Спосіб одержання комплексу біологічно активних речовин з гепатопротекторною, анальгетичною активністю та регенеруючою дією на підшлункову залозу

Спосіб одержання комплексу біологічно активних речовин з гепатопротекторною, анальгетич 3 63766 Недоліком відомого способу за прототипом можна вважати недостатньо високий вихід готового продукту та відсутність у одержаного засобу гепатопротекторної активності та регенеруючої дії на підшлункову залозу. Задачею корисної моделі є створення способу одержання комплексу біологічно активних речовин (БАР) з гепатопротекторною, анальгетичною активністю та регенеруючою дією на підшлункову залозу, який завдяки використанню в якості сировини трави сочевиці харчової і проведення процесу при заданих параметрах забезпечує одержання ефективного засобу у формі сухого рослинного екстракту з вираженою фармакологічною активністю, обумовленою комплексом біологічно активних речовин, вилучених саме таким способом, а заявлений спосіб є простим і економічно доцільним при промисловому здійсненні. Поставлена задача вирішується таким чином, що у способі одержання комплексу біологічно активних речовин з гепатопротекторною, анальгетичною активністю та регенеруючою дією на підшлункову залозу шляхом трикратної екстракції подрібненої рослинної сировини водою при температурі 95-100 °С з подальшим об'єднанням відфільтрованих екстрактів, їх упарюванням та сушінням, згідно з корисною моделлю передбачено, що як рослинну сировину використовують траву сочевиці харчової (Lens culinaris M.), першу екст 4 ракцію здійснюють при співвідношенні сировина: екстрагент 1:10 протягом 2-х годин, а другу і третю - при співвідношенні 1:9 протягом 1 години. Всі параметри заявленого способу визначено експериментальним шляхом з урахуванням біологічної активності одержаних комплексів, ефективності, доступності та нешкідливості реактивів, практичного відтворення способу у промислових умовах. Сочевиця харчова (Lens culinaris M.) - однорічна рослина, яка широко культивується на території України. Вирощують її заради насіння, яке містить велику кількість білка [4]. У народній медицині використовують насіння сочевиці, проте застосування трави сочевиці для одержання засобу для лікування захворювань гепатобіліарної системи невідоме з джерел інформації. Авторами вперше запропоновано використання трави сочевиці харчової для одержання комплексу біологічно активних сполук з гепатопротекторною, анальгетичною активністю та регенеруючою дією на підшлункову залозу. Експериментально встановлено, що використання в якості екстрагента гарячої води при одержанні комплексу біологічно активних речовин з трави сочевиці харчової забезпечує їх найбільш повну екстракцію. Варіанти дослідів з використанням як екстрагенту води та спирту етилового різної концентрації представлені у таблиці 1. Таблиця 1 Вибір екстрагента за кількісним виходом екстрактивних речовин Екстрагент Кількісний вихід екстрактивних речовин, % вода 30 % етанол 50 % етанол 70 % етанол 96 % етанол 39,30 35,50 30,60 28,70 21,45 Передбачене заявленим способом підвищення температури води до 95-100 °С і трикратна екстракція сировини новими порціями екстрагенту інтенсифікує процес екстрагування, що дозволяє максимально вилучити БАР із сировини. Крім того, такий екстрагент також вигідний з боку технологічних вимог до здійснення способу, бо є доступним, дешевим та екологічно безпечним. Сумарне співвідношення сировини і екстрагенту 1:28 встановлено експериментально і є оптимальним для вибраної сировини. Перший етап екстракції здійснюють при співвідношенні сировина:екстрагент 1:10, а друга і третя екстракція при співвідношенні 1:9. Менша кількість екстрагенту на кожному з етапів