Спосіб індукції перекисного окиснення ліпідів штаму 167 agrocybe aegerita (brig.) fayod.

Спосіб індукції перекисного окиснення ліпідів штаму 167 Agrocybe aegerita (Brig.) Fayod., що включає культивування при 27,5 °С на глюкозопептонному середовищі та визначення рівня пере 3 66659 тивували на модифікованому глюкозо-пептонному середовищі, за рахунок чого досягають підвищення інтенсивності процесів ПОЛ, що може бути використано в біотехнології, медицині, екології. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб індукції перекисного окиснення ліпідів штаму 167 Agrocybe aegerita (Brig.) Fayod. включає культивування при 27,5 °С на глюкозо-пептонному середовищі та визначення рівня ПОЛ штамів базидіоміцетів, згідно з корисною моделлю, визначення рівня процесів ПОЛ проводять для штаму 167 Agrocybe aegerita, що культивується на модифікованому глюкозо-пептонному середовищі з сахарозою, яке містить компоненти у наступних концентраціях, г/ л: сахароза - 8; пептон - 5; KH2PO4 - 0,8; К2НРО4 - 0,6; MgSO4  7Н2О - 0,5; СаСl2 - 0,05; ZnSO4 x 7Н2О - 0,001; дистильована вода - до 1 літра. Запропонований спосіб індукції ПОЛ базидіоміцетів є новим тому, що він є невідомим з об'єкту дослідження та складу живильного середовища. Приклад конкретного виконання 1. Інтенсивність ПОЛ штаму 167 Agrocybe aegerita. Готують вихідне глюкозо-пептонне живильне середовище (ГПС) наступного складу, г/л: глюкоза 10 пептон 3 КН2РО 0,6 К2НРО 0,4 MgSO4  7112О 0,5 СаС2 0,05 ZnSO4  7H2O 0,001 дистильована вода до 1 літра. Живильне середовище розливають по 50 мл в конічні колби Ерленмейєра на 250 мл, стерилізують в автоклаві при 121±2°С протягом 40 хвилин. Кислотність середовища після стерилізації становить 6,0-6,5 рН. Середовище, після охолодження, інокулюють шматочком міцелію розміром 5x5 мм. Інокулюмом є чиста культура штаму 167, яка росла 7-10 діб на 4° за Баллінгом С А або на КГА [9]. 4 Штам 167 культивують протягом 10 діб при температурі 27,5 °С. Накопичення біомаси визначають ваговим методом, рН культурального фільтрату - потенціометричним, наприклад на рН-метрі „рН-150 МИ". Для оцінки активності процесів ПОЛ використовують тест з тіобарбітуровою кислотою - ТБК-тест. Метод заснований на визначенні кількості забарвленого продукту, який має максимум поглинання в червоному видимому спектрі при 532 нм. Забарвлений продукт утворюється в результаті взаємодії двох молекул ТБК з однією молекулою малонового діальдегіду (МДА) - одного із вторинних продуктів 1ЮЛ. Встановлено, що реакцію з ТБК дає не тільки МДА, а й багато інших карбонільних сполук, які утворюються під час ПОЛ. Тому разом їх називають ТБК-активні продукти (ТБК-АП). Для отримання гомогенату (МГ), міцелій відділяють від КФ і розтирають в ступці. Суміш центрифугують при 3000 об/хв. протягом 10 хвилин. Визначають вміст продуктів ПОЛ у мікологічному матеріалі в присутності 20 % трихлороцтової кислоти. Спектри поглинання ТБК-АП реєструють на спектрофотометрі, наприклад на СФ-26, при 532 нм та перераховують на вміст у наномолях МДА на 1 г маси досліджуваного матеріалу [4]. Розрахунки ведуть за формулою [4, 7]: D  10  V     532 ,  де D532 - показники оптичної густини при 532 нм; V - об'єм реакційної суміші (4 мл);  - відношення загального об'єму витяжки до об'єму проби, яку взято для визначення МДА;  - молярний коефіці-1 -1 єнт екстинції, складає 155000 л см моль ; Ρ наважка матеріалу, г. Статистичну обробку експериментальних даних проводять за методом дисперсійного аналізу, порівняння середніх арифметичних - за методом Дункана [8]. Таблиця 1 Ріст та інтенсивність ПОЛ штаму 