Спосіб прогнозування плодючості свиней за допомогою цитогенетичних та днк-маркерів

Спосіб прогнозування плодючості свиней за допомогою цитогенетичних та ДНК-маркерів, який відрізняється тим, що як маркери застосовують комплекс генів відповідальних за відтворні функції: рецептор фолікулостимулюючого гормону (FSHR), коактиватор ядерних рецепторів стероїдних гормонів (NCOA1), рецептор естрогену (ESR), рецептор пролактину (PRLR) та враховують стабільність геному за рівнем лімфоцитарних клітин з мікроядрами (МЯ). (19) (21) u201108732 (22) 11.07.2011 (24) 25.01.2012 (46) 25.01.2012, Бюл.№ 2, 2012 р. (72) КОСТЕНКО СВІТЛАНА ОЛЕКСІЇВНА, ДРАГУЛЯН МАРІЯ ВАЛЕРІЇВНА, СИДОРЕНКО ОЛЕНА ВАСИЛІВНА (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ БІОРЕСУРСІВ І ПРИРОДОКОРИСТУВАННЯ УКРАЇНИ 3 66984 4 Таблиця 1 Послідовності праймерів Локуси FSHR NCOAl ESR PRLR Послідовність F GCA АСА ААТ СТА ТТТ ТАА GGC AAG А R GAT GCT САС СТТ CAT GTA GCT G F AGG GGC ТАС ССТ ССТ GTA AG R СТТ СТС TGC CAG ТТС ТСС AGT С F ССТ GTT ТТТ АСА GTG ACT ТТТ АСА GAG R САС ТТС GAG GGT CAG ТСС ААТ TAG F CGT GGC ТСС GTT TGA AGA ACC R CTG AAA GGA GTG CAT AAA GCC Таблиця 2 Параметри ампліфікації Для ампліфікаторів з активним регулюванням температури (за об'ємом рідини в пробірці –10 мкл) Етапи ампліфікації Температура Час Кількість циклів 1 2 3 4 FSHR Початкова денатурація ДНК 94 °C 3 хв 1 Денатурація 94 °C 30 с Відпал праймерів 65 °C 30 с 8 72 °C 30 с 94 °C 30 с Синтез 57 °C 30 с 27 72 °C 30 с Фінальний синтез 72 °C 5 хв 1 4 °C Зберігання NCOAІ Початкова денатурація ДНК 94 °C 3 хв 1 Денатурація 94 °C 30 с 8 Відпал праймерів 63 °C 30 с 72 °C 30 с Синтез 94 °C 30 с 32 55 °C 30 с 72 °C 30 с Фінальний синтез 72 °C 5 хв 1 4° Зберігання ESR Початкова денатурація ДНК 94 °C 5 хв 1 Денатурація 94 °C 45 с Відпал праймерів 55 °C 1 хв 31 Синтез 72 °C 1 хв Фінальний синтез 72 °C 8хв 1 4 °C Зберігання PRLR Початкова денатурація ДНК 93 °C 3 хв 1 Денатурація 93 °C 30 с 35 Відпал праймерів 60 °C 1 хв Синтез 72 °C 1 хв Фінальний синтез 72 °C 3 хв 1 4 °C Зберігання Для рестриктного гідролізу ампліфікованих фрагментів використовують ферменти рестрикції Rsa І для гену NCOAІ, Pvu II, для гену ESR та Аlu І для гену PRLR. Ген FSHR генотипується методом Bi-Passa без додавання рестриктази. Зразки інкубують протягом 12-16 годин при 37 °C (або близь ко 3 годин додавши в два рази більше ферменту). По закінченню проводять електрофоретичний аналіз продуктів рестрикції. Під час ДНК-ідентифікації свиней за геном FSHR генотип СС має такі рестрикційні розміри 674 та 280 п.н, СТ - 61 А, 442 та 280 п.н., ТТ - 61 А, 5 66984 442п.н. Під час ДНК-ідентифікації свиней за геном NCOAІ після обробки рестриктазою Rsa І, генотип А1А1 характеризується наявністю продуктів розмірами 440 п.н., А1А2 - 440, 282 та 158 п.н., А2А2 282 та 158 п.н. відповідно. Під час ДНКідентифікації свиней за геном ESR після обробки рестриктазою Pvu II, генотип АА дає фрагмент розміром 120п.н, АВ - 120 і 55 п.н., а генотип ВВ 55 п.н. відповідно. Рестриктаза Аlu І за геном PRLR ріже генотип на наступні фрагменти розміром АА - 85, 59 та 19 п.н., АВ - 104, 85, 59 та 19 п.н., ВВ - 104 та 59 п.