Спосіб визначення активності гепаринів

1. Спосіб визначення активності гепаринів, який відрізняється тим, що визначають як антикоагулянтну активність нефракціонованого, так і анти-Ха-факторну активність низькомолекулярного гепарину, застосовуючи лише один реагент - калібрований протаміну сульфат, за стандартними зразками нефракціонованого та/або низькомолекулярного гепаринів. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що антикоагулянтну активність нефракціонованого гепа 3 Для визначення антикоагулянтної активності НГ, найбільш близьким до корисної моделі, що заявляється, за технічною суттю і результатом, що досягається, є спосіб визначення антикоагулянтної активності гепарину за умов зсідання плазми крові в присутності іонів кальцію [7]. Основні стадії методу: забір крові (бичачої чи овечої), отримання плазми крові, стандартизація плазми крові за концентрацією іонів кальцію, що необхідно для отримання певного часу зсідання, підбір концентрації стандартного зразку гепарину, яка б інгібувала зсідання плазми в присутності іонів кальцію та проведення порівняльного аналізу гепарину з невідомою активністю в порівнянні зі стандартним зразком гепарину. Недоліком даного методу є його трудоємкість, використання крові тварин, тривалий час виконання аналізу (4 год.) та візуальна фіксація результатів досліджень. Для визначення анти-Ха-факторної активності НМГ в медичній практиці використовують оптичні, електрохімічні та коагулогічні методи [8-10], проте ці методи потребують використання багатокомпонентних систем та спеціального обладнання. Для визначення анти-Ха-факторної активності НМГ найближчим рішенням за технічною суттю до способу, що заявляється, є спосіб визначення анти-Ха-факторної активності НМГ, який базується на використанні хромогенних субстратів [11]. Принцип методу: анти-Ха-факторну активність гепарину визначають шляхом додавання в інкубаційне середовище надлишку антитромбіну III і фактора Ха. При цьому відбувається інгібування фактора Ха комплексом [антитромбін III - гепарин] пропорційно до кількості гепарину у зразку. Кількість фактора Ха, яка залишилась, каталізує відщеплення р-нітроаніліну (pNA) від синтетичного хромогенного субстрату. Абсорбція вільного pNA, яка визначається при довжині хвилі 405 нм, обернено пропорційна активності гепарину у зразку. Недоліком способу є потреба в спеціальному обладнанні, дорогих реактивах та витратних матеріалах. В основу корисної моделі, що заявляється, поставлена задача створення високочутливого, простого у виконанні автоматичного способу визначення антикоагулянтної активності НГ та анти-Хафакторної активності НМГ з використанням однієї речовини як реагенту. Поставлена задача вирішується шляхом використання низькомолекулярного білка - протаміну сульфату з молекулярною масою близько 4300 Да, який виділяють із сперми різних видів лососевих риб. Відомо, що протамін сульфат нейтралізує дію гепарину за рахунок утворення стабільних комплексів, через що зникає здатність гепарину гальмувати зсідання крові in vivo. Комплексоутворення обумовлено великою кількістю катіонних груп (аргініну) в протаміну сульфаті, які зв'язуються з аніонними центрами гепарину. Спосіб, що заявляється, здійснюють наступним чином. Протамін сульфат, який містить не менше, ніж 70 % моль аргініну і має залишкову протеолітичну активність не більшу, ніж 0,01 абс. од., калібрують стандартними зразками НГ (heparin sodium BRP) і НМГ (heparin low 63325 4 molecular-mass for assay BRP) [12]. Для цього розчини протаміну сульфату титрують розчинами стандартних зразків гепаринів (НГ і НМГ) на автоматичному титраторі за допомогою фототроду при довжині хвилі 555 нм до точки еквівалентності. Калібрований таким чином протаміну сульфат використовують для титрування розчинів гепаринів із невідомою активністю для визначення анти-Хафакторної активності НМГ і антикоагулянтної активності НГ. Калібрування протаміну сульфату стандартними зразками НГ та НМГ проводять один раз і зберігають його при температурі -20 °C протягом 2-х років. Вирішення поставленої задачі ілюструють приклади конкретного виконання. Приклад 1. Калібрування протаміну сульфату стандартними зразками НГ і НМГ. По 50 мл розчинів протаміну сульфату в концентраціях 0,15; 0,10; 0,05 мг/мл відповідно титрують розчином стандартного зразку НГ (heparin sodium BRP) у концентрації 50 МО/мл. За об'ємом розчину стандартного зразку гепарину, що був використаний на титрування протаміну сульфату, визначають антикоагулянтну активність останнього та виражають її в гепаринових міжнародних одиницях активності (МО). Активність протаміну сульфату за стандартним зразком НГ складає 137 МО/мг. По 50 мл розчинів протаміну сульфату в концентраціях 0,15; 0,10; 0,05 мг/мл відповідно титрують розчином стандартного зразку НМГ (heparin low-molecular-mass for assay BRP) з відомою антиХа-факторною активністю в концентрації 50 МО/мл. За об'ємом розчину стандартного зразку НМГ, що був використаний на титрування розчинів протаміну сульфату, визначають анти-Хафакторну активність останнього, яку виражають в гепаринових міжнародних одиницях активності. Активність протаміну сульфату за стандартним зразком НМГ складає 74,44 МО/мл. Приклад 2. Визначення активності субстанції та готової лікарської форми НГ. Наважку субстанції НГ для ін'єкцій масою 16,97 мг розчиняють в 100 мл води, відбирають 20 мл отриманого розчину та доводять водою до 200 мл; наважку каліброваного протаміну сульфату масою 18,96 мг розчиняють у 100 мл води. Розчин субстанції НГ з невідомою активністю об'ємом 50 мл титрують розчином протаміну сульфату. Об'єм розчину протаміну сульфату, що був використаний для трьох визначень антикоагулянтної активності нефракціонованого гепарину, становить 5,875±0,017 мл. Активність субстанції НГ розраховують за формулою: Мп  Ап  Vп  100  200 A СНГ   (1) 100  Мг  20  50  179,8 МО/мг, де: АС-НГ - активність субстанції НГ, МО/мг; МП - маса наважки каліброваного протаміну сульфату, мг; 5 АП - активність каліброваного протаміну сульфату, МО/мг; VП - об'єм розчину каліброваного протаміну сульфату, який пішов на титрування 50 мл розчину субстанції НГ з невідомою активністю, мл. МГ - маса наважки субстанції НГ, мг 1 мл готової лікарської форми (ГЛФ) НГ доводять водою до 100 мл. 10 мл отриманого розчину доводять водою до 200 мл. 50 мл цього розчину титрують розчином каліброваного протаміну сульфату (див. як для субстанції). Об'єм розчину каліброваного протаміну сульфату, що був використаний для трьох визначень активності становить 5,141±0,028 мл. Активність ГЛФ НГ, розраховують за формулою: Мп  Ап  Vп  100  200 AГЛФ НГ   (2) 100  Vг  10  50  5341МО / мл, де: АГЛФ-НГ - активність ГЛФ НГ, МО/мл; МП - маса наважки каліброваного протаміну сульфату, мг; АП - активність каліброваного протаміну сульфату, МО/мг; VП - об'єм розчину каліброваного протаміну сульфату, який пішов на