Поліпшений спосіб одержання аргініндезимінази mycoplasma hominis із рекомбінантних штамів бактерій escherichia coli

Поліпшений спосіб одержання аргініндезимінази Mycoplasma hominis із рекомбінантних штамів бактерій Escherichia coli, який відрізняється тим, що для отримання аргініндезимінази використовується рекомбінантний (містить ген АДІ М. hominis з покращеною трансляцією) штам бактерій Е.coli, оптимізуються умови індукції синтезу, денатурації і ренатурації ферменту. (19) (21) u201109203 (22) 22.07.2011 (24) 26.12.2011 (46) 26.12.2011, Бюл.№ 24, 2011 р. (72) СИБІРНИЙ АНДРІЙ АНДРІЙОВИЧ, ФАЮРА ЛЮБОВ РОМАНІВНА, БОРЕЦЬКИЙ ВОЛОДИМИР ЮРІЙОВИЧ, БОРЕЦЬКИЙ ЮРІЙ РОМАНОВИЧ (73) ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ НАН УКРАЇНИ 3 66335 бактерій використано багате середовище LB, індукція експресії ферменту проводиться за допомогою досить дорогого реактиву ізопропіл-βтіогалактозиду (ІПТГ). Для денатурації білка АДІ використовується буфер, що містить високі концентрації гуанідинхлориду (6 М) та дитіотрейтолу (ДТТ, 10 мМ). У запропонованому способі використовуються наступні методи: полімеразна ланцюгова реакція 4 (ПЛР), конструювання рекомбінантних плазмід, трансформація бактерій методом електропорації, виділення плазмід із бактерій, рестрикційний аналіз, електрофорез в агарозному гелі [6], електрофорез білків в поліакриламідному гелі в денатуруючих умовах, денатурація і ренатурація білка, хроматографічна очистка білка [7], колориметричний метод визначення активності АДІ [3]. Таблиця 1 Вплив умов денатурації/ренатурації на вихід активності АДІ Умови денатурації/ренатурації рН 8,5, 6 Μ гуанідинхлорид 10 мМДТТ (за патентом [5]) рН 7,2, 5 Μ гуанідинхлорид 20 мМ К-К-Н-РО4 рН=7,2 (за статтею [4]) рН 7,2, 5 Μ гуанідинхлорид 5 мМ ДТТ/ 200 мМ КС1, 1 мМ ЕДТА, 1 мМ ДТТ рН 8.5, 6 Μ гуанідинхлорид 200 мМДТТ/ 200 мМ КС1, 1 мМ ЕДТА, 1 мМ ДТТ У кожному випадку для денатураціїренатурації були використані однакові аліквоти суспензії мікротілець. Поліпшений спосіб одержання аргініндезимінази М. hominis із рекомбінантних штамів бактерій Е. coli ілюструється наступними графічними матеріалами: На фіг.1 зображено послідовність нуклеотидів гена АДІ М. hominis. Заміни показано стрілкою і виділено потовщеним шрифтом. На фіг.2 наведено схему ампліфікації гена ADI M. hominis. Ген ADI позначено великою сірою стрілкою. Праймери зображено маленькими стрілками і підписано. Порядок ампліфікації фрагментів гена вказано цифрами. Положення введених нуклеотидних замін позначено чорними зірками. На фіг.3 показано електрофоретичний аналіз залежності продукції АДІ бактеріями Е. coli від концентрації гліцерину - 0,4% (1-5) і 0,75% (6-10) в автоіндукційному середовищі та часу культивування: 2 год. - № 1, 6; 6 год. - № 2, 7; 18 год. - № 3, 8; 26 год. - № 4, 9; 32 год. - № 5, 10 відповідно. На фіг.4 зображено електрофоретичний аналіз в ПААГ в денатуруючих умовах (у присутності до Вихід активності АДІ, Е/мл денатурованого розчину 0,047 0,014 0,065 0,086 децилсульфату натрію) очищеного препарату рекомбінантної АДІ. 1 - препарат АДІ; 2 - маркери молекулярної маси. Поліпшений спосіб одержання аргініндезімінази М. hominis із рекомбінантних штамів бактерій Е. coli