Спосіб отримання та відбору антивидових моноклональних антитіл

Реферат: UA 69270 U UA 69270 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель стосується імунології та гібридомної технології і може бути використана для одержання та відбору антивидових моноклональних антитіл (МКАТ) з метою подальшого використання в імуноаналізі. У літературі описані схеми імунізації мишей, отримання гібридом-продуцентів моноклональних антитіл (МКАТ) до імуноглобулінів людини та відбору даних антивидових МКАТ для їх подальшого використання в імуноаналізі [1-5]. Проте згадані схеми є тривалими і передбачають проведення рутинного скринінгу тисяч отриманих гібридом з метою віднаходження цінних клонів гібридом-продуцентів МКАТ. Такий методологічний підхід не є ефективним, особливо коли мова йде про біотехнологічне виробництво. Головною проблемою у даному випадку є високоефективне отримання МКАТ із заздалегідь визначеними властивостями. Така задача вирішується шляхом розробки оптимізованих схеми отримання гібридом-продуцентів та відбору синтезованих ними МКАТ. Ключовими моментами такого наукового пошуку є вивчення закономірностей та особливостей імунної відповіді на ті чи інші антигени, оптимізація методів відбору та використання отриманих антитіл. Найбільш близьким до запропонованого способу є використання короткострокової схеми імунізації при отриманні антиімуноглобулінових МКАТ [6], яка відрізняється тим, що із мієломними клітинами гібридизують лімфоцити підколінних і пахових реґіонарних лімфатичних вузлів імунізованої тварини, що забезпечує швидке та ефективне одержання гібридом продуцентів високоактивних та специфічних моноклональних антитіл до імуноглобулінів людини. Недоліком згаданого способу є його висока трудомісткість та певна невизначеність щодо імунохімічних характеристик одержуваних моноклональних антитіл. В основу корисної моделі поставлено задачу: розробка високоефективного способу одержання та відбору антивидових моноклональних антитіл із заздалегідь відомими властивостями, що роблять можливим їх використання у високоінформативних методах імуноаналізу. Поставлену задачу вирішують шляхом поетапної характеристики та відбору клонів гібридом (продуцентів МКАТ) за чітко визначеними критеріями, а саме: 1) двоетапне тестування гібридом на наявність МКАТ заданої специфічності у культуральних рідинах; 2) тестування супернатанів гібридом на Fc-фрагменти імуноглобулінів людини того класу, до якого мають дути спрямовані МКАТ, а також на імуноглобуліни інших класів; 3) визначення титру МКАТ у культуральній рідині, їх афінності та ізотипу; 4) проведення епітопного картування МКАТ. Запропонований спосіб дає можливість відбирати клони гібридом із такими властивостями (активність, специфічність, афінність, епітопна приналежність, ізотип), які заздалегідь мають практичну цінність, зокрема, дозволяють розробляти високоспецифічні та чутливі методи імуноаналізу. Приклад 1. Визначення активності анти-IgA моноклональних антитіл у непрямому імуноферментному аналізі (ІФА) Сорбцію IgA і Fc-фрагментів IgA проводили у 0,05 М карбонат-бікарбонатному буфері (рН 9,6) протягом ночі при 4 °C в концентрації 5 і 2,5 мкг/мл, відповідно. Для відмивання використовували фосфатно-сольовий буфер з додаванням 0,05 % твін-20 (ФСБТ), рН 7,2-7,4. Планшет інкубували 1 годину при 37 °C і потім відмивали. Для виявлення зв'язаних антитіл використовували кон'югат козячих антитіл до імуноглобулінів миші з пероксидазою хрону (ПХ), який інкубували 1 годину при кімнатній температурі. Планшет тричі відмивали ФСБТ і один раз водою. Як субстрат використовували 0,003 % розчин перекису водню в 0,15 М цитратному буфері, рН 5,0, а як хромоген - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин. Реакцію зупиняли 2 М сірчаною кислотою. Оптичну густину при довжині хвиль 492 нм і 630 нм вимірювали на спектрофотометрі. Активність МКАТ оцінювали за величиною оптичної густини. Приклад 2. Визначення афінності анти-IgG моноклональних антитіл -9 Константу афінності МКАТ визначали методом інгібування [7]. Різні концентрації IgG (від 10 -6 до 10 моль/л) змішували із зразками культуральних рідин, що містять МКАТ. Інкубовані зразки (1 год. при 37 °C) переносили в 96-лунковий планшет, попередньо сенсибілізований IgG людини. Далі проводили непрямий ІФА. Як контроль використовували зразки культуральних рідин, що попередньо не інкубували з IgG. Приклад 3. Визначення ізотопу моноклональних антитіл Ізотип моноклональних антитіл визначали із використанням стандартного набору для ізотипування ISO-2 ("Sigma", США). Ізотипування проводили за допомогою антигенопосередкованого ІФА. Для цього в планшет сенсибілізований IgM людини вносили культуральні рідини гібридом у шести повторностях. Ізотип визначали за допомогою моноспецифічних козячих сироваток. Типуючі антитіла виявляли антикозячим пероксидазним 1 UA 69270 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 кон'югатом ("Sigma", США). Облік результатів проводили