167 Agrocybe aegerita на глюкозо-пептонному середовищі Час культивування, доба Біомаса, г/л Рн КФ 10 1,064 ±0,16 6,22 Дані досліду (табл. 1)свідчать про наступне. Вміст ТБК-АП в міцелії на 10-ту добу ферментації становить 5,0±0,1 нмоль/ г. Вміст ТБК-АП в КФ знаходиться на нижчому рівні, порівняно з міцелієм (2,1±0,0 нмоль / мл). Біомаса міцелію становить 1,06 ± 0,16 г/ л, водневий показник культурального фільтрату знизився з рН0 6,5 до 6,22 од. Приклад конкретного виконання 2. Ріст та інтенсивність ПОЛ штаму 167 Agrocybe aegerita на глюкозо-пептонному середовищі з сахарозою. Вміст ТБК-АП, нмоль / г (мл). МГ КФ 5,02 ± 0,02 2,09 ±0,01 Глюкоза, як джерело вуглецевого живлення, була замінена у глюкозо-пептонному середовищі на сахарозу в еквіваленті вмісту вуглецю. Всі операції з приготування живильних середовищ; культивування штаму 167 та визначення інтенсивності процесів ПОЛ, накопичення біомаси та рН КФ, а також статистичну обробку результатів проводять за прикладом конкретного виконання 1. 5 66659 6 Таблиця 2 Ріст та інтенсивність ПОЛ штаму 167 Agrocybe aegerita на глюкозо-пептонному середовищі з сахарозою Час культивування, доба Біомаса, г/л рН КФ 10 0,54 ± 0,05 6,47 Дані досліду (табл. 2) свідчать про наступне. Вміст ТБК-АП вміцелії на 10-ту добу ферментації становить 5,5 ± 0,2 нмоль/ г, що в 1,1 рази вище ніж при культивуванні на вихідному ГПС. Вміст ТБК-АП в КФ складає 3,1 ± 0,1 нмоль / мл, що в 1,5 рази вище за цей показник на ГПС. Згідно з отриманими результатами, для вивчення можливості індукції ПОЛ штаму 167, глюкоза, як джерело вуглецевого живлення, була замінена у вихідному глюкозо-пептонному середовищі на сахарозу у зв'язку з більш високими Вміст ТБК-АП, нмоль / г (мл). МГ КФ 5,5 ±0,2 3,1 ±0,1 показниками вмісту продуктів ПОЛ на цьому компоненті. Приклад конкретного виконання 3. Індукція ПОЛ штаму 167 Agrocybe aegerita. Модифікацію глюкозо-пептонного середовища з сахарозою, згідно з поставленою задачею, проводять за методом повного факторного експерименту (ПФЕ-2 ) [6]. Варіювання (λ) вмісту у живильних середовищах сахарози і пептону факторів х1, х2 складає 2 г/ л, а КН2РО і К2НРО4 факторів х3 і х4 -0,2 ті л, інші компоненти мають постійну концентрацію (табл. 3.). Таблиця 3 Матриця планування складу живильних середовищ за методом повного факторного експерименту (ПФЕ-2 ) для культивування штаму 167 Agrocybe aegerita № живильного середовища х1 (сахароза) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 8 12 8 12 8 12 8 12 8 12 8 12 8 12 8 12 10 Фактори х2 (пептон) х3 (КН2РО) х4 (К2НРО4) Взаємодія факторів Вміст у живильному середовищі, г/ л 1 0,4 0,2 1 1 0,4 0,2 x1 5 0,4 0,2 x2 5 0,4 0,2 х1,х2 1 0,8 0,2 x3 1 0,8 0,2 x1 x3 5 0,8 0,2 x2 x3 5 0,8 0,2 х1x2X3 1 0,4 0,6 х4 1 0,4 0,6 х,х4 5 0,4 0,6 х2х4 5 0,4 0,6 x1x2x4 1 0,8 0,6 x3x4 1 0,8 0,6 x1x3x4 5 0,8 0,6 x2x3x4 5 0,8 0,6 x1x2x3x4 3 0,6 0,4 0 Всі операції з приготування живильних середовищ; культивування штаму 167 та визначення інтенсивності процесів ПОЛ, накопичення біомаси та рН КФ, а також статистичну обробку результатів проводять за прикладом конкретного виконання 1. Вплив складу живильних середовищ на накопичення біомаси та інтенсивність ПОЛ штаму 167 Agrocybe aegerita на 10-ту добу ферментації представлено в таблиці 4. 