не дозволяє ефективно провести екстракцію і створює труднощі технологічного характеру. Більша кількість екстрагента є нераціональною, тому що необхідна екстракція досягається заявленою кількістю екстрагенту. Загальна тривалість усіх етапів екстракції складає 4,0 години і є необхідною і достатньою для вичерпного вилучення з сировини комплексу біологічно активних сполук з гепатопротекторною, анальгетичною активністю та регенеруючою дією на підшлункову залозу. В результаті здійснення заявленого способу одержують комплекс БАР - порошок світлокоричневого кольору зі специфічним запахом, гіркуватий на смак, добре розчинний у воді, практично не розчинний в ефірі та хлороформі. Таким чином, використання трави сочевиці при сукупності параметрів заявленого способу дозволяє одержати комплекс біологічно активних сполук з гепатопротекторною, анальгетичною активністю та регенеруючою дією на підшлункову залозу. Заявлений спосіб є новим, невідомим з джерел інформації. Корисна модель здійснюється наступним чином. Висушену і подрібнену до розміру часток 2-5 мм траву сочевиці завантажують у реактор з мішалкою і паровою сорочкою, заливають гарячою водою 95-100 °С у співвідношенні сировина:екстрагент 1:10. Екстракцію проводять протягом 2 годин при перемішуванні і постійно витриманій температурі. Процедуру повторюють ще двічі при співвідношенні сировини до екстрагенту 1:9, з тривалістю кожної екстракції 1 год. Відфільтровані водні витяжки об'єднують і упарюють на вакуумновипарювальному апараті до повного висушування. Сухий екстракт подрібнюють. Вихід готового про 5 63766 дукту становить 32,0-34,0 % від повітряно-сухої сировини. Корисна модель ілюструється прикладами. Приклад 1. 1,2 кг подрібненої повітряно-сухої трави сочевиці завантажували у реактор з мішалкою і паровою сорочкою, заливали 12 л гарячої води 95 °С і перемішували протягом 2 годин при постійно витриманій температурі 95 °С. Екстракцію повторювали двічі, додаючи по 10,8 л води, з тривалістю кожної екстракції 1 год. Одержані екстракти об’єднували і упарювали на вакуумновипарювальному апараті до повного висушування. Сухий екстракт подрібнювали. Вихід цільового продукту склав 402 г, тобто 33,5 %. Приклад 2. Гепатопротекторну активність комплексу БАР з трави сочевиці харчової, одержаного за заявленим способом, проводили на моделі гострого тетрахлорметанового гепатиту, який відтворювали 6 шляхом підшкірного введення щурам 50 % олійного розчину тетрахлорметану у дозі 0,8 мл на 0,1 кг маси тварини протягом двох діб з проміжком 24 години [5]. Досліди проводили на 24 білих щурах масою 0,21-0,24 кг. Тварини були розділені на 4 групи: перша група - контрольна патологія; тваринам другої і третьої груп на фоні тетрахлорметанового ураження печінки вводили відповідно водні розчини комплексу БАР трави сочевиці харчової і препарат порівняння - біофлавоноїдний гепатопротектор силібор. Комлекс БАР з трави сочевиці і препарат порівняння силібор вводили тваринам за 1 год. до і через 2 год. після введення тетрахлорметану. Вивчення біохімічних та функціональних показників стану печінки проводили через 24 год. Після останнього введення тетрахлорметану. Результати біохімічних показників стану печінки дослідних тварин наведені в табл. 2. Таблиця 2 Вплив комплексу БАР трави сочевиці харчової, одержаного за заявленим способом, на біохімічні показники стану печінки тварин при гострому токсичному гепатиті Група тварин 1 2 3 4 Об’єкт дослідження 50 % олійний р-н ССl4 Комплекс БАР з трави сочевиці Силібор Інтактні тварини Доза, Кількість Еритроцити, Лейкоцити, Гемоглобін, мг/ 1,0 12 9 тварин х10 /л х10 /л г/л кг АсАТ, мкмоль/ год. мл АлАТ, мкмоль/ год. мл 6 0,8 мл 6,04±0,3 17,97±0,10 