Спосіб вирощування мікобактерій туберкульозу

Спосіб вирощування мікобактерій туберкульозу шляхом обробки посівного матеріалу активатором росту та його висіву на поживне середовище, який відрізняється тим, що як стимулятор росту мікобактерій використовують активатор наступного складу, г/л сахароза ХІМІЧНО чиста 2,0 - 4,0 натрій двовуглекислий 0,08 - 0,1 спирт ректифікований 0,7 - 0,9 кальцій хлористий 0,1 -0,15 натрій піроцитрат двозамінний 0,007-0,009 глюкоза безводна 0,011 -0,014 вода дистильована до 1,0 л, а як поживне середовище використовують середовище наступного складу, г/л агар-агар 20 - 40 пептон 40 - 60 кальцій хлористий 0,1 -0,15 крохмаль картопляний 10-25 натрій двовуглекислий 1- 2 вода дистильована до 1,0 л Винахід відноситься до мікробіологи і може бути використаний в КЛІНІЧНИХ та бактеріологічних лабораторіях медичних і ветеринарних установ ВІДОМІ способи бактеріологічних досліджень на туберкульоз, які включають вирощування мікобактерій туберкульозу та згідно з якими дослідний патматеріал висівають на поживне середовище Левінштейна-Йенсена, Фінна та ряд інших («Методические указаниях по применению унифицированных микробиологических исследований при туберкулезе», п 22, с 15-20, Москва, 1978) Але такі способи забезпечують дуже повільний ріст мікобактерій (20 -90 діб), що значно знижує ефективність діагностики Окрім того, до недоліків середовища, наприклад, Левінштейна-Йенсена можна віднести і те, що в його склад входить яєчна маса, внаслідок чого термін зберігання приготовленого середовища обмежений, а саме середовище складне по набору інгредієнта та по виготовленню (протягом 3 діб) використовували в якості активатора росту мікобактерій розчин ентерохеліна У них ріст мікобактерій починався з 15-17 доби інкубації, однак для одержання остаточного результату необхідно було витримувати посіви в термостаті до 30-60 діб Завданням даного винаходу є розробка способу вирощування мікобактерій туберкульозу, який був би простим в виконанні та сприяв скороченню часу проведення бактеріологічних досліджень Поставлене завдання вирішується тим, що згідно з запропонованим способом вирощування мікобактерій туберкульозу шляхом обробки посівного матеріала активатором росту та його висіву на поживне середовище якості активатора росту мікобактерій використовують активатор наступного складу, г/л сахароза ХІМІЧНО чиста - 2,0-4,0г, натрій двохвуглекислий - 0,08-0,1 г, спирт ректифікований - 0,7-0,9г, кальцій хлористий - 0,1-0,15г, натрій піроцітрат двохзамінний - 0,007-0,0009г, глюкоза безводна - 0,011-0,014г, вода дистильована до - 1,0л , а в якості поживного середовища використовують середовище наступного складу, г/л агар-агар - ГОСТ-1628-70 - 20-40г .пептон ГОСТ-1385-60 - 40-бОг, кальцій хлористий - 0,10,1,5г, крохмаль картопляний - 10-25г, натрій двохвуглекислий - 1-2г, вода дистильована - до 1,0л ВІДОМІ також спроби різних авторів досягти прискоренного росту мікобактерій туберкульозу Так, Степанова Л А (ас СССР 566877 С 12 KI/LOO) одержувала прискорення росту мікобактерій шляхом обробки патологічного матеріалу перед посівом високочастотним електромагнітним полем, що дозволяло значно скоротити строки їх росту, але всеж результати аналізу можна було одержати не раніше, ніж за місяць, а Назарчук М І із співавторами (ас СССР, 1063836, С 12 К 1/04) Вирішення поставленого завдання ілюструється прикладами конкретного виконання Приклад 1 Активатор росту та дослідне пожи о ю 50927 вне середовище готовили з мінімальною КІЛЬКІСТЮ інгридієнтів, що заявляється Компоненти активатора росту мікобактерій розчиняли в дистильованій воді і стерилізували в автоклаві 20хв при 120*+/-1*С Інгредієнти поживного сердовища змішували із дистильованою водою і кип'ятили до повного їх розчинення, стерилізували в автоклаві 20хв при 120*+/-1*С, рН поживного середовища доводили до 7,2-7,3, потім розливали в пробірки Для перевірки ефективності способу вирощування мікобактерій використали