здійснюється кількома етапами: Етап 1. Сайт специфічний мутагенез гена ADI M. hominis. Враховуючи результати аналізу нуклеотидної послідовності гена ADI M. hominis (фіг.1), програмується послідовність праймерів із замінами для ампліфікації гена. Праймери програмуються таким чином, щоб замінити внутрішні стоп кодони (котрі у клітинах М. hominis декодуються як триптофан) на універсальні триптофанові кодони, як описано, для гена АДІ Mycoplasma arginini [3]. Додатково вводяться заміни для покращення ефективності трансляції: T4G, A603G, A789G, А792Т, А813Т, A816G, A819G, А822Т, A882G, A1227G (фіг. 2). Ген ампліфікується за допомогою полімеразної ланцюгової реакції із використанням вказаних праймерів (табл. 2) та комерційно доступної хромосомної ДНК М. hominis як матриці (фіг. 1). Таблиця 2 Перелік праймерів, використаних для ампліфікації гена АДІ № 1 2 3 4 5 6 7 8 Праймер Did1 Did2 Did4 Did6 Dr3 Dr5 Dr7 DiBam Sequence 5'-3' ACAGCCATGGCTGTATTTGACAGTAAAT AAAACTCCGTGGTACTACGACC AACTTAATGCACCTAGATACTTGGCTGACTATGTTAGACAAG CTGGGACTACGATTTAGTTAACGG CGTAGTACCACGGAGTTTTAAACTAGTTTAG GGTGCATTAAGTTAGTCCATTTAGGAACATTAATTG TAAATCGTAGTCCCAGAATTTGAATACATC TAGGATCCTACCACTTAACATCTTTACGTG Етап 2. Конструювання продуцента АДІ М. hominis на основі бактерій Е. coli. Отриманий фрагмент ДНК, що містить оптимізований ген АДІ М. hominis (етап 1), гідролізують ендонуклеазами ВаmНІ і NcoI та клонують на векторі рЕТ32. Отриману плазміду, що містить оптимізований ген АДІ М. hominis, під контролем промотора Т7, вводять (трансформують) у клітини 5 66335 Е. coli BL-21 методом описаним раніше [6]. Етап 3. Отримання біомаси продуцента із високим вмістом АДІ. Для аутоіндукційної гетерологічної експресії АДІ використовується мінеральне середовище та методика, запропоновані Studier [8] з деякими модифікаціями, необхідними для ефективної експресії даного білка. Як індуктор експресії використовується α-лактоза. Із літератури [9] відомо, що умови досягнення максимального рівня експресії цільового гетерологічного білка (концентрація гліцерину, час та температура вирощування) підбираються у кожному конкретному випадку. Для продукції АДІ використовуються наступні умови. Для отримання максимального рівня експресії АДІ, стартова культура бактерій вирощується до А600 = 1,01,5. Після центрифугування (1500g × 10 хв) клітинний осад суспендують в 50 мл аутоіндукційного 6 середовища, що містить 0,01% α-лактозу і 0,75% гліцерин до отримання суспензії клітин з оптичною густиною А600 = 0,3, яку поміщають для культивування в 300 мл колби. Клітини вирощують при оптимальній температурі, що становить 32 °C. Залежність виходу біомаси штаму-продуцента та продукції АДІ від часу культивування наведено у табл. 3. Оптимальний час вирощування становить 30-36 год. Зменшення концентрації гліцерину та інші відхилення від підібраних нами умов зменшують вихід цільового продукту (фіг.3). Зниження рівня рН культурального середовища нижче 6,0 впродовж вирощування призводить до зменшення продукції АДІ. Тому під час вирощування проводиться контроль і дотитровування рН середовища до значень 7,0 - 7,4. Таблиця 3 Вплив часу вирощування штаму продуцента при температурі 32 °C на вихід біомаси і продукцію АДІ Час, год. OD600 Вихід АДІ 6 2,2 + 12 4,8 ++ 18 6,2 ++ Клітини осаджують (3000g × 10 хв), промивають 20 мМ К-фосфатним буфером рН = 7,2, повторно осаджують і зберігають при -20 °C. Етап 4. Отримання препаратів ренатурованої АДІ. Руйнування бактерійних клітин, отримання фракції мікротілець (препарат нерозчинної неактивної АДІ) і активної АДІ шляхом переведення мікротілець в розчин з наступною ренатурацією проводять, як описано [4, 5] з деякими модифікаціями. Розчинення ферменту проводять в 50 мМ Кфосфатному буфері, рН = 7,2, що містить 1 мМ ЕДТА, 5 М гуанідинхлорид та 5 мМ ДТТ. Мікротільця, отримані з 1 г бактерійних клітин, суспендують в 10 мл денатуруючого буфера. Для ренатурації використовують 20 мМ К-фосфатний буфер, рН = 7,2, що містить 200 мМ КСl, 1 мМ ДТТ, 1 мМ ЕДТА. Ренатураційна суміш інкубується 96 год. при температурі 15 °C. Очистку рекомбінантної АДІ проводять за допомогою афінної та гідрофобної хроматографій як описано [7]. У результаті проведених експериментів отримують препарат АДІ, близький до гомогенності (фіг. 4). При 37 °C 1 мг отриманого препарату фермента розщеплює 25 мкмоль аргініну за 1 хв. Препарат ферменту зберігається без втрати активності при 4 °C у 20 мМ фосфатному буфері, рН 7,2, що містить 1 Μ NaCl, впродовж 20 місяців. Джерела інформації: 1. Miyazaki К., Takaku H., Umeda Μ., Fujita Т., Huang W., Kimura Т., Yamashita J., Horio T. Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line. Cancer Res. - 1990. - Vol.50, N15. - P. 4522-4527. 24 8,5 ++ 30 10,5 +++ 36 10,2 +++ 42 8,9 ++ 2. Izzo F, Marra P, Beneduce G et al.- Pegylated arginine deiminase treatment of patients with unresectable hepatocellular carcinoma; results from phase I/II studies.- J. of Clinical Oncology. - 2004. Vol.22, N10. - P. 1815-1821. 3. Misawa S., Aoshima M., Takaku H., Matsumoto M, Hayashi H. High-level expression of Mycoplasma arginine deiminase in Escherichia coli and its efficient renaturation as an anti-tumor enzyme. Biotechnol.- 1994. - Vol.36, N2. - P. 145-155. 4. Dillon B.J., Holtsberg F.W., Ensor С.М., Bomalaski J.S., Clark M.A. Biochemical characterization of the arginine degrading enzymes arginase and arginine deiminase and their effect on nitric oxide production. Med Sci Monit. - 2002. - Vol.8, N7. - P. 248-253. 5. Патент США, Pub. No.: US 2005/0129706 AI, заявка від 15.01.2004, МПК A61K39/02, C12N9/10 // Modified arginine deiminase // Опубліковано 16.06.2005. 6. Sambrook J., Fritsh E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. 1989. 7. Kang S.W., Kang H., Park I.S., Choi S.H., Shin K.H., Chun Y.S., Chun E.G., Min B.H. Cytoprotective effect of arginine deiminase on taxol-induced apoptosis in DU145 human prostate cancer cells. Моl. Cells. - 2000. - Vol.10, N 3. - P.331-337. 8. Studier F.W. Protein production by autoinduction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif- 2005. - Vol.41. N1. - P. 207-234. 9. Sivashanmugam Α., Murray V., Cui C, Zhang Y., Wang J., Li Q. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Sci. - 2009. - Vol.18, N5. P.936-948. 7 66335 8 9 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська 66335 Підписне 10 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601