111±4,5 0,96±0,03 1,14±0,02 6 25 6,40±0,3 15,0±0,20 124±1,5 0,54±0,02 0,69±0,03 6 25 7,24±0,21 12,21±0,10 130±3,0 0,48±0,03 0,59±0,02 6 – 7,44±0,25 12,98±0,06 135+4,0 0,40±0,02 0,56±0,03 Інтенсивність ураження клітинних мембран печінки оцінювали за рівнем активності трансаміназ аланінамінотрансферази (АлАТ) та аспартатамінотрансферази (АсАТ). Активність трансаміназ визначали уніфікованим динітрофенілгідразиновим методом за допомогою стандартного набору реактивів фірми ЗАО "ДИАКОНТ-ДС". Рівень гемоглобіну, число еритроцитів і лейкоцитів визначали за загальноприйнятими методиками. Результати досліджень (табл. 2) показали, що введення тваринам тетрахлорметану приводить до ураження печінки, про що свідчить порушення активності АлАТ, АсАТ. Рівень цих показників зростає у 2,0 і 2,4 рази відповідно у порівнянні з інтактними тваринами. Одночасне введення тетрахлорметану та комплексу БАР трави сочевиці дозволило встановити суттєве зниження активності АлАТ і АсАТ. Підтвердженням цих властивостей є чітко виражена спрямованість до нормалізації активності вивчених ферментів у тварин другої групи (активність АлАТ в сироватці крові знизилась в 1,8 рази; АсАТ - в 1,7 рази) у порівнянні з першою групою тварин. В цій групі тварин спостерігалось зростання числа еритроцитів і рівня гемоглобіну у порівнянні до тварин контрольної групи. Наведені результати свідчать, що застосування комплексу БАР трави сочевиці при гострому токсичному ураженні печінки значно зменшує токсичну дію тетрахлорметану, забезпечуючи гепатозахисну дію. Таким чином, комплекс БАР трави сочевиці харчової, одержаний згідно заявленої корисної моделі, проявляє при токсичних ураженнях печінки гепатопротекторну активність, яка практично не поступається гепатопротекторній дії препарату порівняння силібору. Приклад 3. Регенеруючу дію комплексу БАР з трави сочевиці харчової, одержаного за заявленим способом, на підшлункову залозу вивчали на моделі гострого панкреатиту [6]. Досліди проводили на білих щурах масою 0,18-0,22 кг, розділених на 3 групи: дослідна, контрольна, інтактні тварини. Для відтворення гострого панкреатиту тваринам першої та другої груп після 12-годинного голодування вводили перорально тваринний жир дозою 10,0 г та алкоголь дозою 1,6 г на 1,0 кг маси тварини, після чого тваринам на 3 години створювали іммобілізаційно-холодовий стрес. Через 24 год. після іммобілізаційно-холодового стресу у тварин контрольної групи морфологічно підтверджено ознаки гострого вогнищевого панкреатиту. Тваринам дослідної 7 групи протягом 14 діб після відтворення гострого панкреатиту вводили інтраабдомінально водний розчин комплексу БАР трави сочевиці харчової, одержаного за заявленим способом, дозою 50 мг на 1,0 кг маси тварини. Третя група - інтактні тварини. Через 14 діб з моменту першого введення тваринного жиру та алкоголю тварин декапітували (під ефірним наркозом). Висновок про регенеруючий вплив на підшлункову залозу досліджуваного 63766 8 екстракту робили на основі біохімічних показників крові підшлункової залози. Вміст глюкози в крові визначали за допомогою аналізатора глюкози АГКМ-01, активність -амілази - автоматичного аналізатора ACCENT-200 з використанням реактивів фірми PZ CORMAY S.A. (Польща). Результати біохімічних показників крові дослідних тварин представлені у табл. 3. Таблиця 3 Біохімічні показники крові підшлункової залози дослідних тварин Група тварин 1 2 3 Об'єкт дослідження Комплекс БАР з трави сочевиці харчової Контроль Інтактні тварини Дані таблиці 3 свідчать про те, що одночасне введення тваринного жиру, алкоголю і досліджуваного екстракту знижує вміст глюкози в крові і активність амілази, доводячи вказані показники до рівня інтактних