7 66659 8 Таблиця 4 Вплив складу живильних середовищ на накопичення біомаси та ПОЛ штаму 167 Agrocybe aegerita № живильного середовища рН КФ Біомаса, г/ л 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 16 17 6,39 6,32 6,60 6,37 5,97 6,02 6,10 6,27 6,76 6,73 6,80 6,94 6,58 6,77 6,66 6,57 0,16±0,01 0,24 ± 0,05 0,78 ± 0,03 1,08 ±0,01 0,30 ± 0,04 0,28 ± 0,07 0,62 ± 0,02 0,98 ± 0,05 0,52 ± 0,08 0,74 ± 0,03 0,54 ± 0,06 1,14 ±0,09 0,72 ± 0,07 0,72 ± 0,09 1,44 ±0,04 0,54 ± 0,05 Дані досліду (табл. 4) свідчать про наступне. Вміст ТБК-АП в міцелії на 10-ту добу ферментації на середовищі № 15 становить 14,3 ± 0,4 нмоль/ г. Вміст ТБК-АП в КФ складає 3,8 ± 0,2 нмоль / мл. Отже, перевищення рівня вмісту ТБК-АП в міцелії на представленому середовищі № 15 відносно цього показника на глюкозо-пептонному середовищі з сахарозою складає 2,6 рази, а на вихідному глюкозо-пептонному середовищі - в 2,86 разів. Вміст ТБК-АП в КФ на цьому середовищі відносно глюкозо-пептонного середовища з сахарозою більший в 1,2 рази, а відносно вихідного глюкозо-пептонного середовища - в 1,8 разів. Таким чином, використання модифікованого живильного середовища дозволяє вести культивування штаму 167 базидіоміцета Agrocybe aegerita з метою індукції процесів перекисного окиснення ліпідів в міцелії та збільшення його продуктів в культуральній рідині для використання у біотехнології і мікологічних дослідженнях. Джерела інформації, які використані при складанні заявки 1. Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Гвоздикова Т.С. Новые биологически активные добавки на основе глубинного мицелия базидиальных грибов // Успехи медицинской микологии. - 2006. - Т. 7. - С 178-180. 2. Бухало А.С. Высшие базидиомицеты в чистой культуре. - К.: Наука, 1988. -144 с. 3. Владимиров 10. А. Свободные радикалы и антиоксиданти // Вестн. РАМН., 1998. - № 7. - С. 43-50. 4. Корж Е.В. Мухин В.В., Латышев Е.Е., Асланова Е.А., Перекисное окисление липидов: при Вміст ТБК-АП, нмоль/ г (мл) МГ КФ 4,9 ± 0,2 2,8 ±0,1 4,8 ±0,2 4,1 ±0,4 6,7 ± 0,3 3,6 ±0,2 11,8 ±0,4 4,9 ±0,2 4,2 ± 0,3 4,3 ± 0,3 9,0 ± 0,2 4,5 ± 0,2 5,8 ±0,2 3,7 ±0,3 9,2 ± 0,3 5,6 ±0,3 5,5 ± 0,3 2,8 ± 0,2 5,2 ± 0,4 4,4 ± 0,3 5,8 ±0,3 4,1 ±0,4 8,6 ± 0,2 4,6 ± 0,2 10,2 ±0,3 3,9 ±0,2 14,3 ±0,4 3,8 ±0,2 10,2 ±0,2 4,2 ±0,3 5,5 ± 0,3 3,1 ±0,3 чина или следствие // Вестник неотложн. и восст. Медицины, 2003. - Т. 4. - № 2. - С. 347-350. 5. Патент 12384 Україна. Спосіб визначення стресового стану базидіоміцетів та екологічного стану місця їх зростання за вмістом продуктів перекисного окиснення ліпідів / Федотов О.В. МПК A01G 7/00, С30В 28/00, С04В 35/00, А01Н 3/00, № U200504732; заявл. 20.05.05; опубл. 15.02.06. //Бюл. № 2. 6. Патент 39760 України. Живильне середовище для вирощування штаму Р-6v Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm. - продуцента каталази / Федотов O.B., Брусніцина О.М. Заявка № и200812035, від 10.10.2008, МПК (2009), кл. C12N 9/52, А23С 19/00 Бюл. № 5, від 10.03.2009. 7. Патент 57945 України. Спосіб мікотестування забруднення навколишнього середовища фенолом / Федотов О.В., Перцевой М.С. Заявка № и201009019, від 19.07.2010, МПК (2011.01), кл. A01G 7/00, А01Н 15/00 Бюл. № 6, від 25.03.2011. (прототип) 8. Приседський Ю.Г. Статистична обробка результатів біологічних експериментів / Ю.Г. Приседський. - Донецьк: Кассиопея, 1999. - 210 с. 9. Соломко Ε.Φ., Ломберг М.Л., Митропольська Η.1С, Чоловська О.В. Ріст окремих видів лікарських макроміцетів на поживних середовищах різного складу / Укр. ботан. журн. - 2000. - Т. 57, № 2. - С 119-125. 10.Соломко Э.Ф., Ломберг М.Л. Перспективы использования лечебно-профилактических свойств культивируемых грибов в 21 веке // Мат. наук.-практ. конф. "Нові технології при вирішенні медико-екологічних проблем". - Київ. - 2000.- С. 84-87. 9 Комп’ютерна верстка М. Мацело 66659 Підписне 10 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601