титрування 50 мл розчину ГЛФ НГ з невідомою активністю, мл. VГ - об'єм ГЛФ НГ, мл. Для порівняння одержаних результатів з прототипом проводять визначення антикоагулянтної активності субстанції НГ та ГЛФ НГ за [7] з використанням крові тварин. Інгібування зсідання плазми крові проводять у діапазоні концентрацій від 0,25 до 3,0 МО/мл в дослідному та стандартному зразках НГ. Антикоагулянтна активність за [7] для субстанції НГ складає 182 МО/мл, для ГЛФ НГ 5250 МО/мл. Приклад 3. Визначення анти-Ха-факторної активності субстанції НМГ та ГЛФ НМГ. 13,9 мг субстанції НМГ розчиняють у 200 мл води, по 50 мл отриманого розчину титрують розчином каліброваного протаміну сульфату за стан 63325 6 дартом НМГ (37,28 мг каліброваного протаміну сульфату розчиняють в 100 мл води) (див. приклад 1). Об'єм розчину протаміну сульфату, що був використаний для трьох визначень анти-Хафакторної активності субстанції НМГ, становить 11,372±0,007 мл. Активність субстанції складає 90,82 МО/мг. 0,5 мл ГЛФ НМГ доводять водою до 100 мл, 10 мл отриманого розчину доводять водою до 200 мл, по 50 мл одержаного розчину титрують розчином каліброваного протаміну сульфату (67,78 мг каліброваного протаміну сульфату розчиняють в 200 мл води). Анти-Ха-факторна активність ГЛФ НМГ складає 10000,3 МО/мл. Для порівняння з найближчим аналогом антиХа-факторну активність субстанції НМГ та ГЛФ НМГ визначають за [11] з використанням хромогенного субстрату, N-а-бензилоксикарбоксил-Dаргініл-L-гліцил-L-аргінін-4-нітроанілід дигідрохлориду, антитромбіну III, фактора Ха, дослідних і стандартних зразків у діапазоні концентрацій від 0,025 до 0,200 МО/мл анти-Ха-факторної активності. Анти-Ха-факторна активність субстанції НМГ становить 92,3 МО/мл, ГЛФ НМГ - 10080 МО/мл. Приклад 4. Валідація методу за критеріями "точність визначення" та "лінійність". Валідацію методу за критерієм "точність визначення" проводять для визначення анти-Хафакторної активності ГЛФ НМГ. Використовують 6 зразків ГЛФ НМГ однієї серії. Зазначена активність комерційного препарату ГЛФ НМГ складає 10000 МО/мл та може бути в діапазоні від 90 % до 110 % зазначеної активності. Із кожного зразка готують розчини за наступною схемою: 0,5 мл препарату доводять водою до 100 мл, 10 мл отриманого розчину розбавляють водою до 200 мл. Наважку протаміну сульфату масою 67,78 мг розчиняють в 200 мл води і титрують 6 приготовлених зразків ГЛФ НМГ в трьох повторностях. Отримані результати наведені в табл. 1. Таблиця 1 Валідація способу, що заявляється, за критерієм "точність визначення", n=3 для кожного зразка Номер зразка 1 2 3 4 5 6 Об'єм каліброваного розчину протаміну сульфату, мл 4,955±0,001 4,954±0,000 4,954±0,000 4,953±0,0003 4,935±0,024 4,958±0,005 Відносне стандартне відхилення для анти-Хафакторної активності ГЛФ НМГ складає ±0,17 %. Валідацію методу за критерієм "лінійність" проводять для визначення антикоагулянтної активності субстанції НГ в діапазоні концентрацій від 10,250 мкг/мл до 86,600 мкг/мл. Активність ГЛФ НМГ, МО/мл 10000,3 9998,2 9998,2 9996,2 9959,9 10008,3. Розчини субстанції НГ концентрацій 86,600,51,960,32,475,21,050 та 10,250 мкг/мл титрують відповідно розчином каліброваного протаміну сульфату (92,2 мг каліброваного протаміну сульфату на 250 мл води). Активність гепарину розраховують за методом, як описано в приклад 2, 7 формула (1) для кожної взятої концентрації. Ре 63325 8 зультати представлені в табл. 2 та на рисунку. Таблиця 