in vitro способом, що заявляється, були отримані такі результати показник інтенсивності поглинання нейтрофілоцитами нативних МБТ склав 46%, МБТ, опсонізованих декомплементованою аутосироваткою (антитілами) - 19%, МБТ, опсонізованих свіжою аутосироваткою - 53%, таким чином, показник інтенсивності поглинання нейтрофілоцитами МБТ, опсонізованих комплементом, становив 24% (53%19%=24%) Показник інтенсивності поглинання моноцитами нативних МБТ дорівнював 33%, МБТ, опсонізованих декомплементованою аутосироваткою (тобто антитілами), - 59%, МБТ, опсонізованих свіжою аутосироваткою - 72%, таким чином, показник інтенсивності поглинання МБТ, опсонізованих комплементом дорівнював 13% (72%-59%=13%) Отримані дані свідчить про те, що у цього хворого має місце посилення інтенсивності поглинання нейтрофілоцитами та моноцитами нативних МБТ за рахунок посилення експресії манозних рецепторів та пригнічення поглинання опсонізованих МБТ цими фагоцитуючими клітинами нейтрофілоцитами - МБТ, опсонізованих антитілами, моноцитами опсонізованих комплементом Підвищений титр протитуберкульозних антитіл та достатній вміст комплементу в сироватці крові у даного пацієнта, зростання рівнів ЦПС свідчать про те, що в даному випадку головним чинником пригнічення здатності адгерентних фагоцитуючих клітин до поглинання МБТ, було блокування циркулюючими імунними комплексами Fc-рецепторів на нейтрофілоцитах та рецепторів до компонентів комплементу на моноцитах Таблиця Показники інтенсивності поглинання нативнихта опсонізованих МБТ адгерентними фагоцитуючими клітинами in vitro у хворих на туберкульоз легень Показник інтенсивності поглинання МБТ нейтрофілоци- Показник інтенсивності поглинання МБТ моноцитами (%) тами (%) Опсонізованих Опсонізованих № Нативних Опсонізованих Опсонізованих свіжою ауто- Нативних Опсонізованих Опсонізованих свіжою аутоп/п антитілами комплементом сироваткою антитілами комплементом сироваткою mm max М m 7,0 75,0 27,6 1,0 16,0 56,0 37,6 3,4 19,0 60,0 35,5 5,0 21,0 97,0 66,7 69,0 24,0 1,5 1,1 Всього за способом, що пропонується обстежено 46 осіб - 26 хворих на туберкульоз легень та 20 здорових донорів крові В таблиці наведені мінімальні (mm) та максимальні (max) значення отриманих показників серед хворих, їх середні значення (М) та середня помилка (т) Як видно з наведених даних, показники інтенсивності поглинання адгерентними фагоцитуючими клітинами нативнихта опсонізованих МБТ, мають дуже великі індивідуальні розбіжності, що обумовлено досить великою КІЛЬКІСТЮ тих механізмів та чинників, які призводять до їх пригнічення або посилення Таким чином, інтенсивність поглинання фагоцитуючими клітинами МБТ in vitro характеризуєть 3,0 15,0 93,0 52 1 7,9 0 44,0 15,5 4,5 15,0 93,0 46,5 1,4 ся трьома показниками 1) показником інтенсивності поглинання нативних МБТ, що характеризує поглинання збудника за рахунок манозних рецепторів, 2) показником інтенсивності поглинання МБТ, опсонізованих декомплементованою аутосироваткою (тобто антитілами), який здійснюється лише за участю Fc-рецепторів, З) показником інтенсивності поглинання МБТ, опсонізованих комплементом, який здійснюється за участю комплементу та рецепторів до нього і визначається різницею між показником інтенсивності поглинання фагоцитуючими клітинами МБТ, опсонізованих свіжою та декомплементованою сироваткою Пригнічення чи посилення будь-якого з цих показників 61592 10 здатності цих клітин за рахунок додаткового видо поглинання МБТ, та вказує на ВІДПОВІДНИЙ мезначення інтенсивності поглинання МБТ, опсонізоханізм цих порушень зміну експресії ВІДПОВІДНИХ ваних антитілами та комплементом, і таким чином рецепторів фагоцитуючих клітин або їх блокування оцінити стан ще двох основних шляхів реалізації та/чи зменшення вмісту ОПСОНІНІВ (протитуберкудосліджуваної функції, які мають місце in vivo, a льозних антитіл або комплементу та його компотакож за рахунок проведення фарбування отриманентів) в сироватці крові, що може бути визначено них препаратів фуксином Цилю при кімнатній темпри проведенні ВІДПОВІДНИХ імунологічних тестів пературі, що перешкоджає злущуванню клітин з (визначення титрів протитуберкульозних антитіл, предметних скелець та зменшує, таким чином, рівня циркулюючих імунних комплексів, вмісту похибку обліку, комплементу та його окремих компонентів в сиро- визначити ймовірний механізм порушень ватці крові, визначення ЩІЛЬНОСТІ манозних рецепздатності фагоцитуючих клітин до поглинання торів та рецепторів до Fc-фрагменту Ig G і компоМБТ, нентам комплементу на поверхні фагоцитуючих - зменшити вартість дослідження та забезпеклітин) чити його доступність завдяки використанню дешевих реактивів і матеріалів та звичайного устатТаким чином, у порівнянні з прототипом, спокування сіб, що пропонується, дозволяє - ПІДВИЩИТИ точність визначення поглинальної свідчить про зміну здатності фагоцитуючих клітин Комп'ютерна верстка А Крулевський Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119