тварин, тобто комплекс БАР з трави сочевиці знижує в умовах гострого експериментального панкреатиту вміст глюкози в крові (у 1,42 рази) та активність амілази крові (у 1,79 рази) у порівнянні з контрольною групою. Для підтвердження регенеруючої дії на підшлункову залозу комплексу БАР трави сочевиці харчової, одержаного за заявленим способом, проводили порівняння гістоморфологічного дослідження змін у тканині підшлункової залози. Для патогістологічного дослідження проводили забір підшлункової залози, шматочки якої фіксували у нейтральному формаліні з наступним виготовленням парафінових зрізів. Гістологічні препарати фарбували гематоксиліном-еозином. Наявність або відсутність патологічних змін в органах досліджуваних тварин визначали за допомогою мікроскопа МБР-1 при 200-, 400-, 800-разовому збільшенні. При вивченні гістологічних препаратів тварин другої групи (контроль) морфологічно спостерігалися деструкція та некроз паренхіми підшлункової залози, декомплексація ацинарної частини, порушення часточкової будови, виражений набряк, масивні просякання еритроцитами (свіжі та вилужені), вогнища некрозів, інфільтрація тканини поліморфноядерними запальними клітинами, як в паренхімі, так і по ходу судин, вивідних протоків у стромі. Ближче до периферії ацинарної частини залози спостерігалися виражені некрози паренхіми та жирові некрози з формуванням абсцедуючих порожнин та секвестрів. У тварин другої групи морфологічно підтверджено гострий геморагічногнійний панкреатит з явищами панкреонекрозу. Кількість тварин Глюкоза, ммоль/л Амілаза, од/л 6 7,22±0,19 183,95±7,72 6 6 10,28±0,18 5,08±0,09 328,70±10,12 78,01±3,10 Для інтактних тварин (третя група) тканина підшлункової залози часточкової будови, ацинарна та острівкова частини диференціюються чітко, помірне повнокрів'я. Міжчасточкові і внутрішньочасточкові сполучнотканинні перегородки розвинені, екзокринні ацинуси сформовані в достатній кількості. Міжчасточкові вивідні протоки звивисті, не поширені. Панкреатичні островки контуруються чітко, не деформовані, повнокровні. Кровоносні судини повнокровні. Гістологічна будова підшлункової залози відповідає нормі. У тварин дослідної групи спостерігався набряк стоми, з частковим здавленням острівців Лангерганса, повнокрів'я судин, розширення протоків, причому збережена дольчата будова ацинарної частини та острівкового апарату залози. Результати проведених досліджень свідчать, що досліджуваний комплекс БАР з трави сочевиці харчової при гострому експериментальному панкреатиті проявляє регенеруючу дію на підшлункову залозу на клітинному рівні. Приклад 4. Анальгетичну активність комплексу БАР трави сочевиці, одержаного за заявленим способом, вивчали на моделі "оцтовокислих корчів" на білих щурах масою 0,15-0,18 кг, які були розподілені на 6 груп: дослідні; ті, яких лікували досліджуваним екстрактом у дозах 50, 100, 150, 200 мг/кг; ті, яких лікували препаратом порівняння анальгіном, і контрольні. Анальгетичну активність оцінювали за здатністю зменшувати кількість "оцтовокислих корчів" і виражали у відсотках [5]. Розрахунок проводили за формулою: CК  CД  100 AA  СК ; де: АА - анальгетична активність, СК і СД - середня кількість корчів у тварин контрольної і дослідної групи. Результати досліду наведені у таблиці 4.   9 63766 10 Таблиця 4 Анальгетична активність комплексу БАР трави сочевиці харчової, одержаного за заявленим способом Варіанти досліду Контроль Анальгін, 55 мг/кг 50 мг/кг Комплекс БАР 100 мг/кг з трави соче150 мг/кг виці харчової 200 мг/кг Кількість корчів, М±m 23±2,13 10+0,88 12,5±1,94 13±2,19 12±3,26 9±1,17 Активність, % 58* 46 43 48 61* Примітка: * - різниця достовірна у порівнянні з контрольною групою тварин (Р