вакцинний штам БЦЖ, музейні культури туберкульозу (штам М tuberculosis H-37Rv, M bovis шт Балле) Кожну тест-культуру обробляли стимулятором росту і витримували в термостаті 18 годин при температурі 37*С, після чого пересівали на 10 пробірок із середовищем Посіви витримували в термостаті при температурі 37±1°С і переглядали щоденно протягом 10 діб, а далі через кожні 10 діб до 3 МІСЯЦІВ після посіву Ріст тест-культур мікобактерій туберкульозу, оброблених активатором росту згідно з запропонованим способом, на поживному середовищі з мінімальним вмістом інгредієнтів спостерігався через 24-36 годин інкубації, але ріст був недостатньо активним, газонний ріст культур появлявся на 2-3 добу Приклад 2 Активаторросту та поживне середовище одержували , як в прикладі 1, але готували їх із середньою (оптимальною) КІЛЬКІСТЮ інгредієнтів активатор росту сахароза ХІМІЧНО чиста 3,0г, натрій двохвуглекислий - 0,09г, спирт ректифікований - 0,8г, кальцій хлористий - 0,12г, натрій піроцітрат двохзамінний - 0,008г .глюкоза безводна - 0,012г, вода дистильована до 1,0л .поживне середовище агар-агар - ГОСТ1628-70 - 30г, пептон - ГОСТ-1385-60 - 50г, кальцій хлористий - 0,1г, крохмаль картопляний - 12,5г, натрій двохвуглекислий - 1,5г, вода дистильована до 1,0л При використанні запропонованого авторами способу ріст колоній з'явився через 24-48 годин, а через 48-72 години спостерігався газонний ріст на всіх посівах Приклад 3 Активатор росту та поживне середовище одержували, як в прикладі 1, але готували їх із максимальною КІЛЬКІСТЮ інгредієнтів, що заявляється В процесі досліджень встановлено, що при запропонованому способу ріст мікобактерій на поживному середовищі з'являвся через 48-72 годин, але спочатку спостерігався не на всіх засіяних пробірках і лише через 72 годин з'явився на всіх «косяках», а газоний ріст відмічався через 72-96 годин В якості контролю був існуючий спосіб вирощування мікобактерій з використанням поживних середовищ Левінштейна-Йенсена та Фінна-2 На контрольному середовищі Левінштейна-Йенсена ріст тест - культур мікобактерій з'явився на 20-23 день, а на середовищі Фінна-2 - на 17-19 добу Приклад 4 Активатор росту та поживне середовище одержували , як в прикладі 1, і готовили їх із середньою (оптимальною) КІЛЬКІСТЮ інгредієнтів Посівним матеріалом були мокрота (харкотиння), в якій при мікроскопи спостерігали мікобактерії туберкульозу та кров хворих Мокроту обробляли 10% фосфорнокислим натрієм, витримували 18 годин, центрифугували, осад промивали фізрозчином, центрифугували, до осаду додавали 1,5-2мл активатора росту мікобактерій, ретельно змішували, витримували 18-24 години в термостаті при температурі 37*С, після чого висівали на пробірки з поживним середовищем згідно з винаходом Стерильно взяту кров висівали без обробки інгібітором До неї добавляли рівну КІЛЬКІСТЬ активатора росту, витримували в 18-24 годин в термостаті і висівали на дослідне середовище Для контролю харкотиння і кров висівали від цих же хворих по існуючому способі на середовища Левінштейна-Йенсена та Фінна-2 Для досліджень використали матеріал від 10 хворих Використовуючи спосіб, що заявляється, отримали ріст мікобактерій на 1-4 добу в усіх висіяних зразках крові та мокроти На контрольних середовищах, з використанням відомого способу вирощування мікобактерій, ріст мікобактерій спостерігався лише при ПОСІВІ мокроти і не з усіх посіяних проб на середовищі Левінштейна-Йенсена- в 7 на 20-40 добу, а на середовищі Фінна-2 - в 8 на 18-30 день Таким чином, запропонований спосіб вирощування мікобактерій туберкульозу дозволяє одержати ріст мікобактерій (тест-культури) на 2-3 добу, а із нативного матеріалу - на 3-5 день, в той час як при використані відомого способу для цього потрібно 17-90 діб Спосіб, який заявляється, простий у використані, компоненти, які в ньому використовуються у винаході, виготовляються на Україні, вони дешеві і не дефіцитні ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71