2 Валідація способу, що заявляється, за критерієм "лінійність" для визначення антикоагулянтної активності субстанції НГ, n=3. Номер Концентрація дослідного розчи- Об'єм каліброваного розчину Активність субстанції НГ, МО/мл зразка ну субстанції НГ, мкг/мл протаміну сульфату, мл 1 10,250 1,926±0,003 176,15 2 21,050 3,756±0,002 175,30 3 32,475 5,680±0,001 177,04 4 51,960 9,012±0,001 175,56 5 86,600 14,856±0,0015 173,65 Активність субстанції НГ, визначена за [7], складає 175 МО/мг. 2 Коефіцієнт кореляції R залежності кількості протаміну сульфату від концентрації субстанції НГ складає 0,9999 (фіг.). Приклад 5. Умови визначення антикоагулянтної активності субстанції НГ такі ж, як в прикладі 4 для цього ж зразка за виключенням вихідної концентрації дослідних розчинів субстанції НГ та концентрації каліброваного протаміну сульфату. 17,35 мг гепарину розчиняють в 200 мл води, відбирають 100 мл отриманого розчину, доводять водою до 1000 мл; наважку каліброваного зразку протаміну сульфату масою 7,58 мг розчиняють в 200 мл води, титрують розчини субстанції НГ з невідомою активністю, розраховують його активність та визначають відносне стандартне відхилення, яке становить ±8,5 %. Таким чином, спосіб, що заявляється, дозволяє визначати антикоагулянтну активність НГ і анти-Ха-факторну активність НМГ, як субстанцій, так і ГЛФ, та має ряд переваг порівняно з найближчими аналогами (приклади 1-4), а саме: - дозволяє автоматично з високою точністю визначати об'єм розчину каліброваного протаміну сульфату, витраченого на титрування розчинів НГ та НМГ з невідомою активністю; - дозволяє швидко (протягом 10 хв. визначати антикоагулянтну активність НГ та анти-Хафакторну активність НМГ, використовуючи лише один реагент (протаміну сульфат) порівняно з найближчим аналогами, де для визначення антикоагулянтної активності НГ використовують кров тварин та декілька реагентів, а для визначення анти-Ха-факторної активності НМГ використовують реагенти високої вартості: (хромогенний суб страт, антитромбмін III, фактор Ха та спеціальне устаткування); - є простим і зручним у виконанні та не трудоємким; - дає можливість визначати антикоагулянтну активність НГ та анти-Ха-факторну активність НМГ для широкого діапазону значень вихідної концентрації НГ та/або НМГ. Спосіб, що заявляється, знаходить застосування для контролю якості субстанцій та ГЛФ як НГ, так і НМГ, та для контролю очистки устаткування при їх виробництві. Джерела інформації: 1. Вестник Нижегородскго университета им. Н.И. Лобачевского. - 2001. - № 1, біологія. - С. 128133. 2. Зубаиров Д.М. Молекулярные основы свертывания крови и тромбообразования. - Казань. 2000. - С. 230-240. 3.Samma H., Wajman A. Les nouvelles heparin de faible masse moleculaire // Coeur. - 1988. - 19. Р. 42-48. 4. Гепарин-тест, "Ольвекс Диагностикум", кат. № 006, Росія. 5. АПТВ/АЧТВ-тест, "Ольвекс Диагностикум", кат. № 152, Росія. 6.Pat. US6140062, Oct.31.2000. 7.European Pharmacopoeia 6,0,2.7.5. Assay of heparin.01/2008:20705. 8.Pat.US 20090236238, A1, Sept. 24, 2009. 9. Реахром-гепарин "Ренам", код ГП-1, Росія. 10. Реаклот-гепарин "Ренам", код ГП-2, Росія. 11. Europen Pharmacopoeia 6,0, "Heparins,LowMolecular-Mass", 01/2008:0828. - p.2041-2043. 12. European Pharmacopoeia 6,0, Protamine sulphate, 01/2008:0569, p.2780-2781. 9 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська 63325 Підписне 10 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601