н. Виявлено частоти алелей та генотипів генів FSHR, NCOAІ, ESR, та PRLR у тварин української м'ясної та уельської порід. Частота тварин з бажаним генотипом СС гена FSHR склала 56 % в української м'ясної породи та 57 % в уельської породи. На долю тварин з бажаним генотипом А1А1 гена NCOAІ припадає 75 % свиноматок уельської породи та 46 % свиноматок української м'ясної породи. Частота бажаного алеля В та генотипу ВВ гену ESR у свиноматок уельської породи становила 40 % та 2 % відповідно, у свиноматок української м'ясної породи становила 48 % та 10 % відповідно. Частота бажаного алеля А та генотипу АА гену PRLR у свиноматок уельської породи становила 53,1 % та 34,4 % відповідно, у свиноматок української м'ясної породи становила 58,06 % та 51,6 % відповідно. Встановлено достовірну перевагу свиноматок з бажаними та проміжними генотипами по чотирьох генам (FSHR/NCOAІ/ESR/PRLR) над тваринами з генотипами ТТ/А2А2/АА/ВВ (FSHR/NCOAІ/ESR/PRLR) на 0,9 голів по багатоплідності, 0,63 голів по показникам народження живих поросят та 0,25 голів по показникам поросят при відлученні. Виявлено перевагу свиноматок уельської та української м'ясної порід з генотипами СС над генотипом ТТ гену FSHR по багатоплідності на 0,3 та 1,3 поросяти при опоросі відповідно. Встановлено перевагу свиноматок української м'ясної та уельської порід генотипу А1А1 над тва 6 ринами з генотипом А2А2 по багатоплідності на 0,7 та 0,4 поросяти в опоросі відповідно. Аналіз даних по багатоплідності свиноматок уельської та української м'ясної порід при першому опоросі виявив перевагу тварин з генотипом ВВ над свинями з генотипом АА по гену ESR на 0,9 та 1,0 поросяти відповідно. Виявлено перевагу свиноматок уельської та української м'ясної порід з генотипами АА над генотипом ВВ гену PRLR по багатоплідності на 1,0 та 0,5 поросяти в опоросі відповідно. Нами проведено цитогенетичне дослідження. При збільшенні мікроядер (МЯ) у тварин з бажаним та проміжним генотипом відмічалось зменшення багатопліддя з кореляцією r=-0,30 та зменшувався відсоток збереженості потомства з кореляцією r=-0,48 (0,99>Р>0,95). Для розробки селекційної стратегії нами пропонується побудова маркерних профілів свиней, в яких відображені генотипи тварин за цитогенетичними та ДНК-маркерами. При врахуванні цитогенетичних показників відбирались свиноматки зі стабільним геномом та без хромосомних мутацій. Маркерні профілі з бажаним та проміжним генотипами по генам FSHR/NCOAІ/ESR/PRLR для свиноматок української м'ясної та уельської порід нами представлені у таблиці 3. При збільшенні рівня МЯ у свиноматок уельської породи з бажаним та проміжними генотипами відмічалось зменшення багатоплідності зі слабкою зворотною кореляцією r=-0,30 та відсотку збереженості потомства зі слабкою зворотною кореляцією r=-0,29 (0,999>Р>0,99). У свиноматок української м'ясної породи з бажаним та проміжним генотипами при збільшенні МЯ зменшувався відсоток збереженості потомства з середньою зворотною кореляцією r=-0,40 (0,999>Р>0,99). Для встановлення зв'язку кількості клітин з мікроядрами із багатоплідністю та збереженістю потомства у свиноматок небажаного генотипу уельської та української м'ясної породи нами було побудовано маркерний профіль, наведений у таблиці 4. Таблиця 3 Зв'язок частоти клітин з мікроядрами із багатоплідністю та збереженістю потомства у тварин бажаного та проміжного генотипів Ідентифікаційний номер 5144 6692 8794 1226 1126 8464 8518 342 1030 8462 Родина Лайк Герл Лайк Мейд Дон Міст Лайк Мейд Імпоузін Емма Лайк Мейд Лайк Герл Лайк Мейд Дон Міст Показник МЯ Уельська