Набір моноклональних антитіл а3, а5, а8, специфічних до імуноглобулінів людини класу а, придатних до використання у імуноферментному аналізі

УКРАЇНА (19) UA (11) 16038 (13) U (51) МПК (2006) C12N 5/00 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС ДО ДЕКЛАРАЦІЙНОГО ПАТЕНТУ НА КОРИСНУ МОДЕЛЬ видається під відповідальність власника патенту (54) НАБІР МОНОКЛОНАЛЬНИХ АНТИТІЛ А3, А5, А8, СПЕЦИФІЧНИХ ДО ІМУНОГЛОБУЛІНІВ ЛЮДИНИ КЛАСУ А, ПРИДАТНИХ ДО ВИКОРИСТАННЯ У ІМУНОФЕРМЕНТНОМУ АНАЛІЗІ 1 2 Характеристика моноклональних антитіл Назва МКАТ A3 А5 А8 Ізотип антитіл IgG1 IgG1 IgG1 Константа афінності, х1010 моль/л 0,9 1,0 1,1 Титр антитіл у культуральній рідині* 1:800 1:1000 1:1000 *тестування у непрямому твердофазному ІФА на IgA людини (сорбція 2 мкг/мл) Приклад 1. Виділення МКАТ із асцитичної рідини та їх переведення у фосфатний буфер Розморожували асцитичну рідину із вмістом моноклональних антитіл та переносили її у центрифужну пробірку на 15мл. Пробірку поміщали у нагріту до 45-50°С воду на 5 хвилин. Зважували сульфат натрію в кількості, потрібній для 18%-го насичення (вага на об'єм) асцитичної ріди ни, всипали у пробірку з асцитом та старанно струшували до розчинення сульфату натрію. Спостерігали помутніння, зумовлене випадінням в осад МКАТ. Пробірку центрифугували при 10000об./хв. впродовж 5 хвилин у кутовому роторі. Після чого надосад видаляли, а осад антитіл розводили у 5мл деіонізованої води. Пробірку поміщали у нагріту до 45-50°С воду на 5 хвилин. (13) 16038 Таблиця (11) Найбільш близьким до запропонованих є моноклональні антитіла, які взаємодіють із IgA людини [2]. У порівнянні із вищезгаданим антитілами клони A3, А5, А8 характеризуються більшою специфічністю та активністю у непрямому імуноферментному аналізі. Моноклональні антитіла продукуються гібридними клітинами, що одержані при злитті мієломних мишачих клітин Sp 2/0 та спленоцитів мишей лінії Balb/c. Клони МКАТ A3, А5, А8 характеризуються наступними ознаками (таблиця). UA Корисна модель стосується імунохімії та гібридомної технології і може бути використаний для одержання моноклональних антитіл (МКАТ) до імуноглобулінів людини класу А та їхніх імуноферментних кон'югатів. Метою корисної моделі є одержання нових моноклональних антитіл до IgA людини, придатних для використання у імуноферментному аналізі (ІФА). Відомі МКАТ до імуноглобулінів людини класу М [1]. Проте згадані моноклональні антитіла використовуються у реакції імунофлуоресценції та непридатні для використання у імуноферментних тест-системах для серологічної діагностики. U (57) Набір моноклональних антитіл A3, А5, А8, специфічних до імуноглобулінів людини класу А, придатних до використання у імуноферментному аналізі, який характеризується тим, що моноклональні антитіла набору мають високі константу афінності, титр у культуральній рідині та титр пероксидазного кон'югату. (19) (21) u200601613 (22) 16.02.2006 (24) 17.07.2006 (46) 17.07.2006, Бюл. № 7, 2006 р. (73) ТОВАРИСТВО З ОБМЕЖЕНОЮ ВІДПОВІДАЛЬНІСТЮ "НАУКОВО-ВИРОБНИЧА КОМПАНІЯ "ВІТРОТЕСТ" 3 16038 4 Знову зважували сульфат натрію у кількості, протягом 2 годин при кімнатній температурі. Одепотрібній для 16%-го насичення (вага на об'єм) ржаний таким чином розчин активованої пероксирозчину антитіл, всипали у пробірку та старанно дази додавали до розчину антитіл, які попередньо струшували до розчинення сульфату натрію. Сподіалізували проти 0,1М карбонатного розчину, стерігали помутніння, зумовлене випадінням антирН9,2. Суміш переносили у герметичну хроматогтіл в осад. Пробірку центрифугували при 10000 рафічну колонку та додавали 1/3 частину сухого об./хв. впродовж 5 хвилин у кутовому роторі. Після сефадексу G25, інкубували протягом 3 годин при чого надосад видаляли, а осад антитіл розводили кімнатній температурі. у 2-3мл деіонізованої води. По закінченні інкубації, розчин кон'югату елюОдержаний розчин МКАТ фільтрували через ювали з колонки та зупиняли реакцію додаванням фільтри з порами 0,45мкм. 1/20 об'ємні частини водного розчину NaBH4 Для переведення МКАТ у фосфатний буфер (5мг/мл), залишаючи на 30хв. при кімнатній темпевикористовували 0,02М фосфатний буфер (рН7,2ратурі. Після цього ще додавали 3/20 частини роз7,4) та колонку 1,5х20см з сефадексом G-25 зрівчину боргідриду натрію, інкубували протягом 60 хв. новажену фосфатним буфером. МКАТ, одержані Одержаний розчин пероксидазного кон'югату раніше, в об'ємі 2-3мл наносили на гель, після МКАТ переводили у 0,02М фосфатний буфер з поглинання розчину гелем наносили такий же 0,15М NaCI шляхом діалізу. об'єм буферу. Після поглинання гелем буферу Перелік літературних джерел: колонку заповнювали фосфатним буфером дове1. Kurth В., Weston C., Reddi P. et al. Oviductal рху, вставляли адаптер та проводять елюцію фоantibody response to a defined recombinant sperm сфатним буфером із швидкістю 2мл/хв. Вихід піку antigen in macques // Biol. Reproduct. - 1997. - Vol. реєстрували при 280нм. Збирали фракцію МКАТ в 57. - P.981 - 989. окремий флакон, додавали 1% 10%-ого азиду на2. Miller L., Izzo М., Wemett D. et al. Increased трію та зберігали при плюс 4°С до 6 місяців. plasma IgA, sIgA, and C3- and IgA-containing Приклад 2. Спосіб одержання кон'югат монокimmune complexes with renal glomerular deposits in лональних антитіл з пероксидазою хрону , diabetic rats // Diabetes. - 1988. - Vol. 37, 2. - P.185Кон'югацію МКАТ з пероксидазою хрону здійс193. нювали у співвідношенні антитіл до ферменту 2:1 3. Tijssen P. Preparation of enzyme-antibody or (масові долі) методом періодатного окислення за enzyme-macromolecule conjugates // Laboratory Р. Tijssen [3] із власними модифікаціями. techiques in biochemistry and molecular biology: При окисленні пероксидазу хрону розчиняли у practice and theory of enzyme immunoassays / 0,1М бікарбонатному буфері, рН8,3, до концентраEditors R.H. Burdon, P.H. van Knippenberg. ції 15мг/мл та додавали такий же об'єм 14мМ водAmsterdam: Elsevier, 1985. - P.221-241. ного розчину періодату натрію. Суміш інкубували Комп’ютерна верстка В. Мацело Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601