відповідно до рекомендацій виробника. Приклад 4. Визначення епітопної специфічності МКАТ Для встановлення епітопної специфічності МКАТ використовували конкурентний ІФА. IgM людини сорбували в 0,05 М карбонат-бікарбонатному буфері в концентрації 5 мкг/мл на 96лункові планшети для ІФА. Планшет інкубували протягом ночі при 4 °C та потім двічі відмивали ФСБТ. У всі лунки планшета вносили досліджуваний пероксидазний кон'югат МКАТ. Після чого в лунки різних рядів для конкуренції вносили МКАТ інших клонів у різних концентраціях: починали із 0,4 мг/мл та кожний наступний раз розводили вдвічі. Як контроль використовували різницю значення оптичної густини кон'югату МКАТ та оптичної густини аналізу при конкуренції однойменних МКАТ. Подальшу процедуру проводили як і для непрямого ІФА (Приклад 1). Результати конкуруючого ефекту розраховувались як відсоток зниження активності кон'югату МКАТ у присутності конкуруючого антитіла. У такому варіанті постановки конкурентного ІФА повне (75-100 %) або часткове (25-75 %) зниження активності є показником повної або часткової подібності епітопної специфічності досліджуваних моноклональних антитіл. Натомість порівняна (0-25 %) із контрольної активність кон'югату МКАТ вказувала на різну із конкуруючим антитілом епітопну специфічність. Приклад 5. Використання кон'югатів анти-IgM МКАТ, спрямованих до епітопу А, з пероксидазою хрону у складі імуноферментних наборів. У лунки 96-лункового полістеролового планшету, що сенсибілізовані рекомбінантними антигенами вірусу Епштейна-Барр вносили по 40 мкл досліджувані сироватки крові людини, позитивний та негативний контролі й по 80 мкл розчин для їх розведення. Планшет інкубували при 37 °C упродовж 1 години та відмивали фосфатно-сольовим буфером з детергентом (ФСБД) 4 рази. Розчин кон'югату моноклональних антитіл вносили по 100 мкл в лунку, інкубували при 37 °C протягом 30 хвилин та відмивали ФСБТ 6 разів. Далі в лунки вносили по 100 мкл розчину хромогену (3,3',5,5'-тетраметилбензидину) та інкубували при 18-25 °C в темному місті протягом 30 хвилин, після чого реакцію зупиняли внесенням у всі лунки по 100 мкл 0,5 М сірчаної кислоти. Через 5 хвилин після зупинення реакції визначали оптичну густину при 450 нм / 620 нм. Розраховували рівень граничного значення (ГЗ) додаючи до середнього значення оптичної густини негативного контролю величину 0,2. Для кожного досліджуваного зразка сироватки крові людини розрахувати індекс позитивності (ІП) шляхом ділення значення оптичної густини відповідного зразка на ГЗ. Досліджувані зразки із значенням ІП рівним та вище 1,0 вважати позитивними на відповідний серологічний маркер, а зразки із значенням ІП нижче 1,0 вважати негативними. Джерела інформації: 1. Климович В. Б., Самойловим М. П., Крутецкая И. Ю. и др. Моноклональные антитела к подласам IgG человека: получение и исследование специфичности // Иммунология.-1998. № 3. - С. 27-31. 2. Климович В.Б., Самойловим М.П., Крутецкая И.Ю. и др. Моноклональные антитела к подласам IgG человека: эпитопная специфичность и применение в иммуноанализе // Иммунология.-1998. - №3. -С.31-34. 3. Reimer С. В., Phillips D. J., Aloisio C. H. et al. Evaluation of thirty-one mouse monoclonal antibodies to human IgG epitopes // Hybridoma.-1984. -Vol.3, 3.-P. 263-275. 4. Оловникова Н. И., Белкина Е. В., Митерев Г. Ю. и др. Моноклональные антитела к иммуноглобулинам человека: возможность их использования в антиглобулиновом тесте // Гематология и трансфузиология.-2003. - № 6. - С. 9-13. 5. Jefferisa R., Reimerb С. В., Skvarilc F. et al. Evaluation of monoclonal antibodies having specificity for human IgG subclasses: results of the 2nd IUIS/WHO collaborative study // Immunology Letters.-1992. - Vol. 31, 2. - P. 143-168. 7 6. Патент на корисну модель 20311 UA, МПК C12N 5/00. Схема імунізації для отримання моноклональних антитіл проти імуноглобулінів людини / Ніколаєнко І. В., Галкін О. Ю.; Ніколаєнко І. В., Галкін О. Ю. - № u 2006 08421; Заявл. 27.07.2006; Опубл. 15.01.2007. 7. Кулаков А. В., Климова С. В., Ярилин Д. А. и др. Изучение аффинности естественных антител сыворотки крови человека к компоненту клеточной стенки бактерий глюкозамилмурамилдипептиду, обладающей адъювантной активностью // Иммунология.-1997. № 1. - С. 21-24. 2 UA 69270 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Спосіб отримання та відбору антивидових моноклональних антитіл, що дає можливість відбирати клони гібридом із такими активністю, специфічністю, афінністю, епітопною приналежністю та ізотипом, який відрізняється тим, щопередбачає: двоетапне тестування гібридом на наявність МКАТ заданої специфічності у культуральних рідинах; тестування супернатанів гібридом на Fc-фрагменти імуноглобулінів людини того класу, до якого мають бути спрямовані МКАТ, а також на імуноглобуліни інших класів; визначення титру МКАТ у культуральній рідині, їх афінності та ізотипу; проведення епітопного картування МКАТ. 10 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3