порода 7 3,91 5,25 3,4 4,83 3,4 3,5 6,7 3,4 3,7 Багатоплідність Збереженість 11 11 13 9 10 12 8 10 12 10 89,00 89,00 87,00 91,00 90,00 88,00 92,00 90,00 88,00 90,00 7 66984 8 Продовження таблиці 3 354 4326 8720 Лайк Герл Лайк Мейд Лайк Герл 1518 214 66 822 700 32 824 220 708 638 Цапля Цапля Целіна Цензура Цапля Цапля Цензура Цапля Цензура Целіна 5,5 5 2,9 Українська м'ясна порода 4,5 4,56 2 3,2 6,2 3,2 3,5 4,6 3,05 1,55 У свиноматок уельської породи з небажаними генотипами спостерігався зв'язок рівня МЯ з показниками продуктивності, що виявлявся у зменшенні збереженості потомства при збільшенні кількості клітин з МЯ з середньою зворотною кореляцією r=-0,56 (0,999>Р>0,99). При збільшенні 13 10 9,66 87,00 90,00 79,31 12 11 11,33 10 12,5 9,8 11 10 6 11 88,00 89 88,23 86,66 68 83,67 63,63 90 87 89 МЯ у свиноматок української м'ясної породи з небажаними генотипами відмічалось зменшення багатоплідності зі слабкою зворотною кореляцією r=-0,28 (0,999>P>0,99) та зменшувався відсоток збереженості потомства середньою зворотною кореляцією r=-0, 46 (0,999>Р>0,99). Таблиця 4 Зв'язок рівня мікроядер із багатоплідністю та збереженістю потомства у тварин небажаних генотипів Ідентифікаційний номер 4326 1090 8520 356 6348 5614 330 8478 8542 8514 1000 6512 8794 1114 28 446/776 1074 808 850 852 230 Родина Лайк Мейд Лайк Герл Імпоузін Лайк Герл Лайк Герл Імпоузін Імпоузін Дон Міст Емма Імпоузін Лайк Мейд Лайк Герл Дон Міст Лайк Герл Цензура Целіна Цапля Цензура Церера Церера Цапля Показник МЯ Уельська порода 5 5,8 4,6 5,3 5 4,7 3,98 5,2 3,7 3,7 3,5 4,8 5,28 5,18 Українська м'ясна порода 5,9 1,45 3,4 3,4 4,6 4,2 7,6 Виявлена нами достовірна кореляція між показниками продуктивності та рівнем МЯ тварин свідчить про те, що тварин слід відбирати не тільки на основі ДНК-маркерів, але слід ще враховувати стабільність геному свиней. Також з наших досліджень можна зробить висновок, що більш стабільний геном спостерігався у тварин з бажаними та проміжними генотипами по генам FSHR/NCOAІ/ ESR/PRLR. Багатоплідність Збереженість 10 5 12 12 11 10 7 12 11 8 9 11 11 9 90,00 5 10 11 6 14 10 8 10 87,5 89 100 86 89 77,7 88,00 88,00 89,00 90,00 93,00 88,00 89,00 92,00 91,00 89,00 89,00 91,00 Кількість тварин для подальшого використання скорочується із збільшенням кількості маркерів, що використовуються для відбору. Так наприклад із 52 свиноматок уельської породи 47 тварин, що використовується з бажаним та проміжним генотипами по FSHR, якщо враховувати ген NCOAІ, то їх кількість зменшується до 35 по врахуванні чотирьох генів можна використовувати тільки 15 тварин, що складає 31,91 %, а в української м'ясної 9 серед 40 свиноматок використовується за бажаним та проміжним генотипами по FSHR 35 тварин, а якщо враховувати всі чотири гени - тільки 17 (48,57 %). Результати порівняльної динаміки маркерної селекції свиноматок схематично представлені нами на фіг. - Порівняльна динаміка маркерної селекції свиноматок зі стабільним геномом за бажаним Комп’ютерна верстка М. Ломалова 66984 10 та проміжним генотипом генів FSHR, /NCOAІ/ ESR/ PRLR. Таким чином, результати аналізу підтверджують ефективність використання комплексних генетичних маркерних досліджень для визначення та прогнозування тварин з бажаними генотипами та стабільним геномом, що підвищить багатоплідність свиней. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601